Belegarbeit 5. Praxismodul

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1 Berufsakademie Dresden LfULG Abt. 9 Referat 91 Studienrichtung Agrarmanagement Am Park Köllitsch Belegarbeit 5. Praxismodul Thema: Untersuchungen zum Haptoglobinnachweis mittels dem Analysegerät eprocheck in der Milch von Holstein-Friesian Kühen Themengebiet: Milchviehhaltung eingereicht von: Frau Constance Nagler Geboren am: Seminargruppe: BA09AM1 Bewertungsvorschlag Unternehmen: Kriterium Mögliche Punktzahl Erreichte Punktzahl Lösung der Aufgabe Erreichung der Zielsetzung 055 Selbstständigkeit und Systematik 015 Eigeninitiative, Zeitaufwand 010 Sorgfalt der Bearbeitung 010 Sorgfalt der Ausarbeitung 010 Summe 100 Bemerkungen: Betreuer:... Unterschrift:...Datum:... Name Notenvorschlag*:... * Der Notenschlüssel ist im Internet unter in der Rubrik Service, Dokumente, Dokumente für Gutachter (Empfehlung zur Bewertung von Studien und Diplomarbeiten) zu finden

2 Inhaltsverzeichnis 1 Anlass und Zielsetzung der Arbeit Funktionsweise des Immunsystems Angeborene und adaptive Immunität Bestandteile des Immunsystems Entzündungsvorgang Akute-Phase-Reaktion Haptoglobin Zellen in der Milch Material und Methoden Tiermaterial Milchproben eprocheck Sandwich-ELISA Statistische Auswertung Ergebnisse Überblick Hp-Konzentrationen in der Milch Wiederholbarkeit des Verfahrens Nachweisbarkeit von Hp in Viertel- und Sammelproben Korrelation zwischen SCC und Hp in SP Betrachtung von Einzeltierbeispielen Tier Tier Tier Diskussion Zusammenfassung und Ausblick Literatur Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anlagenverzeichnis Anlagen Übersicht Einzeltiere Hp-Konzentrationen Tier

3 12.3 Hp-Konzentrationen Tier Hp-Konzentrationen Tier

4 Abkürzungsverzeichnis aktlakt aktmt APP BCS HL Hp HR ID LCS Mes MW SCC SP VL VP VR aktuelle Laktation aktueller Melktag Akute-Phase-Proteine Body-Condition-Score Euterviertel hinten links Haptoglobin Euterviertel hinten rechts Identifikationsziffer Locomotion-Score Messung(en) Mittelwert Somatic-Cell-Count Sammelgemelksprobe Euterviertel vorn links Viertelgemelksprobe Euterviertel vorn rechts 3

5 1 Anlass und Zielsetzung der Arbeit Im Rahmen des Projektes Entwicklung und Nutzung neuer On Farm Verfahren zur Leistungsprüfung auf Gesundheitsstabilität und Fruchtbarkeit beim Deutsch Holstein (On Farm Recording) wird beabsichtig, neue innovative Verfahren für die Leistungsprüfung beim Deutschen Holstein in den Merkmalskomplexen Fruchtbarkeit und Gesundheit zu erschließen. Diese Merkmalskomplexe sollen auf den Zuchtbetrieben (On Farm) erfasst und in die IT Infrastruktur des Herdenmanagements integriert werden können. Ein Ziel des Projektes ist die Ermittlung und züchterische Nutzung von Parametern der Gesundheitsstabilität auf der Grundlage einer teilautomatisierten Bestimmung von immunologischen Parametern in der Milch. Die Möglichkeit der Verwendung von verschiedenen immunologischen Parametern für diagnostische Zwecke des allgemeinen Gesundheitsstatus der Kuh oder lokaler Erkrankungen ist in mehreren Studien (HISS et al. 2004; ECKERSALL et al. 2006; LAI et al. 2009) belegt. Dafür bietet sich die Bestimmung des Akute Phase Proteins Haptoglobin an, welches im Zuge des Projektes ausgewählt wurde. Nach HISS et al. kann eine erhöhte Konzentration von Haptoglobin in der Milch binnen drei Stunden nach einer Infektion nachgewiesen werden. Diese Arbeit befasst sich mit der Erschließung des Entzündungsparameters Haptoglobin in der Milch. Für den Nachweis der Haptoglobin Konzentrationen in der Milch wird das Analysegerät eproceck (Stallgerät) der Firma FrimTec GmbH genutzt. Der bei diesem Gerät hinterlegte ELISA Test wurde für die Messung der Haptoglobinkonzentration neu entwickelt. Ziel dabei ist es, Aufschluss über das Verfahren der Milchprobenverarbeitung zu geben, ob viertelgenaue Proben nötig sind oder ob Sammelmischproben dafür ausreichend sind. Folglich sollen die Ergebnisse als Grundlage für die Erstellung des Versuchsplanes des Projektes genutzt werden. 4

6 2 Funktionsweise des Immunsystems 2.1 Angeborene und adaptive Immunität Der Organismus eines jeden Säugetieres besitzt eine angeborene und eine sogenannte adaptive bzw. erworbene Immunität gegen verschiedenste Pathogene. Den entscheidenden Anteil für die Immunreaktion bei der angeborenen Immunität bilden sogenannte phagozytische Zellen. Diese können ihnen unbekannte, zahlreiche verschiedene Pathogene aufnehmen und vernichten. Dazu zählen insbesondere die Makrophagen und Granulozyten. 1 Reagiert der Organismus mit der Produktion von Antikörpern auf ein spezifisches Pathogen, handelt es sich um eine adaptive Immunantwort. Diese basiert auf Lymphozyten und gegen eine erneute Infektion mit genau demselben Pathogen ist der Organismus zu meist mit einer lebenslangen Immunität gerüstet. 2 Beide Immunreaktionen basieren auf den Reaktionen von Leukozyten, den weißen Blutzellen. So bilden die angeborene und die adaptive Immunität gemeinsam ein wirksames Abwehrsystem gegen eine ganze Reihe verschiedenster Pathogene. Infektionen, die von der angeborenen Immunität nicht beseitigt werden können, aktivieren die adaptive Immunität Bestandteile des Immunsystems Ihren Ursprung haben alle Zellen des Immunsystems in hämatopoetischen Stammzellen, sogenannten Vorläuferzellen im Knochenmark. Diese pluripotenten Zellen teilen sich und erzeugen zwei spezialisierte Typen von Stammzellen. Zum einem eine gemeinsame lymphatische Vorläuferzelle, aus der sich T- und B Lymphozyten bilden. Und zum anderen, eine gemeinsame myeloide Vorläuferzelle aus der u.a. die verschiedenen Typen der Leukozyten (z.b. Granulozyten, Makrophagen, dendritische Zellen) hervorgehen. Über das Blut und das lymphatische System zirkulieren diese Zellen im Organismus und überwachen die peripheren Gewebe. Lymphozyten, die bei der adaptiven Immunreaktion gebildet werden, können in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden, in B-Lymphozyten und T-Lymphozyten. Durch die 1 vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite 2 2 vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite 2 3 vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite 2 5

7 Aktivierung von B-Lymphozyten, die im Knochenmark reifen, differenzieren diese zu Plasmazellen, setzen anschließend Antikörper frei und aktivieren T-Lymphozyten. Vom Blut in periphere oder sekundäre, lymphatische Organe wandern gereifte Lymphozyten fortwährend und kehren über Lymphgefäße in den Blutkreislauf zurück. Ihre Fähigkeit, gegen fremde Antigene eine spezifische Immunantwort zu entwickeln, ist ein besonderes Merkmal. Durch eine patrouillierende T-Lymphozyte, die ein spezifisches Antigen an der Oberfläche einer dendritischen Zelle erkennt, werden die meisten adaptiven Immunantworten ausgelöst. 4 Granulozyten, die eine Komponente der angeborenen Immunreaktion darstellen, entstehen während einer Immunantwort und sind vergleichsweise kurzlebig. 5 Bis sie aktiviert werden, zirkulieren sie im Blut, um dann als Effektorzellen an Infektions- und Entzündungsherden im Gewebe zu agieren. 6 Die wichtigste und umfangreichste zelluläre Komponente der angeborenen Immunantwort bildet dabei die zu den Granulozyten zählenden neutrophilen Zellen. An einem Entzündungs- oder Infektionsherd werden sie von Makrophagen dazu aktiviert, Bakterien durch Phagozytose aufzunehmen. 7 Makrophagen lösen im Gewebe Entzündungen aus, indem sie Bakterien durch Phagozytose aufnehmen und anschließend im Blut neutrophile Zellen aktivieren. Über das Blut wandern unreife dendritische Zellen in periphere Gewebe ein, wo sie Antigene aufnehmen. Infolgedessen reifen diese Zellen zu antigenpräsentierenten Zellen und wandern in das Lymphgewebe. Dort treten sie in Wechselwirkung mit den Lymphozyten und aktivieren diese. Makrophagen und neutrophile Zellen sind eine erste Verteidigung des Organismus gegen viele Mikroorganismen und für die Bekämpfung häufiger bakterieller Infektionen von großer Bedeutung. Da nicht immer alle infektiöse Organismen beseitigt werden können und auch Erreger vorkommen, die nicht erkannt werden können, dienen die B-Lymphozyten und T-Lymphozyten des adaptiven Immunsystems als flexiblerer Abwehrmechanismus. 8 4 vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite 12 7 vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite 12 6

8 2.3 Entzündungsvorgang Bei einer Entzündung kommt es zur Erweiterung und erhöhten Durchlässigkeit der Blutgefäße, wodurch ein stärkerer Blutfluss und ein Austreten von Flüssigkeit entsteht, die dann zu einer Rötung, Schwellung und Erwärmung führen. Die neutrophilen Zellen sind die prävalenten Zellen während der ersten Phase einer Entzündungsreaktion. Sie nehmen die eindringenden Mikroorganismen auf und zerstören diese. Monozyten erreichen aus der Blutbahn kommend kurz nach den Neutrophilen den Entzündungsherd und differenzieren im Gewebe zu Makrophagen. Aus diesen Gründen, werden neutrophile Zellen und Makrophagen auch als Entzündungszellen bezeichnet. Ausgelöst wird der Entzündungsvorgang von Cytokinen und Chemokinen, die zuvor von Makrophagen als Reaktion auf bakterielle Bestandteile freigesetzt werden. 9 Für die Erhöhung der Körpertemperatur sind die durch Makrophagen und neutrophile Zellen freigesetzten Cytokine TNF-α, IL-1 und IL-6 verantwortlich. Sie lösen Fieber aus, was im Allgemeinen der Immunabwehr nützt, da adaptive Immunantworten bei höheren Temperaturen intensiver sind. Eine weitere Wirkung der Cytokine ist das Auslösen der Akuten-Phase-Reaktion. 10 Gereifte dendritische Zellen aktivieren im Lymphsytem durch die Präsentation der Antigene die Lymphozyten. Jeder Lymphozyt trägt nur Antigenrezeptoren einer einzigen Spezifität. Aber die Spezifitäten der einzelnen Lymphozyten unterscheiden untereinander. So kann jeder einzelne Krankheitserreger spezifisch angegriffen und eliminiert werden Akute-Phase-Reaktion Aufgrund der Wirkung von Cytokinen auf die Leberzellen verändern sich die in das Blutplasma abgegebenen Proteine. Dabei sinkt die Konzentration bei einigen Plasmaproteinen ab, während bei anderen der Spiegel in wenigen Stunden (HISS et al. 2004) deutlich steigt. Folglich werden diese Proteine auch als Akute-Phase- Proteine (APP) bezeichnet, weil deren Synthese durch die Cytokine TNF-α, IL-1 und IL-6 angeregt wird vgl. JANEWAY et al. (2002): Seiten vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite vgl. JANEWAY et al. (2002): Seite 84 7

9 Diese Reaktion zählt zur angeborenen Immunabwehr gegen jegliche Pathogene. Die APP lassen sich in mehrere Gruppen unterteilen: Gerinnungsfaktoren, Komplementfaktoren, Kallikrein Kinin System, Proteinaseinhibitoren, Opsonine und Transporter. Zur Gruppe der Transporter zählt unter anderem Haptoglobin, das als Radikalfänger und Hämoglobinbinder fungiert. 13 Infektionen, Entzündungen, Traumata und Tumorbildungen können mittels APP angezeigt werden. Es sind besonders sensible Indikatoren für Entzündungen, die den ganzen Körper betreffen. Dessen Sekretionsmuster sind artspezifisch. Serum Amyloid A und Haptoglobin werden oft kombiniert in den meisten Messungen von APP genutzt, um bei Rindern in Versuchen Entzündungsvorgänge im Organismus nachzuweisen Haptoglobin Haptoglobin (Hp) ist ein APP, welches auf Entzündungen und Infektionen reagiert. 15 Es gehört zu der Gruppe der Transportproteine und kann freies Hämoglobin binden. Der gebildete Haptoglobin Hämoglobin-Komplex wird aus der Blutzirkulation über das retikuläre Bindegewebe oder über die Leber eliminiert. 16 Die Bindung des bei einer exzessiven Hämolyse freigesetzten Hämoglobin zählt zu den Hauptaufgaben von Hp. Des Weiteren beseitigt es die vom Hämoglobin freigesetzten freien Radikale während oxidativen Stresses. Bovines Hp ist eines der am sensibelsten reagierenden APP während einer bakteriologischen Infektion, obwohl es nur eingeschränkt im Plasma zur Verfügung steht. Verschiedene Studien (HISS et al. 2004; ECKERSALL et al. 2006; LAI et al. 2009) zeigen, dass die Hp Konzentration im Plasma und in der Milch während einer Mastitis drastisch ansteigt. Nach ca. drei Stunden einer Infektion, ist die Konzentration in der Milch schon bis zu 35fach höher gegenüber der Ausgangssituation. Innerhalb von 12 Stunden nach einer Infektion kann die Konzentration bis zum 160fachen ansteigen. 17 Im Zuge der Akuten Phase Reaktion gelangt Hp über die Leukozyten direkt aus dem Blut- und Lymphsystem nach dem Überwinden der Milch Blut-Barriere in die Milch. 18 Die Synthese des Hp findet anschließend in der Milchdrüse statt. Hohe Hp 13 vgl. SCHÜTT et al. (2011): Seiten vgl. KUJALA, M. (2010): Seite 1 15 vgl. LAI et al. (2009): Seite 1 16 vgl. RENZ, H. (2009): Seite vgl. LAI et al. (2009): Seite 1 18 vgl. SAUERWEIN, MÜLLER (2005): Seite 20 8

10 Konzentrationen gehen einher mit einem hohen Vorkommen an neutrophilen Zellen. Bei einer Mastitiserkrankung wurden besonders in den Epithelzellen hohe Konzentrationen von Hp lokalisiert. Es wird angenommen, dass Epithelzellen des Euters die Fähigkeit besitzen, Hp endogen zu synthetisieren und in die Alveolen auszuscheiden. Weiterhin wird beschrieben, dass Plasma-Hp hepatischen Ursprungs direkt in die Epithelzellen eintritt und von dort in die Alveolen ausgeschieden wird. Als vierter möglicher Weg, wird durch LAI et al. (2009) die passive Diffusion von Hp aus dem Blutplasma über das vaskuläre System des Euters angenommen. Für die Unterscheidung zwischen gesunden und subklinisch erkrankten Eutervierteln wird von LAI et al. einen Grenzwert von 0,23 µg / ml Magermilch angegeben Zellen in der Milch Die Anzahl der somatischen Zellen und deren Differenzialbild werden in gesunden Drüsenkomplexen von physiologischen Einflussgrößen wie Rasse und Laktationsstadium bestimmt. In Abhängigkeit der Eutergesundheit setzt sich die Zellzahl aus Gewebszellen (Epithelzellen) und Immunzellen (Makrophagen, Lymphozyten, neutrophile Granulozyten) zusammen. Im gesunden Euter sind Makrophagen die dominierenden Zellen, ihr Anteil beträgt ca. 58 %. Neutrophile Granulozyten machen einen Anteil von etwa % aus, dabei steigt deren Anteil zum Ende der Laktation, der von Lymphozyten sinkt. Dabei bestimmt die Gesamtzahl und Aktivität der Leukozytenpopulation die Art und Dauer intramammärer Infektionen. Der Anteil an abgestoßenen Epithelzellen beträgt im gesunden Euter 2 %. Rückschlüsse auf den Gesundheitszustand der Milchdrüse und auf die Dauer der Infektion lässt die Differenzierung der Milchzellen zu. 20 Bei einer Infektion mit Pathogenen verändert sich die Zusammensetzung der Zellen in der Milch erheblich, wie das beispielsweise bei einer klinischen oder subklinischen Mastitis der Fall ist. 19 vgl. LAI et al. (2009): Seite vgl. WINTER, P. (2010): Seite 21 9

11 In Tabelle 1 wird ersichtlich, dass insbesondere der Anteil neutrophiler Granulozyten mit steigender Zellzahl zunimmt. Wie in Abschnitt 2.3 beschrieben, sind neutrophile Granulozyten prävalente Zellen während der ersten Phase einer Entzündungsreaktion, was deren starker Anstieg begründet. Zellen Verteilung in % SCC Gesunde Milch Mastitismilch < /ml /ml > /ml Neutrophile Granulozyten Lymphozyten Makrophagen Epithelzellen Tabelle 1- Milchzellen in Milch und Mastitismilch - Quelle: WINTER, P. (2010) Aus biologischer Sicht, liegt die Bedeutung der somatischen Zellen in der Beteiligung an der Infektabwehr des Euters. Mit steigender Zellzahl steigt die Wahrscheinlichkeit einer immunologischen Reaktion des Organismus. 21 Von verschiedenen Autoren (ECKERSALL et al. 2006; LAI et al. 2009, WINTER 2010) wird eine Grenze von < Zellen / ml Milch für als gesund geltende Euter angegeben. 4 Material und Methoden 4.1 Tiermaterial Für die Beprobung werden 19 laktierende Holstein Friesian Kühe gezielt ausgewählt. Die Tiere befinden sich zwischen dem 43. und 214. Melktag (m = 143). Das Laktationsstadium (m = 1,9) reicht von der ersten Laktation (n = 8) bis zur sechsten Laktation (zweite Laktation n = 7; dritte Laktation n = 3, sechste Laktation n = 1) und die durchschnittliche Herdenleistung liegt bei kg Milch je Kuh und von / Jahr. Der somatische Zellgehalt der Milch beträgt im Mittel /ml und variiert von bis / ml. Zunächst werden die Tiere in 4 Gruppen anhand ihres Zellgehaltes in der Milch eingeteilt, die sich wie folgt in Tabelle 2 untergliedern: Zellgehalt der Milch je ml Anteil < bis > n Tiere in % 47,4 21,1 21,1 10,5 Tabelle 2 - Gruppeneinteilung 21 vgl. WOLTER, W. et al. (2001): Seite 13 10

12 Weiterhin wird zeitnah an den Tieren eine Monitoring durchgeführt, bei dem der Bodyconditionscore (BCS), der Locomotionscore (LCS) und der Gesamteindruck des Einzeltieres eingeschätzt wird. BCS und LCS sind im Einzelnen in Anlage 1 auf Seite 28 aufgeführt. 4.2 Milchproben Die Vollmilchproben werden zur gewöhnlichen Melkzeit im Fischgrätenmelkstand viertelgenau je Tier genommen. Zunächst werden je 2 Strahlen pro Viertel vorgemolken und verworfen. Anschließend werden ca. 8 ml Vorgemelk je Viertel abgemolken Direkt im Anschluss des Melkens werden die Proben aufbereitet. Aus den Viertelgemelksproben (VP) pro Tier werden je 1 ml entnommen und in vier SP zu je 0,25 ml in Eppendorf-Reaktionsgefäßen gepoolt, sodass eine Sammelgemelksprobe (SP) insgesamt 1 ml ergibt. Im Anschluss werden pro VP je vier Rückstellproben à 1,5 ml hergestellt. Insgesamt stehen 372 Rückstellproben für die 19 Tiere zur Verfügung, davon sind 296 VP und 76 SP. Von der Aufbereitung bis hin zur Analyse der Proben lagen bis zu 24 Stunden. Zwischengelagert werden die zu analysierenden Rückstellproben in einer Kühlung mit konstanten 4 C. Die übrigen Rückstellproben werden bei -20 C gelagert. Mittels dem On-Farm Gerät eprocheck wird je Tier eine Rückstellprobe von jedem einzelnen Viertel und die SP auf die Haptoglobinkonzentration analysiert. Dafür wurden von den einzelnen Rückstellproben je 50 µl Milch in dafür vorgesehene Well zu je 2 Messungen pipettiert. Gleichzeitig können so Proben von 2 Tieren analysiert werden. 4.3 eprocheck Der eprocheck ist ein Analysegerät, das vor allem zum Progesteronnachweis eingesetzt wird. Im Zuge des Projektes wird das Gerät zur Erstellung von Progesteronprofilen der Kühe genutzt. Für die Messung der Haptoglobinkonzentration in den Milchproben wurde ein für diese Messung entwickelter Sandwich-ELISA verwendet. Dazu wurde ein Labor ELISA auf das Gerät angepasst. Gleichzeitig können 22 Einzelproben analysiert werden. Das Verfahren dauert ca. 70 Minuten, das Gerät liefert folglich sofortige auswertbare Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in einer Access-Datenbank zusammengefasst und anschließend statistisch ausgewertet. 11

13 4.4 Sandwich-ELISA Der ELISA-Test (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) dient zum Nachweis bestimmter Moleküle, hauptsächlich Proteine, mittels einer empfindlichen immunologischen Methode. Dabei werden die Mechanismen des Immunsystems genutzt, hier ist die Antikörper-Antigen-Reaktion von Bedeutung. Für den Nachweis eines bestimmten Proteins (Antigen) müssen die passenden Antikörper vorhanden sein, die in einem vorherigen gentechnischen oder zellulären Verfahren hergestellt werden. Wenn ein Protein in der Probe vorhanden ist, binden sich die aufgebrachten Antikörper an dem Protein und dies führt zu einer messbaren Farbveränderung. Bei einem Sandwich-ELISA wird der primäre Antikörper (Ab1) auf eine spezielle Oberfläche in einer Mikrotiterplatte (BSA) gebunden (Abbildung 1). Die zu messenden Proben werden in die Wells gegeben. Daraufhin kommt es in der Inkubationsphase zu einer Bindung zwischen dem Ab1 und dem in der Probe befindlichen Antigenen. Im vierten Schritt wird der sekundäre Antikörper (Ab2-POD) zugegeben, welcher an ein Enzym (POD: Peroxidase) gekoppelt ist. Auch dieser Antikörper bindet sich an die Antigene der Probe. Dadurch entsteht ein Antikörper- Antigen-Antikörper-Komplex, was auch zu der Bezeichnung Sandwich-ELISA führt. Abbildung 1 - Aufbau eines Sandwich-ELISA. Quelle: HOFMANN et. al. (2005) Nun wird ein zu dem Enzym passendes Substrat (z.b.: OPD ortho-phenylendiamin) zugegeben. Das Substrat wird im letzten Schritt des ELISA s als Raktionsprodukt des 12

14 Enzyms umgesetzt, was zu einer Farbveränderung (Abs at 492 nm) führt. Durch die Farbentwicklung und die verwendete Standardreihe können verschiedene Proben quantitativ oder qualitativ auf den Gehalt des gesuchten Proteins (Antigen), z.b. Haptoglobin, untersucht werden Statistische Auswertung Die gewonnen Daten zur Messung der Hp-Konzentration in den Milchproben werden durch die eprocheck-software in eine Access (Version 2003) Datenbank übertragen. Anschließend werden die Datensätze in ein Excel (Version 2003) Tabellenblatt eingepflegt. Daraufhin werden die Daten mittels Excel und SPSS (Version 17.0) aufbereitet und statistisch ausgewertet. Mit Excel werden aus den einzelnen Wiederholungspaaren Mittelwerte gebildet. Mittels des Varianzschätzers in SPSS wird anschließend die Wiederholbarkeit des Testes berechnet. Zudem wird die Korrelation nach PEARSON mit SPSS zwischen Zellgehalt der Milch und den gemittelten Sammelmischproben sowie den gemittelten Viertelproben berechnet. Außerdem wird die absolute Abweichung, die Spannweite, die Varianz (empirische Streuung), empirische Standardabweichung und der Variationskoeffizient mit Excel ermittelt. Weiterhin werden mittels Excel Diagramme für eine bessere Übersicht erstellt. 22 HOFMANN, W. (2005): Seite 1 13

15 5 Ergebnisse 5.1 Überblick Hp-Konzentrationen in der Milch Für die 19 verschiedenen Tiere ergeben sich insgesamt 197 Datensätze. In Tabelle 3 ist die Verteilung der gewonnenen Proben veranschaulicht. Je zwei Messungen pro Tier und Viertel gibt es, sodass insgesamt 148 Messungen zur Verfügung stehen. Zwei Tiere sind sogenannte Dreistriche, wodurch vier Messungen entfallen. Für die SP ergaben sich drei Messungen für 11 Proben und zwei Messungen für acht Proben. Sodass hier insgesamt 49 Messungen für SP in die Auswertung einbezogen werden können. Viertelproben (VP) Sammelmischproben (SP) n ges je 2 Messungen je 3 Messungen - 33 x min in µg 0,001 0,001 x max in µg 20,0 19,0 Ø 2,4 4,2 Tabelle 3 - Probenübersicht Die Hp-Konzentrationen variieren von x min = 0,001 bis x max = 20,0 µg / ml Milch in allen Messungen. Wobei der Wert x max durch die Software von eprocheck zu >200,0 µg / ml Milch herausgegeben wurde. Dabei handelt es sich um einen Fehler des Programms. Der Wert wurde deshalb auf 20,0 µg / ml Milch korrigiert. Dies ergibt eine Spannweite R von 19,999 µg bei allen Messungen und eine absolute Abweichung von 4,6 innerhalb der Messungen. Im Mittel liegt die Abweichung bei 0,35. Untereinander korrelieren die Messungen mit r = 0,995, was für eine stark positive Korrelation spricht. Zwischen den Messungen der Mittelwerte von VP und den dazugehörigen Mittelwerten der SP besteht ebenso eine stark positive Korrelation von r = 0,910. Auffällig sind insbesondere die Abweichungen (Abw) zwischen den je 3 Messungen (Mes) der SP in Tabelle 4, hier ergaben sich mitunter die größten Abweichungen. 14

16 Die Differenzen werden wie folgt berechnet: Abw1 = Mes1 Mes2 Abw2 = Mes2 Mes3 Abw3 = Mes1 Mes3 Im Bezug zur Mes1 ergaben sich stets die größten Differenzen. Mes2 und Mes3 hingegen, waren in 7 von 11 Fällen (63,6%) identisch, die größte Differenz betrug hier nur 0,8 µg. Diese Übersicht (Tabelle 4) soll die Genauigkeit des Verfahrens verdeutlichen, denn nur in wenigen Fällen bestehen hohe Abweichungen. Tier Mes1 Mes2 Mes3 Abw1 Abw2 Abw3 µg Hp / ml Milch 1 15,2 10,9 10,6 4,3 0,3 4,6 2 13,4 12,6 12,3 0,8 0,3 1,1 3 14,6 14,5 13,7 0,1 0,8 0,9 4 19,0 18,3 18,1 0,7 0,2 0,9 5 13,9 13,5 13,5 0,4 0,0 0,4 6 1,3 1,0 1,0 0,3 0,0 0,3 7 0,2 0,0 0,0 0,2 0,0 0,2 8 1,3 1,2 1,2 0,1 0,0 0,1 9 0,8 0,7 0,7 0,1 0,0 0,1 10 1,0 0,9 0,9 0,1 0,0 0,1 11 0,5 0,4 0,4 0,1 0,0 0,1 Tabelle 4 - Vergleich der je 3 Messungen innerhalb der Sammelmischproben 15

17 5.2 Wiederholbarkeit des Verfahrens Um die Genauigkeit des Testverfahrens mit dem im eprocheck hinterlegen ELISA zu bestimmen, wurde die Wiederholbarkeit innerhalb der ersten und zweiten Messung berechnet. Die Berechnung der Wiederholbarkeit ergab 0,993. In Abbildung 2 lässt sich eine klare Wiederholbarkeit der Proben (n = 93 x 2) erkennen. Die Streuung nimmt bei steigender Hp-Konzentration insbesondere ab 5,1 µg / ml Milch zu. Der Anteil der Proben >5,1 µg Hp / ml Milch liegt bei 16,2 % (n = 15 x 2). Abbildung 2 - Vergleich der Messungen von Viertel- und Sammelproben 16

18 Wird der Bereich von < 5,1 µg Hp / ml Milch in Abbildung 3 näher betrachtet, zeigt sich eine noch deutlichere Konzentration der Messungen, besonders im Bereich < 2,0 µg Hp / ml Milch. Der Anteil der Proben von < 2,0 µg macht 73,1 % (n = 68 x 2) aller Proben aus. Auch hier ergibt sich erwartungsgemäß eine hohe Wiederholbarkeit von 0,959. Jedoch streuen auch hier die erhöhten Konzentrationen von Hp in der Milch, wie in Abbildung 2. Abbildung 3 - Vergleich der Messungen Viertel- und Sammelprobe < 5,1 µg Hp / Milch 5.3 Nachweisbarkeit von Hp in Viertel- und Sammelproben Einzelne Viertelproben zeigten in Mes1 und Mes2 deutlich erhöhte Hp- Konzentrationen (X min = 0,001 µg; x max = 20,0 µg). Aber auch in den SP schlugen die erhöhten Werte aus den einzelnen VP durch (X min = 0,001 µg; x max = 19,0 µg). gesund immunologische Reaktion Einteilung n <0,21 µg Hp /ml in % n >0,2 µg Hp /ml in % alle VP 60 40, ,5 alle SP 11 22, ,6 Tabelle 5 - Übersicht zur Verteilung der Hp-Konzentrationen in den Proben Aus Tabelle 5 geht hervor, dass der größte Anteil aller Messungen über dem Normwert von 0,2 µg Hp / ml Milch liegen. Prozentual gesehen lässt sich erkennen, dass gleich wie die VP auch die SP einen hohen Anteil an allen Messungen (VP 59,5 17

19 %; SP 77,6 %) im Bereich von > 0,2 µg ausmachen, insbesondere die SP. Dies kann als erstes Indiz angenommen werden, dass eine erhöhte Hp-Konzentration in einem Viertel sich auch auf die SP auswirkt. Vergleicht man nun die Einzeltiere untereinander ergibt sich ein ähnliches Bild. Dafür werden nur die Proben der VP verwendet, bei denen mindestens ein Wert innerhalb einer einzelnen Messung den Grenzwert von 0,2 µg / ml überschreitet. Anschließend werden aus den verwendeten VP-Proben und bei den dazugehörigen SP-Proben die Mittelwerte gebildet. In Abbildung 4 wird deutlich, das bei erhöhten Hp-Konzentrationen, auch wenn nicht alle Viertel betroffen sind, gleichfalls die SP erhöhte Werte über der Norm anzeigen. Selbst bei nur einem einbezogen Viertel (Tier 13) schlägt die SP deutlich durch. Bei hohen Hp-Konzentrationen auf allen Vierteln kann insbesondere bei extremen Fällen (Tier 12, 14, 15, 16) der mittlere SP-Wert auch höher ausfallen als der mittlere Wert der VP-Wiederholung. Einzige Ausnahme dabei bilden die mittleren Werte von Tier 1 und Tier 2. Bei beiden Tieren wurde in je einem Viertel eine erhöhte Hpr = 0,830 Abbildung 4 - Vergleich der Mittelwerte von VP (>0,2) und SP 18

20 Konzentration gemessen (0,3/0,2 und 0,4/0,4 µg Hp / ml Milch), doch schlagen beide nicht bei der SP durch (0,1/0,1 und 0,2/0,2 µg Hp / ml Milch). Doch zeigen sich bei den restlichen 14 Tieren stets erhöhte Werte auch in der SP. Untermauern lässt sich dies noch mit einer Korrelation von r = 0,830 (n = 16), was für einen deutlichen Zusammenhang zwischen SP und VP spricht. 5.4 Korrelation zwischen SCC und Hp in SP Zu den konventionellen Parametern zur Einschätzung des Gesundheitsstatus der Kuh zählt auch der Zellgehalt (SCC = Somatic-Cell-Count) in der Milch. Um mögliche Zusammenhänge zwischen den Hp-Konzentrationen in den SP und dem SCC nachzuweisen, wird im folgenden Abschnitt die Korrelation zwischen beiden Parametern berechnet. Zwischen allen Mittelwerten der SP und der jeweiligen individuellen SCC des Tieres besteht eine positive Korrelation von r = 0,551 (VP r = 0,658). Weiterhin werden die vier Zellzahlgruppen herangezogen und Mittelwerte des SCC und SP gebildet sowie das Minimum und Maximum der mittleren SP Messungen je Gruppe in Tabelle 6 aufgeführt. SCC Tiere MW Zellzahlen Min Mw SP Max Mw SP MW SP n je ml µg / ml µg / ml µg / ml < ,1 1,1 0, bis bis ,7 18,5 5, ,4 13,6 6,9 > ,2 14,3 13,3 Tabelle 6 - Vergleich SCC und MW SP Die Maxima der Tiere mit erhöhten Zellzahlen (> je ml Milch) heben sich deutlich von den als gesund geltenden Tieren mit weniger als SCC ab (+12,5 µg Hp / ml Milch mehr) ab. Dagegen steigen die Minima erst im Bereich von > SCC. erheblich. Doch liegen erhöhte Werte über der Norm von Hp schon im Bereich > SCC vor. Deutlich machen das die mittleren SP-Werte, die schon bei > und < SCC akute Werte (5,5 µg Hp / ml Milch) aufweisen. Aber auch der mittlere Hp-Gehalt in der Milch bei vermeintlich gesunden Kühen (< SCC) ist leicht erhöht mit 0,4 µg Hp / ml Milch. Setzt man nun den mittleren SCC der Zellgruppen in linearen Zusammenhang mit den mittleren SP- Werten dieser, ergibt sich eine stark positive Korrelation von r = 0,

21 In Abbildung 5 ist dieser Zusammenhang deutlich zu erkennen. Der Verlauf der Kurve steigt erheblich gleichzeitig mit den erhöhten SCC. r = 0,906 Abbildung 5 - Linearer Zusammenhang zwischen mittleren SCC und mittleren SP 5.5 Betrachtung von Einzeltierbeispielen Um die nun schon aufgezeigten Ergebnisse zu untermauern, werden 3 Tiere ausgewählt, die die erläuterten Ergebnisse besonders belegen Tier 13 Dieses Tier weist einen erhöhten SCC ( / ml Milch) auf, was auf konventionellen Weg auf eine Erkrankung oder Entzündung schließen lässt. Vom Bestandtierarzt wurden keine Auffälligkeiten notiert, auch äußerlich macht das Tier einen gesunden Eindruck. Jedoch zeigt ein Viertel (MW HL) einen erhöhte Hp- Konzentration (16,0 µg / ml) 20

22 Tier SCC MW SP MW HR MW HL MW VL MW VR je ml Milch µg Hp / ml Milch ,8 0,1 16,0 0,2 0,1 Tabelle 7 - Tier 13: SCC und Hp-Konzentrationen In Tabelle 7 ist deutlich, dass bei diesem Tier ein Viertel akut betroffen ist. Auch ist der Wert in der SP deutlich erhöht, obwohl die anderen Viertel alle im Normbereich liegen. Hier schlägt ein krankes Viertel deutlich in der SP durch. In Anlage 2 auf Seite 29 sind die Hp-Konzentrationen in einer Grafik aufgeführt. Ein zusätzlicher Indikator wäre hier der Versorgungsstatus des Tieres mit Eiweiß und Energie. Denn der Harnstoffgehalt in der Milch liegt mit 340 mg / kg Milch über der oberen Grenze, in Verbindung mit dem Eiweißgehalt von 3,56 % hat das Tier einen Rohproteinüberschuss. Auch das Fett-Eiweiß-Verhältnis (F/E) liegt an der Grenze zum Normbereich mit 1,10. Zusammen zeigen diese Werte eine unzureichende Versorgungslage der Kuh Tier 6 In der gesamten Versuchsreihe weist dieses Tier den geringsten SCC ( je ml Milch) aus. Dennoch hat es auf allen Vierteln erhöhte Hp-Werte, wie In Tabelle 8 aufgeführt. Auch die mittlere SP zeigt sich erhöht. In Anlage 3 auf Seite 29 sind die Hp-Konzentrationen in einer Grafik aufgeführt. Tier SCC MW SP MW HR MW HL MW VL MW VR je ml Milch µg Hp / ml Milch ,9 0,3 0,8 1,6 1,7 Tabelle 8 - Tier 6: SCC und Hp-Konzentrationen Äußerlich zeigt das Tier keine Auffälligkeiten, auch vom Tierarzt liegt kein Befund vor. Der Versorgungsstatus des Tieres liegt auch hier auf der Grenze von 300 mg / kg Milch mit Harnstoff. So hat auch dieses Tier einen Rohproteinüberschuss. Auch das F/E liegt an der unteren Grenze mit 1, Tier 15 Mit Zellen / ml Milch weist dieses Tier den weit aus höchsten Wert der Versuchsreihe auf. Rein äußerlich befindet sich dieses Tier in einer schlechten Verfassung. Der BCS ist kritisch tief, die Augen sind eingefallen. Der Versorgungsstatus des Tieres weißt auf einen deutlichen Energiemangel hin (280 mg 21

23 Harnstoff / kg Milch bei 2,95 % Eiweiß) und wird weiter Stoffwechselprobleme nach sich ziehen. Die Hp-Konzentrationen (Tabelle 9) sind in allen Vierteln erhöht sowie auch in der SP. In Anlage 4 auf Seite 30 sind die Hp-Konzentrationen in einer Grafik aufgeführt. Tier SCC MW SP MW HR MW HL MW VL MW VR je ml Milch µg Hp / ml Milch ,3 6,9 15,6 4,4 5,0 Tabelle 9 - Tier 15: SCC und Hp-Konzentrationen Weiterhin wurde bei dem Tier bereits 24 Tage vor der Probenahme eine klinische Mastitis diagnostiziert, was den hohen SCC und auch die erhöhten Hp- Konzentrationen erklärt. Das Tier befand sich zum Zeitpunkt der Probenahme noch in Behandlung 6 Diskussion Das Akute-Phase-Protein Haptoglobin wird von ECKERSALL et al. (2006) als ein Biomarker für an Mastitis erkrankte Kühe bezeichnet. Auch über die Schwere der Erkrankung kann nach ECKERSALL et al. (2006) durch die Hp-Konzentration eine quantitative Einschätzung gegeben werden. Weiterhin zeigt es signifikante Unterschiede zwischen gesunden und klinisch kranken Tieren. Auch in dieser Untersuchung zeigte der immunologische Parameter Hp zwischen Tieren mit SCC im Normbereich (< je ml Milch) und Tieren mit erhöhten SCC-Werten deutliche Unterschiede. Aber schließt nicht immer ein niedriger Zellgehalt eine immunlogische Reaktion des Organismus auf Pathogene aus. HISS et al. (2004) wies bei Kühen mit einem SCC im Normbereich Pathogene nach, deren hohe Konzentration zu einer Erkrankung führen könnte. Anhand des Tierbeispiels 6 mit nur Zellen lässt sich hier eine ähnliche Beobachtung bestätigen. Doch liegen für das Tier keine pathologischen Nachweise vor, sodass ein immunlogischer Vorgang bei diesem Tier anhand der erhöhten Hp-Konzentrationen nur vermutet werden kann. Die hohe Wiederholbarkeit von 0,993 des Testverfahrens mittels des eprocheck und dem im Gerät hinterlegten Sandwich-ELISA verspricht eine hohe Genauigkeit des Verfahrens zum Hp-Nachweis. Die hohen Korrelationen zwischen den Mes1 und Mes2 von r = 0,995 untermauern diese Aussage. Genauso aussagekräftig ist die hohe Korrelation zwischen den VP und den SP von r = 0,910. Somit kann davon ausgegangen werden, dass das Verfahren auch für den Einsatz auf dem Betrieb geeignet ist. 22

24 Als Indikator für eine Erkrankung dient in der klassischen Anwendung nach wie vor der SCC. Bei Tieren mit mehr als Zellen in der Milch wurden bei LAI et al. zehnmal höhere Hp-Konzentrationen nachgewiesen, als bei Tieren mit einem in der Norm befindlichen SCC von weniger als Zellen. In dieser Untersuchung sind die mittleren Hp-Konzentrationen bei Tieren mit mehr als Zellen 33mal höher als bei Tieren mit Normwerten. Aber auch die Tiere mit > bis SCC zeigen mit im Mittel von 5,5 µg / ml Milch schon deutlich erhöhte Konzentrationen an Hp. Einzeltiere im Bereich von < SCC haben auch erhöhte Hp-Konzentration in der Milch, doch sind dies Einzelfälle. Der lineare Zusammenhang zwischen Hp- Konzentration in der Milch und der SCC mit einer Korrelation von r = 0,551 deutet auf einen Verbindung zwischen den beiden Parametern hin. Auch andere Autoren fanden signifikante Zusammenhänge zwischen Hp und SCC. So fand MEDVID et al. (2011) eine Korrelation zwischen SCC und Hp von r = 0,62, LAI et al. von r = 0,742 und HAGHKAH et al. (2009) von r = 0,659. Doch muss ein niedriger Zellgehalt nicht gleichzeitig auch eine niedrige Hp-Konzentration bedeuten. Was anhand von Tierbeispiel 6 schon erläutert wurde. Anhand der Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die SP als ausreichend eingestuft werden kann. Die Gewinnung von VP ist daher nicht notwendig. Denn wie bei Tier 13 erläutert wurde, schlägt hier ein einzelnes Viertel (16,0 µg) in der SP (12,8 µg) durch, obwohl die anderen Viertel alle unter einem Wert von 0,2 µg blieben. Auch wenn nur eine VP (>0,2 µg Hp /ml Milch) in die Betrachtung einbezogen wir, schlägt die SP deutlich durch (siehe Abbildung 4 in 5.3). Auch andere Autoren (KOVAC et al. (2006); HAGHKHAH et al. (2009); MEDVID et al. (2011)) konnten anhand von Poolproben ausreichend Hp nachweisen, um Rückschlüsse auf immunologische Prozesse ziehen zu können. Die hohe Korrelation zwischen VP und SP von r = 0,910 sowie die prozentuale Verteilung (Tabelle 5) von VP (59,5 %) zu SP (77,6 %) bei einer Hp-Konzentration von > 0,2 µg / ml Milch deuten auf eine hohe Sicherheit der SP, erhöhte HP-Konzentrationen in der Milch zuverlässig anzuzeigen. 23

25 7 Zusammenfassung und Ausblick Nach Studien vorhandener Literatur und nach Auswertung dieses Versuches kann Haptoglobin als besonders sensibler Biomarker bei immunologischen Reaktionen verstanden werden. Selbst Tiere, die klinisch als gesund gelten, können erhöhte Hp- Konzentrationen in der Milch haben. So können subklinische Erkrankungen, wie eine subklinische Mastitis, frühzeitig erkannt werden. Dies untermauert die Sensibilität von Hp als Marker für immunlogische Vorgänge im Organismus insbesondere im Euter durch Hp in der Milch. Anhand der Ergebnisse bei den SP, kann die Anwendung von SP als ausreichend eingestuft werden, um bei den Tieren erhöhte HP-Konzentrationen nachzuweisen. So müssen für den weiteren Projektverlauf keine Viertelgemelksproben verwendet werden. Der Aufwand der Probenahme reduziert sich dadurch erheblich 24

26 8 Literatur HAGHKHAH, M. et al. (2009): Evaluation of milk haptoglobin and amyloid A in high producing dairy cattle with clinical and subclinical mastitis in Shiraz. (online) ( ) ECKERSALL P.D. et al. (2006): Acute Phase Proteins in Bovine Milk in an Experimental Model of Staphylococcus aureus Subclinical Mastitis. (online)( ) HISS, S. et al. (2004): Haptoglobin Concentrations in Blood and Milk After Endotoxin Challenge and Quantification of Mammary Hp mrna Expression. (online)( ) HOFMANN, W. et al. (2005): ELISA. (online)( ) JANEWAY, C.A. et al. (2002): Immunologie. 5. Auflage, Heidelberg, Berlin: Spektrum Akademischer Verlag GmbH KOVAC, G. et al. (2006): Interrelationship between Somatic Cell Count and Acute Phase Proteins in Serum and Milk of Dairy Cows. (online)( ) KUJALA, M. et al. (2010): Serum acute phase proteins as a maker of inflammation in dairy cattle with hoof diseases. (online)( ) LAI, I-H. et al. (2009): Neutrophilis as on of the major haptoglobin sources in mastitis affected milk. (online)( ) s: &itemid=129 25

27 MEDVID. V. et al (2011): Beurteilung der Milchqualität aufgrund mikrobiologischer und zytometrischer Untersuchungen sowie der Bestimmung von Akute-Phase- Proteinen. (online)( ) Eutergesundheit.pdf RENZ, H. (2009): Praktische Labordiagnostik. Berlin: Walter de Cruyter GmbH & Co. KG SAUERWEIN, H., MÜLLER, U. (2005): Gegenüberstellung der Milchqualität und des Gesundheitsstatus von Milchkühen von ökologisch bewirtschafteten Betrieben im Vergleich zu konventionell wirtschaftenden Betrieben im Rheinland. (online)( ) SCHÜTT, C. et al. (2011): Grundwissen Immunologie. 3. Auflage, Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag GmbH TSCHISCHKALE, R. (2002): Eutergesundheit Kontagiöse Mastiden. (online)( ) WINTER, P. (2010): Die Zellzahl in der Milch als Grundlage zur Sanierung von Mastitis-Problembetrieben. (online)( ) id=100103&lang=en WOLTER, W. et al. (2001): Die Mastitis des Rindes. (online)( ) 26

28 9 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 - Aufbau eines Sandwich-ELISA. Quelle: HOFMANN et. al. (2005) Abbildung 2 - Vergleich der Messungen von Viertel- und Sammelproben Abbildung 3 - Vergleich der Messungen Viertel- und Sammelprobe < 5,1 µg Hp / Milch Abbildung 4 - Vergleich der Mittelwerte von VP (>0,2) und SP Abbildung 5 - Linearer Zusammenhang zwischen mittleren SCC und mittleren SP Tabellenverzeichnis Tabelle 1- Milchzellen in Milch und Mastitismilch - Quelle: WINTER, P. (2010) Tabelle 2 - Gruppeneinteilung Tabelle 3 - Probenübersicht Tabelle 4 - Vergleich der je 3 Messungen innerhalb der Sammelmischproben Tabelle 5 - Übersicht zur Verteilung der Hp-Konzentrationen in den Proben Tabelle 6 - Vergleich SCC und MW SP Tabelle 7 - Tier 13: SCC und Hp-Konzentrationen Tabelle 8 - Tier 6: SCC und Hp-Konzentrationen Tabelle 9 - Tier 15: SCC und Hp-Konzentrationen Anlagenverzeichnis Anlage 1 - Übersicht der Einzeltiere Anlage 2 - Hp-Konzentrationen Tier Anlage 3- Hp-Konzentrationen Tier Anlage 4 - Hp-Konzentrationen Tier

29 12 Anlagen 12.1 Übersicht Einzeltiere Tier ID aktlakt aktmt SCC in Tausend BCS LCS Mw_VP MW_SP ,5 2 0,1 0, ,75 3 0,2 0, ,0 2 0,7 0, ,5 1 0,5 0, ,5 4 0,8 0, ,5 2 1,1 0, ,5 2 1,0 1, ,75 4 1,1 1, ,0 1 1,7 1, ,75 2 1,1 1, ,5 2 1,5 1, ,5 4 10,3 12, ,25 1 4,1 12, ,25 2 7,4 13, ,25 2 7,9 14, ,0 1 6,6 18, ,5 1 0,1 0, ,25 2 0,1 0, ,25 2 0,1 0,1 Anlage 1 - Übersicht der Einzeltiere 28

30 12.2 Hp-Konzentrationen Tier 13 Anlage 2 - Hp-Konzentrationen Tier Hp-Konzentrationen Tier 6 Anlage 3- Hp-Konzentrationen Tier 6 29

31 12.4 Hp-Konzentrationen Tier 15 Anlage 4 - Hp-Konzentrationen Tier 15 30