Aus der Medizinischen Klinik 1 der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. M. Neurath

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1 Aus der Medizinischen Klinik 1 der FriedrichAlexanderUniversität ErlangenNürnberg Direktor: Prof. Dr. med. M. Neurath Einflüsse einer adäquaten ContinuousPositiveAirwayPressure Therapie auf die Plasmaspiegel der Peptidhormone Apelin, Obestatin und Leptin bei Patienten mit neu diagnostiziertem SchlafapnoeSyndrom InauguralDissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der FriedrichAlexanderUniversität ErlangenNürnberg vorgelegt von Tabea Hauck aus Nürnberg

2 Erlangen, Februar 2012 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der FriedrichAlexanderUniversität ErlangenNürnberg Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler Prof. Dr. I. A. Harsch Prof. Dr. M. F. Neurath Tag der mündlichen Prüfung: 11. Dezember 2012

3 Inhaltsverzeichnis 1. Fragestellung und Zusammenfassung S Summary and Approach S Einleitung S Apelin S Obestatin S Leptin S Patienten und Methoden S Patienten S Probanden S DXAMethode S Allgemeines Prinzip des Radioimmunassays S Protokoll zur Messung der Plasmaspiegel von Apelin S Protokoll zur Messung der Plasmaspiegel von Obestatin S Protokoll zur Messung der Plasmaspiegel von Leptin S Untersuchungen im Schlaflabor S Schlafstadien nach Rechtschaffen und Kales S Polysomnographie S Definition von Arousals S Ergebnisse S Plasmaspiegel von Apelin S Plasmaspiegel von Obestatin S Plasmaspiegel von Leptin S Messung der Körperzusammensetzung S Diskussion S Zusammenfassende Darstellung S Literaturverzeichnis S Abkürzungsverzeichnis S Danksagung S. 60

4 1 1. Fragestellung und Zusammenfassung a) Hintergrund und Ziele Das obstruktive SchlafapnoeSyndrom (OSAS) ist eine Erkrankung, die zunehmend an Bedeutung gewinnt, da sie oft mit dem metabolischen Syndrom (MS) assoziiert ist oder möglicherweise zum MS gehört. Weil das MS praktisch immer mit Adipositas vergesellschaftet ist, hat die Forschung in den letzten Jahren die Funktion diverser Fettgewebshormone im Energiehaushalt des Körpers untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, zu klären, welche Rolle die hinsichtlich der Energiehomöostase bedeutenden Peptide Apelin, Obestatin und Leptin bei OSAS Patienten spielen, und wie sich die Plasmaspiegel vor und unter Therapie gegenüber denen von gesunden Probanden verhalten. b) Methoden Es wurden 10 Patienten mit einem neu diagnostizierten obstruktiven Schlafapnoe Syndrom (ApnoeHypopnoeIndex (AHI) > 10/h, Epworth SleepinessScore (ESS) > 10 Punkte) und 10 gesunde Probanden als Kontrollgruppe in die Studie aufgenommen. Bei allen Teilnehmern wurden Messungen für Apelin, Obestatin und Leptin im Abstand von vier Stunden und eine Polysomnographie im Schlaflabor durchgeführt. Bei der Gruppe der Patienten wurde dies nach einer dreimonatigen ContinuousPositiveAirwayPressure (CPAP)Therapie wiederholt. Außerdem wurde die Insulinresistenz mithilfe des HomeostasisModelAssessment (HOMA) Index erfasst, und ebenso die genaue Körperzusammensetzung mittels Dual Energy XRayAbsorptiometrie (DXA) bestimmt. c) Ergebnisse und Beobachtungen Die Plasmaspiegel von Apelin waren unter Therapie rückläufig, zeigten aber keinen signifikanten Unterschied zwischen der Patienten und der Kontrollgruppe. In der Therapiegruppe zeigte sich zu allen Zeitpunkten der Untersuchung eine positive Korrelation mit dem AHI und dem BodyMassIndex (BMI). Die Plasmaspiegel von Obestatin zeigten keinen Unterschied in den untersuchten Gruppen, aber sie hingen teilweise mit dem AHI und dem Gewicht der neu diagnostizierten Patienten zusammen. Der HOMAIndex bei Patienten vor und unter Therapie zeigte keinen signifikanten Unterschied (22,35 +/ 42,64 vs. 11,62 +/ 16,36, p> 0,05). Dagegen unterschied sich der HOMAIndex bei Patienten vor Therapie und bei der gesunden Kontrollgruppe deutlich (19,15 +/ 29,83 vs. 2,73 +/ 3,37, p< 0,05).

5 2 Die LeptinSpiegel waren im Patientenkollektiv höher und sanken nach dem Beginn der CPAPTherapie. Sie zeigten eine positive Korrelation mit dem BMI, der minimalen Sauerstoffsättigung und dem AHI bei Patienten vor Therapie. d) Schlussfolgerungen In Übereinstimmung mit anderen Studien konnte gezeigt werden, dass ein Unterschied im LeptinSpiegel zwischen gesunden Kontrollen und Patienten mit einem neu diagnostizierten OSAS vorliegt. Apelin sinkt unter Therapie, allerdings nicht in signifikanter Art und Weise. Die ObestatinWerte verändern sich nach Beginn einer CPAPTherapie nicht. Außerdem konnte ein Zusammenhang zwischen dem LeptinSpiegel und dem BMI, sowie zwischen dem AHI und dem Gewicht in der Gruppe der unbehandelten Patienten festgestellt werden. 2. Summary and Approach a) Background and objectives The obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) is a disease with an increasing importance because it is often associated with the metabolic syndrome (MS) and may even be a part of it. As the MS is almost always related to adiposity, in the last decades a lot of research, focusing on the function of several new adipose tissue hormones in the energy homeostasis, has been done. The objective of this work is to find out what role the newly discovered peptides apelin, obestatin and leptin play in OSASpatients and how the levels of these hormones vary before and under therapy in contrast to healthy controls. b) Methods Ten patients with newly diagnosed obstructive sleep apnoea syndrome (apnoeahypopnoeaindex (AHI) > 10/h and Epworthsleepinessscore (ESS) > 10 points) and ten healthy volunteers as controls were enrolled in the study. All underwent measurements for apelin, obestatin and leptin in four hour intervals during diagnostic polysomnography for 24h.Three months after onset of CPAP treatment this was repeated in the patient group. Furthermore insulin resistance was measured using the HOMAindex and body composition was also quantified.

6 3 c) Results The plasma apelin levels in the patients decreased under CPAP therapy, but showed no significant difference in the patient and volunteer group. In the therapy group a positive correlation to AHI and BMI was found at all observation points. Plasma obestatin levels did not differ significantly in the three observation groups, but they were partly correlated to AHI and weight in the newly diagnosed OSASpatients. The HOMAindex between patients before and after therapy showed no significant differences (22,35 +/ 42,64 vs. 11,62 +/ 16,36, p > 0,05). But in contrast to that, the HOMAindex comparing patients before therapy and healthy controls differs in a significant manner (19,15 +/ 29,83 vs. 2,73 +/ 3,37, p< 0,05). Leptin plasma levels were higher in the patient group and decreased after onset of CPAP therapy. They showed a positive correlation to the body mass index, the minimal oxygen saturation and the AHI in the patient group before therapy. d) Conclusions In agreement with previous studies, a difference in leptin plasma levels between healthy volunteers and patients with newly diagnosed OSAS could be demonstrated. Apelin decreases under CPAP treatment, but not in a significant manner. Obestatin levels remain unchanged after onset of CPAP therapy. Moreover a linkage between leptin plasma levels, BMI, AHI and weight in the untreated patient group was found. 3. Einleitung Das Obstruktive Schlafapnoe Syndrom wird zu den schlafbezogenen Atemstörungen gezählt und ist eine Erkrankung mit einer zunehmenden weltweiten Prävalenz. Wie in zahlreichen Studien nachgewiesen wurde, liegt dies vor allem am Zusammenhang des Krankheitsbildes mit Faktoren wie Übergewicht, Glukoseintoleranz, Insulinresistenz und Bluthochdruck, also den typischen Kennzeichen des metabolischen Syndroms [129, 41, 92].

7 4 OSA Flow Thorax Abdomen Es gibt wenige epidemiologische Studien zur Häufigkeit des OSAS, aber dennoch zeigt sich, dass der Anteil der Betroffenen hoch ist. In Wisconsin (USA) fand sich ein OSAS mit klinischer Symptomatik bei 24% der Erwachsenen im Alter von 30 bis 60 Jahren [137]. In Spanien liegt der Anteil der Erkrankten bei 3,2% und in Australien bei 4,2 %, wobei die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass weltweit mehr Männer als Frauen betroffen sind [112]. Man unterscheidet drei Formen der Schlafapnoe. In einem Patientenkollektiv, das von Morgenthaler et al. untersucht wurde, fanden sich eine zentrale Form der Apnoe bei 0,4%, eine obstruktive Form bei 84% und eine gemischte oder auch komplexe Form der Apnoe bei 15% der Patienten [77]. Schon an diesen Zahlen wird deutlich, dass der überwiegende Anteil der Erkrankten an dem obstruktiven Schlafapnoe Syndrom leidet. Sauerstoffsättigung CSA Flow Thorax Abdomen Sauerstoff sättigung Abb. 1: Unterschied zwischen obstruktiver (OSA) und zentraler Schlafapnoe (CSA) Quelle: [78] Das zentrale SchlafapnoeSyndrom bezeichnet eine seltene, heterogene Gruppe von Krankheitsbildern, bei denen es aus vielen unterschiedlichen Gründen zu einer Verringerung oder einem Fehlen des Atemantriebs kommt [86].

8 5 Beim wesentlich häufigeren OSAS handelt es sich um eine Atemstörung, die sich im Schlaf manifestiert und bei der es charakteristischerweise immer wieder zu Apnoen bzw. Hypopnoen kommt. Laut Definition der American Academy of Sleep Medicine (AASM) dauert die Apnoe oder Hypopnoe mindestens 10 Sekunden. Es müssen mindestens fünf solche Ereignisse pro Stunde Schlaf im Zusammenhang mit klinischen Beschwerden oder mindestens 15 solche Ereignisse mit oder ohne klinische Beschwerden auftreten, um ein OSAS diagnostizieren zu können [24]. Die pathophysiologische Ursache ist in den meisten Fällen ein Kollaps der Schlundmuskulatur durch den nachlassenden Tonus der Pharynxmuskulatur im Schlaf [132]. Luftröhre harter Gaumen Nasenhöhle Luftröhre harter Gaumen Nasenhöhle Zunge Freie Atemwege Mundhöhle weicher Gaumen Zunge Mundhöhle weicher Gaumen Verschlossene Atemwege bei Apnoe Abb. 2: Pathophysiologie der Verlegung der oberen Atemwege beim obstruktiven SchlafapnoeSyndrom; Quelle: modifiziert nach [70] Auf den Verschluss der oberen Atemwege folgt eine nächtliche Hypoxie und Hyperkapnie und es kommt zu Arousals, zentralnervösen Aufwachreaktionen des Körpers, die von den Patienten selbst nicht bemerkt werden, welche aber die normale Schlafarchitektur empfindlich stören [47]. Diese Episoden wiederholen sich mehrmals pro Nacht, so dass es zu einer Schlaffragmentation kommt und der normale Schlafrhythmus gestört ist. Daraus erklärt sich die erhöhte Tagesmüdigkeit und Konzentrationsschwäche, was sich auch in einer signifikant erhöhten Unfallrate im Straßenverkehr bei betroffenen Patienten im Vergleich zur Normalbevölkerung ausdrückt [53].

9 6 Zusätzlich können noch weitere Symptome wie eine depressive Verstimmung, eine intellektuelle Leistungsminderung oder morgendliche Kopfschmerzen sowie Potenzstörungen auftreten [48]. In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass das Vorliegen eines Schlafapnoe Syndroms das kardiovaskuläre Risiko insgesamt signifikant erhöht [71]. Patienten mit einem OSAS leiden häufiger an pulmonaler Hypertonie [91] und groß angelegte Studien konnten zeigen, dass das OSAS ein Risikofaktor für die Entstehung eines systemischen Hypertonus darstellt, unabhängig von Faktoren wie Alter, Körpergewicht, Rauchgewohnheiten oder Alkoholkonsum [50, 80]. Weiterhin treten bei OSASPatienten auch häufiger Herzrhythmusstörungen [113] und Schlaganfälle [5, 134] auf. Wie bereits erwähnt, zeigte sich auch in vielen Studien, dass Patienten mit einem OSAS unter einer Insulinresistenz leiden [92, 93]. Das wichtigste Ziel in der Therapie ist die Vermeidung der nächtlichen Apnoen bzw. Hypopnoen. Der Goldstandard in der Behandlung ist hierbei die CPAPTherapie (ContinuousPositiveAirwayPressure), die 1981 erstmals von Sullivan et al. beschrieben wurde. Hierbei werden niedrige Drücke von 4,5 10 cm H2O über eine Maske appliziert, die ein Zusammenfallen der oberen Atemwege verhindern und somit einen normalen Schlafrhythmus ermöglichen [115]. Auf diese einfache und sichere Art und Weise werden die Beschwerden der Patienten wie die Tagesmüdigkeit, die depressive Verstimmung und die kognitive Leistungsfähigkeit signifikant verbessert [27, 26]. Abb. 3: Offenhaltung der Atemwege durch Therapie mittels CPAP; Quelle: [142]

10 7 vor CPAP unter CPAP EEG EOG EOG EMG EKG Flow Thorax Abdomen Sauerstoff sättigung Abb.4:Deutliche Besserung beim Vergleich polysomnographischer Parameter vor und unter CPAPTherapie (EEG=Elektroenzephalographie, EOG=Elektrookulographie, EMG= Elektromyographie, EKG=Elektrokardiographie) Quelle: [142] Die verschiedenen oben genannten Risikofaktoren werden umso bedeutsamer je stärker die Patienten an Übergewicht leiden. Aus diesem Grund ist ein Baustein der Therapie auch die Gewichtsreduktion. Da Übergewicht selbst aber wiederum ein anerkannter und bedeutsamer Risikofaktor für die Entwicklung eines OSAS ist, trägt natürlich die steigende Anzahl an übergewichtigen Menschen auf der ganzen Welt dazu bei, dass die Häufigkeit des OSAS stetig zunimmt. Vor diesem Hintergrund finden sich multiple Studien, um die komplexen Zusammenhänge bei der Regulation von Nahrungsaufnahme, Hunger und Sättigung sowie Energiespeicherung und verbrauch zu verstehen. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden viele neue regulatorische Peptide wie Leptin, Ghrelin oder Adiponektin entdeckt und in Studien wurde ihre Rolle im Energiehaushalt des Körpers untersucht. Teilweise sind diese Peptide ebenfalls an der Regulation des Schlafs beteiligt. Dies stellte sich unter anderem dadurch heraus, dass die Plasmaspiegel von Leptin bei Patienten mit OSAS nach einer erfolgreichen Therapie (ohne Gewichtsveränderung) mittels CPAP sanken [42, 19].

11 8 3.1 Apelin Apelin ist ein Peptid, das 1998 als endogener Ligand des GProtein gekoppelten APJRezeptors entdeckt wurde [121]. Abb. 5: 3 DStruktur von Apelin Quelle: [1] Es entsteht aus einem Vorläuferpeptid mit 77 Aminosäuren und wird in verschiedenen Geweben zu mehreren Isoformen, u.a. Apelin36, Apelin17 und Apelin13, prozessiert [63, 54]. Die Sequenz der Isoform Apelin13 weist eine 100 %ige Übereinstimmung zwischen Menschen und Fröschen auf, was darauf hindeutet, dass hier eine wichtige evolutionäre Funktion konserviert wurde [33]. Das Peptid und sein Rezeptor werden in zahlreichen Geweben exprimiert, vor allem im zentralen Nervensystem, aber auch in Herz, Lunge, Keimdrüsen, Nieren, Brustdrüsen und im Gastrointestinaltrakt [63, 76]. Folglich wurden dem Peptid verschiedene Effekte auf das Herzkreislaufsystem [18], die hypothalamischhypophysäre Achse und das Trinkverhalten [118], auf die Stimulation der gastrointestinalen Zellproliferation und die CholecystokininSekretion [131], auf die Nahrungsaufnahme sowie auf die Appetitregulation [85] zugewiesen. Kürzlich konnte zudem gezeigt werden, dass Apelin auch vom Fettgewebe gebildet wird und von Insulin sowie von Tumor Nekrose Faktor α (TNF α) reguliert wird [13, 22]. In weiteren Studien stellte sich heraus, dass Apelin ein wichtiger angiogenetischer Faktor ist [21] und Eyries et al. wiesen nach, dass es bei Hypoxie zu einer Induktion

12 9 des Hormons kommt, was sowohl in Zellkulturen als auch im Mausmodell demonstriert werden konnte [28]. Obwohl die genauen Mechanismen noch Gegenstand der Forschung sind, wurde kürzlich berichtet, dass der Transkriptionsfaktor Hypoxieinduzierter Faktor 1 (HIF1) die Expression von Apelin in Kardiomyozyten sowie in Adipozyten reguliert [100, 34]. In Hinblick auf diese Erkenntnisse wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit man einen Unterschied in der ApelinSekretion zwischen gesunden Menschen und Patienten mit einem OSAS vor und unter CPAPTherapie finden kann. Der Verdacht liegt nahe, weil es durch ein OSAS zu einer chronischen nächtlichen Hypoxie kommt. Da bei Patienten mit einem OSAS eine Insulinresistenz vorliegt [41,] und durch Glassford et al nachgewiesen wurde, dass es durch Insulin zu einer ApelinExpression im Fettgewebe kommt [34], besteht eventuell von vornherein und nicht nur innerhalb bestimmter Zeiträume eine unterschiedliche ApelinSekretion in den beiden untersuchten Gruppen. 3.2 Obestatin Ein weiteres neues Aminopeptid, welches 2005 von Zhang et al. entdeckt wurde, ist Obestatin. Es besteht aus 23 Aminosäuren und stammt ebenso wie Ghrelin vom PräproghrelinGen ab. Laut Zhang und seinen Mitarbeitern bindet das Peptid an den GProteingekoppelten Rezeptor GPR39, der zur Unterfamilie der Ghrelin Rezeptoren gehört. Des Weiteren stellte die Arbeitsgruppe fest, dass es bei Ratten zu einer verminderten Nahrungsaufnahme kommt, wenn das Peptid peripher oder in die Hirnventrikel gespritzt wird. Zudem stellten sie als Wirkung dieses Hormons eine verzögerte Magenentleerung und eine geringere Kontraktilität der Jejunum Muskulatur fest [139]. Aus diesen Gründen wurde postuliert, dass es sich bei Obestatin um den Antagonisten von Ghrelin handelt [143]. Allerdings gibt es inzwischen auch zahlreiche andere Studien, die diese Schlussfolgerung nicht bestätigen konnten [23, 35, 51], so dass die genaue Rolle von Obestatin und seinem Rezeptor noch Gegenstand der Forschung ist.

13 10 Abb. 6: Strukturen von Obestatin: Isoform Ob (1123) in Wasser gelöst (A), Obestatin in Wasser gelöst (B), Obestatin als Mizelle (C) Quelle: [108] Darüber hinaus spielt Obestatin auch eine Rolle bei der Inhibition des Durstmechanismus [104] und es verbessert die Gedächtnisfunktion, wie De Smet et al. [23] zeigen konnten. Zudem induziert Obestatin die Zellproliferation [15], die Produktion von Pankreasenzymen und die Trypsinaktivität [62] konnte eine Arbeitsgruppe aus China zudem nachweisen, dass das Aminopeptid zu einer Zunahme des Fettgewebes führt und die Ausschüttung von InsulinlikeGrowth Factor 1 (IGF1) verhindert [119]. Dies alles zeigt bereits, dass Obestatin eine wichtige Funktion im menschlichen Energiehaushalt besitzt. Von besonderem Interesse für diese Arbeit ist die Rolle von Obestatin bei der Regulation des Schlafs, was bisher an Ratten untersucht worden ist. Es konnte schon demonstriert werden, dass es durch die zentrale Verabreichung des Peptids zu einer Zunahme des NREM (NonRapidEyeMovement)Schlafs und einer Verringerung der Nahrungsaufnahme kommt [117]. Laut den wissenschaftlichen Erkenntnissen, die dieser Arbeit vorliegen, sind derzeit noch keine seriellen Messungen von Obestatin bezüglich seiner Rolle bei der Schlafregulation des Menschen durchgeführt worden. Somit dienten in dieser Studie Patienten mit einem OSAS als biologische Modelle für ein gestörtes Schlafverhalten und wurden mit gesunden Probanden verglichen. Außerdem wurden mögliche Veränderungen in der ObestatinSekretion nach der Wiederherstellung des normalen Schlafs bei OSASPatienten untersucht.

14 11 Nahrungsaufnahme Energiemetabolismus Gedächtnis Kardiovaskuläre Funktionen Wachstum Zellproliferation Acyliertes Grehlin Desacyl Grehlin Obestatin Schlaf Angst Reproduktion Atmung Flüssigkeitsaufnahme Knochenstoff wechsel Gastrointestinale Motilität Abb. 7: Verschiedene Funktionen von Ghrelin und Obestatin Quelle: modifiziert nach [69] Die Interaktion von Apelin und Obestatin mit der InsulinResistenz, ein gut charakterisiertes Merkmal bei Patienten mit einer Schlafapnoe, ist bereits beschrieben worden und in dieser Arbeit wurde auch das Maß der Insulinsensitivität bzw. resistenz der Patienten mithilfe des HOMAIndex (Homeostasis Model Assessment ) festgestellt. Der HOMAIndex wurde erstmals 1985 von Matthew et al. entwickelt, um aus den nüchtern bestimmten Werten von Glukose und Insulin die Insulinresistenz und die Funktion der BetaZellen des Pankreas bestimmen zu können. Die Grundlage bildet folgende Gleichung: Insulin (µu/ml) x Glucose (mmol/l) / 22,5 [74]. Auch in der San Antonio Heart Study wurde der Index als ein nützliches Modell für die Bestimmung der Insulinresistenz und der endokrinen Pankreasfunktion bestätigt [40].

15 Leptin Ein weiteres wichtiges Protein im Zusammenhang mit dem OSAS ist Leptin. Seine Rolle beim SchlafapnoeSyndrom ist bereits genauer erforscht. Es wird vor allem von Adipozyten produziert, besteht aus 167 Aminosäuren und leitet sich vom ob(obese)gen ab [140]. Außerdem wird es auch im Magen [7] und in der quergestreiften Muskulatur [116] produziert. Da Patienten mit einem OSAS meist an Übergewicht leiden und somit eine größere Anzahl an Fettgewebszellen besitzen, ist es nicht verwunderlich, dass die Leptinspiegel bei ihnen erhöht sind [20]. Außerdem konnte in Studien gezeigt werden, dass Leptin als unabhängiger Risikofaktor für koronare Herzerkrankungen fungiert [130] und mit einer Erhöhung von Entzündungsmarkern bei krankhaft übergewichtigen Personen korreliert, so dass das Peptid auch als Auslöser einer Entzündungsreaktion diskutiert wird [126]. Abb. 8: 3 DStruktur von Leptin Quelle: [138] Ip et al. wiesen 2000 nach, dass der Hormonspiegel von Leptin durch eine CPAPTherapie, unabhängig von anderen Parametern wie z. B. dem Körpergewicht, abgesenkt wird [57]. Dies wurde auch in weiteren Studien untersucht und deutet darauf hin, dass Leptin eine wichtige Rolle beim Atmungsprozess spielt [42, 19]. Da ein enger Zusammenhang zwischen einer Insulinresistenz und dem LeptinSpiegel besteht [43, 11, 129], wird auch vermutet, dass es durch die Therapie des

16 13 OSAS zu einer Absenkung der LeptinKonzentration im Blut der Patienten kommt, weil es unter CPAPTherapie zu einer Reduktion der Insulinresistenz kommt [41]. Da bezüglich Leptin Interaktionen mit Apelin [82] ebenso wie mit Obestatin [12] beschrieben sind, wurden in dieser Arbeit serielle Messungen der LeptinKonzentration durchgeführt, um mögliche Interaktionen zwischen diesen Hormonen zu charakterisieren. 4. Patienten und Methoden 4.1 Patienten Zehn Patienten (n=10, männlich) mit einem neu diagnostizierten symptomatischen obstruktiven SchlafapnoeSyndrom (ApnoeHypopnoeIndex (AHI) > 10 pro Stunde und Epworth Sleepiness Score (ESS) > 10 Punkte) wurden in die Studie eingeschlossen. Obstruktive Apnoen wurden als das Fehlen eines Atemstroms über Mund und Nase von länger als 10 s definiert. Hypopnoen wurden als eine Verminderung des vorher regelmäßigen Atemstroms auf 50 % für die Dauer von 10 s oder länger mit einem Abfall der Sauerstoffsättigung um 4 % definiert. Die mittlere Anzahl an Apnoen und Hypopnoen pro Stunde wurde mit dem Apnoe/HypopnoeIndex berechnet. Er bezeichnet die Anzahl der Apnoen und Hypopnoen pro Stunde Schlafzeit, wobei ein AHI > 5/h als pathologisch angesehen wird. Der Epworth SleepinessScale ist ein Fragenkatalog, um die Tagesmüdigkeit genauer zu beurteilen [58]. Darin wird retrospektiv die Wahrscheinlichkeit für das Einschlafen in acht typischen Alltagssituationen abgefragt. Er wird allgemein als ScreeningInstrument bei Schlafstörungen eingesetzt, um das Ausmaß der Tagesschläfrigkeit abzuschätzen und er dient auch bei OSASPatienten zur Verlaufs und Erfolgskontrolle einer CPAPTherapie [31]. Zur Auswertung wird eine Summe aus den acht abgefragten Items gebildet. Für die Durchführung benötigt man nur ca. 1 Minute. Bei Untersuchungen zeigte sich varianzanalytisch ein höherer Summenscore bei Patienten mit OSAS, Narkolepsie und einer idiopathischen Hypersomnie im Gegensatz zu Menschen, die ein primäres Schnarchen an den Tag legten und ebenfalls im Unterschied zu einer gesunden Kontrollgruppe [58, 59].

17 14 Fragebogen zur Tagesschläfrigkeit (Epworth Sleepiness Scale) Die folgende Frage bezieht sich auf Ihr normales Alltagsleben in der letzten Zeit: Für wie wahrscheinlich halten Sie es, daß Sie in einer der folgenden Situationen einnicken oder einschlafen würden, sich also nicht nur müde fühlen? Auch wenn Sie in der letzten Zeit einige dieser Situationen nicht erlebt haben, versuchen Sie sich trotzdem vorzustellen, wie sich diese Situationen auf Sie ausgewirkt hätten. Benutzen Sie bitte die folgende Skala, um für jede Situation eine möglichst genaue Einschätzung vorzunehmen und kreuzen Sie die entsprechende Zahl an: 0 = würde niemals einnicken 1 = geringe Wahrscheinlichkeit einzunicken 2 = mittlere Wahrscheinlichkeit einzunicken 3 = hohe Wahrscheinlichkeit einzunicken Situation Wahrscheinlichkeit einzunicken Im Sitzen lesend Beim Fernsehen Wenn Sie passiv (als Zuhörer) in der Öffentlichkeit sitzen (z.b. im Theater oder bei einem Vortrag) Als Beifahrer im Auto während einer einstündigen Fahrt ohne Pause Wenn Sie sich am Nachmittag hingelegt haben, um auszuruhen Wenn Sie sitzen und sich mit jemand unterhalten Wenn Sie nach dem Mittagessen (ohne Alkohol) ruhig dasitzen Wenn Sie als Fahrer eines Autos verkehrsbedingt einige Minuten halten müssen Bitte nicht ausfüllen Summe Abb. 9: Der EpworthSleepinessScaleFragebogen Quelle: [31]

18 15 Als erster Schritt wurde bei den Patienten eine diagnostische Polysomnographie (PSG) im Schlaflabor durchgeführt. Vor diesem Hintergrund wurde das Ausmaß des OSAS und der Schlafstörung quantifiziert. Der AHI und auch die Schlafqualität wurden bestimmt. Vor der Polysomnographie wurde von allen Patienten die vollständige Anamnese erhoben. Zudem wurde eine ausführliche körperliche Untersuchung vorgenommen und die klinisch relevanten Blutwerte wurden bestimmt. Folgende Werte wurden im Zentrallaboratorium, der Nuklearmedizinischen Abteilung und im Endokrinologischen Labor der Universitätsklinik Erlangen bestimmt: kleines Blutbild (Leukozyten, Hämoglobin, Thrombozyten, Erythrozyten, Hämatokrit, MCH, MCV, MCHC, RDW, MPV) Differentialblutbild (Neutrophile/eosinophile/basophile Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten) Elektrolyte (Kalium, Natrium) Substrate im Serum (Harnsäure, Harnstoff, Kreatinin, Bilirubin gesamt) Glomeruläre Filtrationsrate Enzyme bei 37 C im Serum (CK, CKMB, AST, ALT, GammaGT) Proteine im Serum (CRP) Glucose im Serum HbA1c Hormone (Insulin, TSH, ft3, ft4) Dies hatte zum Zweck, andere schwere Erkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus, Hepatitis oder eine Tumorerkrankung auszuschließen. Ebenso wurde eine genaue Medikamentenanamnese erhoben, um zu verhindern, dass eine Medikation mit Einfluss auf die Insulinsensitivität die Analyse der Fettgewebshormone beeinflusst. Nach einem Zeitraum von drei Monaten und nachdem die Patienten zuverlässig die CPAPTherapie angewandt hatten, wurden alle Untersuchungen nochmals wiederholt (PSG unter CPAPTherapie, Fragenkatalog, DXAMessung und Blutentnahme) und mit den anfänglichen Ergebnissen verglichen. Die Hormone Apelin, Obestatin und Leptin wurden im Abstand von vier Stunden (2, 6, 10 Uhr und 14, 18, 22 Uhr), einschließlich der Nacht der diagnostischen und therapeutischen Polysomnographie, gemessen. Der normale SchlafWachRhythmus blieb erhalten und die durchschnittliche Schlafdauer lag zwischen sechs und neun Stunden. Das Licht wurde zwischen 22 und 23 Uhr abends gelöscht und die Patienten wurden ca. zwischen 6 und 7 Uhr morgens geweckt.

19 16 Die Blutentnahmen wurden mithilfe einer Venenverweilkanüle durchgeführt, um die Patienten möglichst wenig zu stören. In der zweiten Nacht wurde eine Titration durchgeführt um den minimal notwendigen CPAPDruck festzustellen. Das Ziel bestand darin, den pathologischen AHI auf ein normales Maß von < 5/h zu reduzieren. Zusätzlich wurde die genaue Körperzusammensetzung mittels DXA (Lunar Prodigy TM) bestimmt, da sie einen weiteren möglichen Einflussparameter darstellt. Vor Entlassung wurden die Patienten angewiesen, die CPAPTherapie regelmäßig jede Nacht für mindestens sechs Stunden anzuwenden, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Um die Anwendung der CPAPTherapie zu überprüfen, wurden die eingebauten Datenspeicher der CPAPGeräte ausgewertet. Dadurch ist es möglich, die Anwendungstage innerhalb der vergangenen drei Monate festzustellen und so die mittlere Anwendungsdauer pro Nacht zu berechnen. 4.2 Probanden Zehn gesunde, freiwillige Probanden (n=9 männlich, n=1 weiblich) ohne Schlafstörungen wurden als Kontrollgruppe angeworben. Sie unterzogen sich den gleichen Untersuchungen wie die Patienten mit einem OSAS (DXA, Blutentnahme, Fragebogen etc.). Um ein OSAS bei den Probanden auszuschließen, wurden sie unter Studienbedingungen mittels Polygraphie untersucht (ApnoeScreen Pro, VIASYS Healthcare GmbH, Leibnizstraße 7, Höchberg, Deutschland). Auch ihnen wurde mithilfe einer Venenverweilkanüle in den vorher beschriebenen Zeitabständen Blut entnommen, um die Plasmaspiegel der Peptide Apelin, Obestatin und Leptin zu bestimmen. Schließlich wurde ein Vergleich der Daten bezüglich der zirkadianen Rhythmik der Fettgewebshormone zwischen den Patienten und der Kontrollgruppe durchgeführt. Alle untersuchten Personen gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ab, und das Studienprotokoll wurde von der örtlichen Ethikkommission genehmigt. Die Blutproben wurden in Röhrchen aus Polypropylen, beschichtet mit EDTA (Ethylendiamintetraacetat/essigsäure), gesammelt und anschließend sofort für 20 min bei 0 C mit Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der klare Plasmaüberstand wurde dann auf Eis gelagert bis die Plasmaspiegel von Apelin, Obestatin und Leptin, wie unten dargestellt, bestimmt wurden.

20 DXAMethode Bei den teilnehmenden Patienten und Probanden wurde die DXAMethode angewendet. Bei der Dual Energy XRay Absorptiometrie (DXA) handelt es sich um eine Methode zur genauen Bestimmung der Körperzusammensetzung. Sie wurde aus der Single bzw. Dual Photon Absorptiometry entwickelt, die man zur Messung des Mineralsalzgehaltes der Knochen verwendete [107]. Heutzutage gilt die DXAMethode als Goldstandard zur Bestimmung der Knochendichte sowie der Fett und Magermasse und sie wurde in Tierexperimenten gegen die chemische CarcassAnalyse validiert [33]. Bei der DXAMethode wird eine Strahlenquelle verwendet, die Röntgenstrahlen mit zwei verschiedenen Energieniveaus aussendet, welche sich beim Durchdringen des Körpers, je nach Gewebeart, vermindern. Die verbleibende Restenergie wir dann mit einem Detektor erfasst. Es wird dabei angenommen, dass das Verhältnis der Abschwächung einer niedrigen Energie zu der einer höheren Energie eine Funktion des Verhältnisses zwischen Fett und Weichteilgewebe innerhalb einer bestimmten Volumeneinheit darstellt [107]. Wie unter anderem von Pietrobelli et al. untersucht wurde, kann mithilfe dieses Modells zwischen Fett, Knochen und fettfreiem Weichteilgewebe unterschieden werden [89]. Die hierfür verwendete Strahlung ist minimal und entspricht gerade einmal 0,1 µgy [75]. Zudem kann die regionale Körperzusammensetzung an Extremitäten und Rumpf bestimmt werden, wobei aber der jeweilige Hydratationszustand der untersuchten Person eine wichtige Rolle spielt und beachtet werden muss, damit keine Fehler entstehen [90]. 4.4 Allgemeines Prinzip des Radioimmunassays Beim Radioimmunassay handelt es sich um ein Verfahren, das 1960 von Rosalyn Yalow und Solomon Aaron Berson entwickelt wurde, um das Hormon Insulin in sehr kleinen Mengen zu messen [135]. Im Jahre 1977 erhielt Yalow dafür den Nobelpreis für Medizin. Das Prinzip dieser Labormethode ist die Kompetition zwischen einem radioaktiv markierten Hormon oder Zytokin und einem Hormon oder Zytokin aus der Probe um eine bestimmte Menge an Antikörpern. Die Menge der Antikörper ist begrenzt und reicht gerade für die Bindung des radioaktiv markierten Stoffes aus. Durch die Zugabe der Probe, die Hormone enthält, werden die radioaktiv markierten Moleküle kompetitiv aus ihrer Bindung verdrängt. Je höher die Hormonkonzentration, desto mehr radioaktiv markierte Moleküle bleiben ungebunden. Mithilfe einer Eichkurve

21 18 kann die Konzentration des unbekannten Stoffes in der Probe bestimmt werden, nachdem die ungebundenen, radioaktiv markierten Moleküle entfernt wurden [96]. 4.5 Protokoll zur Messung der Plasmaspiegel von Apelin Der Serumwert von Apelin wurde direkt mittels eines spezifischen RadioimmunassaySets (RIASets) mit einem Messspektrum von (Human Apelin36 RIA kit, Phoenix Pharmaceuticals, Inc., 330 Beach Road, Burlingame, CA 94010, U.S.A.) bestimmt. Alle Proben und Standards wurden doppelt innerhalb einer Probe untersucht. Ein RIASet enthält Reagenzien für 1 RIARöhrchen. Das 1IPeptid verfällt nach ca. 6 Wochen. Die Lagerung sollte bei 20 C erfolgen. Verwendete Substanzen: RIA Puffer, 50 ml (4fach konzentriert) Standardpeptide, 12.8 µg (lyophilisiertes Pulver) Hasenantiserum, spezifisch für das Peptid (lyophilisiertes Pulver) 1IPeptid, 1.5 μci (lyophilisiertes Pulver) AntiHasen IgG Serum (GAR) der Ziege, 13 ml (lyophilisiertes Pulver) normales Hasenserum (NRS), 13 ml (lyophilisiertes Pulver) Positivkontrolle (lyophilisiertes Pulver) Messprinzip: Der Assay basiert auf der Kompetition der 1IPeptide mit dem Peptid (Standard und Unbekannt) um die Bindung an die begrenzte Anzahl von Antikörpern, die spezifisch für dieses Peptid im Reaktionsgemisch vorhanden sind. In dem Maße wie die Menge vom Standard oder der unbekannten Probe zunimmt, wird die Menge an 1IPeptid, die an den Antikörper binden kann, reduziert. Indem die Menge an gebundenem 1IPeptid als eine Funktion der Konzentration des Peptids gemessen wird, ist es möglich eine Standardkurve zu erstellen, anhand derer die Konzentration des Peptids in der unbekannten Probe bestimmt werden kann. Der Assay benötigt eine Inkubationszeit von zwei Tagen.

22 19 Durchführung: 1. Verdünnen des RIAPuffers mit 150 ml destilliertem Wasser. Der Puffer wird dazu verwendet, alle anderen Bestandteile des Sets zu erstellen und dient auch zur Verdünnung der Proben. 2. Aufbereiten des Standardpeptids mit 1 ml RIAPuffer. Gut vermischen und auf Eis lagern. 3. Aufbereiten des AntiPeptidSerums vom Hasen mit 13 ml des RIAPuffers. Gut vermischen und auf Eis lagern. Die übrigen Reagenzien bis zu ihrer Verwendung in lyophilisiertem Zustand lagern. 4. Aufbereiten der Positivkontrollen mit 1 ml RIAPuffer. Gut vermischen und auf Eis lagern. 5. Aufbereiten der Proben mit RIAPuffer. 6. Vorbereiten folgender Verdünnungsreihe des Standards: Röhrchen Probe Stock Pulver RIA Puffer Standardkonzentration 1.0 ml 12.8 µg/ml 0 10 µl von Stock 990 µl 128,000 A 10 µl von µl 1,280 B 500 µl von A 500 µl 640 C 500 µl von B 500 µl 320 D 500 µl von C 500 µl 160 E 500 µl von D 500 µl 80 F 500 µl von E 500 µl 40 G 500 µl von F 500 µl 20 H 500 µl von G 500 µl 10 Tabelle 1: Standardverdünnungsreihe für ApelinMessung 7. Initiale RIAReaktionen nach unten angegebenem Schema in 12 x 75 mm Röhrchen ansetzen: a) Nummerieren der Röhrchen TC1, TC2, NSB1, NSB2, TB1, TB2 und #7 #22 für die Standards b) Nummerieren der Röhrchen #23, #24 für die Positivkontrollen c) Nummerieren der Röhrchen # bis #1 für die unbekannten Proben d) 200 µl des RIAPuffers in jedes NSBRöhrchen pipettieren e) 100 µl des RIAPuffers in jedes TBRöhrchen pipettieren f) 100 µl des Standards H bis A in jeweils zwei Röhrchen #7 bis #22 pipettieren g) 100 µl der Positivkontrolle in die Röhrchen #23 und #24 pipettieren h) 100 µl der unbekannten Probe in jeweils zwei Röhrchen ab # aufwärts pipettieren i) 100 µl des primären Antikörpers (AntiPeptid Serum vom Hasen) in alle Röhrchen AUßER in TC und NSBRöhrchen, pipettieren

23 20 j) Inhalte aller Röhrchen gut mischen k) Alle Röhrchen verschließen und bei 4 C für Stunden inkubieren 8. Aufbereiten der 1IPeptide mit 13 ml des RIAPuffers und gut vermischen, um die TracerLösung mit einer Konzentration von 8,000 10,000 cpm/100 µl herzustellen. 9. Hinzufügen von 100 µl der TracerLösung in jedes Röhrchen und gut mischen. 10. Alle Röhrchen verschließen und bei 4 C für Stunden inkubieren. 11. Aufbereiten des AntiHasen IgGSerums der Ziege (GAR) mit 13 ml RIAPuffer. 12. Aufbereiten des normalen Hasenserums (NRS) mit 13 ml des RIAPuffers. 13. Hinzufügen von 100 µl GAR und 100 µl NRS zu jedem Röhrchen außer zu den TCRöhrchen, gut vermischen und bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubieren. 14. Hinzufügen von 500 µl RIAPuffer zu jedem Röhrchen außer zu den TCRöhrchen und gut vermischen. 15. Alle Röhrchen (außer TCRöhrchen) mit 3,000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei 4 C zentrifugieren. 16. Sofort nach der Zentrifugierung vorsichtig den gesamten Überstand aspirieren. Nicht den Inhalt der TCRöhrchen aspirieren! 17. Verwendung eines GammaZählers, um die Zerfälle pro Minute (cpm) des Pellets zu bestimmen. Berechnung: 1. Mithilfe des cpmwertes wird das durchschnittliche NSB ebenso wie das TB berechnet und jeweils so gekennzeichnet. 2. Um Bₒ zu bestimmen wird folgende Gleichung angewendet: Bₒ = TB NSB. 3. Um das Verhältnis B/Bₒ (%) für die gepaarten Standards und die unbekannten Proben zu bestimmen, wird folgende Berechnung verwendet: a) Beispiel für Standard H: B/Bₒ (%) = (durchschnittlicher cpm Standard H) (NSB) x 100% Bₒ

24 21 b) Die Standards G bis A (Röhrchen #9 #22), die Positivkontrollen (Röhrchen #23 und #24) und die unbekannten Proben (Röhrchen # bis zu #1) werden so gehandhabt wie für Standard H dargestellt. 4. Auf Millimeterpapier wird B/Bₒ (%) (in Dezimalskala) gegen die Standardpeptidkonzentrationen (in logarithmischer Skala) aufgetragen: a) Die Konzentrationen der Standards H bis A ( ) werden auf der XAchse eingezeichnet (in logarithmischer Skala). b) Die Werte für B/Bₒ (%) (0 100 %) werden auf der YAchse eingezeichnet (in Dezimalskala). c) Der entsprechende Wert für B/Bₒ (%) für jede Standardkonzentration wird exakt über dem zugehörigen Punkt auf der XAchse aufgetragen und die Punkte werden zu einer Kurve verbunden. 5. Bestimmung der Peptidkonzentration in einer unbekannten Probe: a) Mithilfe der B/Bₒ (%)Werte, die für jede unbekannte Probe berechnet wurden, wird der Schnittpunkt mit der gezeichneten Kurve gesucht. b) Die korrespondierende Koordinate auf der XAchse entspricht der Peptidkonzentration () in der untersuchten Probe. c) Um die Menge des Peptids in der Originalprobe zu bestimmen, wird die Konzentration der untersuchten Probe mit dem Verdünnungsfaktor, der zum Aufbereiten der Probe verwendet wurde, multipliziert. 4.6 Protokoll zur Messung der Plasmaspiegel von Obestatin Die peripheren Plasmaspiegel von Obestatin wurden mithilfe eines handelsüblichen RadioimmunassaySets mit einem Messspektrum von (Human Obestatin RIA kit, Phoenix Pharmaceuticals, Inc., 330 Beach Road, Burlingame, CA 94010, U.S.A.) bestimmt. Alle Proben und Standards wurden doppelt innerhalb einer Probe untersucht. Das RIASet für die Messung von Obestatin enthält dieselben Reagenzien wie für die Messung von Apelin und die verwendeten Substanzen entsprechen sich. Auch das Messprinzip ist identisch (siehe dazu 3.5 ). Die Durchführung ist ähnlich und unterscheidet sich lediglich in folgenden Punkten:

25 22 Durchführung: Schritte 1 5 : siehe Vorbereiten folgender Verdünnungsreihe des Standards: Röhrchen Probe RIA Puffer Standardkonzentration Stock Pulver 1.0 ml 12.8 µg/ml 0 10 µl von Stock 990 µl 128,000 A 50 µl von µl 6,400 B 500 µl von A 500 µl 3,200 C 500 µl von B 500 µl 1,600 D 500 µl von C 500 µl 800 E 500 µl von D 500 µl 400 F 500 µl von E 500 µl 200 G 500 µl von F 500 µl 100 H 500 µl von G 500 µl 50 Tabelle 2: Standardverdünnungsreihe zur ObestatinMessung 7. Initiale RIAReaktionen nach unten angegebenem Schema in 12 x 75 mm Röhrchen ansetzen: a) Nummerieren der Röhrchen TC1, TC2, NSB1, NSB2, TB1, TB2 und #7 #22 für die Standards b) Nummerieren der Röhrchen #23, #24 für die Positivkontrollen c) Nummerieren der Röhrchen # bis zu #1 für die unbekannten Proben d) 300 µl des RIAPuffers in jedes NSBRöhrchen pipettieren e) 200 µl des RIAPuffers in jedes TBRöhrchen pipettieren f) 200 µl des Standards H bis A in jeweils zwei Röhrchen #7 bis #22 pipettieren g) 200 µl der Positivkontrolle in die Röhrchen #23 und #24 pipettieren h) 200 µl der unbekannten Probe in jeweils zwei Röhrchen ab # aufwärts pipettieren i) 100 µl des primären Antikörpers (AntiPeptid Serum vom Hasen) in alle Röhrchen AUßER in TC und NSBRöhrchen pipettieren j) Inhalt aller Röhrchen gut mischen k) Alle Röhrchen verschließen und bei 4 C für Stunden inkubieren Schritte 8 17: siehe 3.5 Berechnung: Schritte 1 5 entsprechen dem Prinzip bei der ApelinMessung

26 Protokoll zur Messung der Plasmaspiegel von Leptin Die Plasmaspiegel von Leptin wurden mit einem handelsüblichen RadioimmunassaySet (Human Leptin RIA kit, Milipore Corporation, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821) bestimmt. Die Sensitivitätsgrenze lag bei 0,5 ng/ml. Alle Proben und Standards wurden doppelt innerhalb einer Probe untersucht. Ein Set reicht für die Bestimmung von 0 Röhrchen aus. Alle Reagenzien sollten für eine kurzzeitige Lagerung auf 2 bis 8 C gekühlt werden. Für eine Lagerung, die länger als 2 Wochen dauert, sollten sie bei unter 20 C eingefroren werden. Verwendete Substanzen: AssayPuffer, 40 ml/ampulle Antiserum: Antisensitives humanes Leptinserum vom Meerschweinchen in AssayPuffer, 26 ml/ampulle, gebrauchsfertig humanes 1ILeptin, 27 ml/ampulle nach Aufbereitung, lyophilisiertes Pulver Hydratisierungspuffer: AssayPuffer mit normalem IgG vom Meerschweinchen als Trägersubstanz um das humane 1ILeptin aufzubereiten, 27 ml/ampulle, gebrauchsfertig Standards: gereinigtes, rekombinantes humanes Leptin in AssayPuffer, 1ml/Ampulle, gebrauchsfertig Qualitätskontrollen 1 & 2: gereinigtes, rekombinantes humanes Leptin in AssayPuffer, 1 ml/ampulle Reagenz für Präzipitation: AntiMeerschweinchen IgG Serum der Ziege, 260 ml/ampulle, gebrauchsfertig, auf 4 C kühlen Durchführung: Tag 1: µl des AssayPuffers werden in die NSBRöhrchen pipettiert (34). 200 µl des AssayPuffers werden in die ReferenzRöhrchen (56) pipettiert. 100 µl des AssayPuffers werden in alle Röhrchen ab 7 aufwärts pipettiert µl des Standards, der Qualitätskontrollen und jeder Probe werden doppelt in die Röhrchen pipettiert (siehe nachfolgende Tabelle).

27 µl des sensitiven humanen LeptinAntikörpers in alle Röhrchen außer den TCRöhrchen (12) und den NSBRöhrchen (34) pipettieren, gut mischen und für Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Tag 2: µl des humanen 1ILeptinTracers in alle Röhrchen pipettieren, gut mischen und für Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Tag 3: ml des gekühlten (4 C) Präzipitationsreagenz zu allen Röhrchen außer den TCRöhrchen (12) hinzufügen, gut mischen und für 20 Minuten bei 4 C inkubieren. 6. Für 20 Minuten bei 2,000 3,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. 7. Sofort den Überstand aller zentrifugierten Röhrchen (außer TCRöhrchen 12) abgießen. 8. Inhalte aller Röhrchen mit einem GammaZähler messen. Die Konzentration des sensitiven humanen Leptins in den unbekannten Proben wird anhand statistischer Daten berechnet. Berechnung: Die Berechnung für das sensitive humane Leptin kann von den meisten Gammazählern durchgeführt werden. Die Konzentration in ng/ml des sensitiven humanen Leptins in der unbekannten Probe und in den Kontrollen kann durch Interpolation der Referenzkurve bestimmt werden.

28 Tabelle 3: Flow Chart des Ablaufs bei LeptinMessung

29 26 5. Untersuchungen im Schlaflabor Die Polysomnographien wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der American Thoracic Society [3] und der Deutschen Gesellschaft für Schlafforschung und Schlafmedizin [87, 30] durchgeführt. Die Schlafparameter wurden nach den Kriterien von Rechtschaffen und Kales [98] bestimmt. 5.1 Schlafstadien nach Rechtschaffen und Kales Im Jahr 1967 trafen sich erstmals Schlafforscher unter dem Vorsitz von Alan Rechtschaffen und Anthony Kales, um ein standardisiertes System für die Einteilung der Schlafstadien bei jungen Erwachsenen zu entwickeln [52]. Ein Jahr später wurde ein Manual dazu herausgegeben, und von diesem Zeitpunkt an waren diese Kriterien über 40 Jahre lang die einzige anerkannte Methode zur Bestimmung der Schlafstadien [81] wurden diese Definitionen nach einem Auftrag der American Academy of Sleep Medicine (AASM) überarbeitet und verändert bzw. ergänzt [56]. Im Manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep stages of human subjects von Rechtschaffen und Kales [98] wurden folgende minimalen Anforderungen für die PSG empfohlen: Elektroenzephalographie (EEG) Ableitung mit den Programmen C4 A1 bzw. C3 A2 Elektrookulographie (EOG) Elektromyographie (EMG) Papierschreibgeschwindigkeit nicht unter 10 mm/s Zeitkonstante nicht unter 0,3 s Filter unter 20 Hertz gesondert vermerken Empfindlichkeit zwischen 7,5 und 10 mm/50 µv Elektrodenübergangswiderstände nicht größer als 10 kω zu Beginn der Ableitung Auch die Schlafstadien wurden definiert und werden im Folgenden in leicht gekürzter Form beschrieben: a) Schlafstadium W: Wachzustand mit individuellen Grundrhythmen und meist mit AlphaWellen.

30 27 b) Movement Time (MT): Epochen, die vor oder nach der Schlafaktivität auftreten und in mehr als 50 % der Fälle durch muskuläre Artefakte oder andere Bewegungen gestört sind. Sie sind abzugrenzen von Bewegungsarousals, mit erhöhter EMG sowie veränderter EEG oder EOGAktivität. Diese zeigen einen möglichen Schlafstadienwechsel an. c) Stadium 1: Besitzt eine flache, unregelmäßige Aktivität und findet sich meist beim Einschlafprozess im Zusammenhang mit langsamen Augenbewegungen, aber auch im Schlaf nach Körperbewegungen. Es kommt zu Amplituden von bis zu 75 µv im EEG, bei denen auch Vertexwellen (bis zu 200 µv) zu beobachten sind. Die Amplitude des EMG ist geringer als im Stadium W, das EEG wird langsamer. d) Stadium 2: Durch KKomplexe und/oder Schafspindeln gekennzeichnet, keine langsame DeltaAktivität. Ein KKomplex besteht aus einer initialen negativen steilen Komponente, an die sich eine langsame, biphasische, negativpositive Welle anschließt. Eine 12 14/sAktivität kann als Reaktion auf einen Reiz oder spontan auftreten. Eine Schlafspindel ist ein Muster von 12 bis 14/s mit einer stabilen Frequenz. e) Stadium 3: Bei mindestens 20 % der Epoche findet sich eine Aktivität von 2/s oder langsamer mit einer Amplitude über 75 µv. Schlafspindeln können auftreten, sind aber nicht obligat. f) Stadium 4: Mehr als die Hälfte der Epoche weist eine 2/sAktivität oder auch weniger auf. Die Amplituden betragen 75 µv. Besonders typisch sind DeltaWellen, Schlafspindeln können auftreten. g) Stadium REM: Es kommt zu einer flachen, unregelmäßigen EEGAktivität gemeinsam mit schnellen Augenbewegungen (REM = rapideye movement). Grundaktivität erinnert an Stadium 1 oder W. Sägezahnwellen, vor allem über dem Vertex und den vorderen Hirnabschnitten, können vorhanden sein. Das EMG zeigt in den jeweiligen Ableitungen die geringste Amplitude in der gesamten Nacht. Gerade in der ersten REMEpoche kommt es oft zur Vermischung mit Schlafspindeln. Daher wurden Kriterien erarbeitet, um diese zu unterscheiden und eine genaue Einteilung des Schlafstadiums, ebenso wie für Beginn und Ende der REMPeriode, vorzunehmen.

31 28 EEGMuster Merkmale AlphaWellen 8 13 Hz, in okzipitaler Region generiert, crescendodecrescendo Erscheinungsbild ThetaWellen 3 7 Hz, in zentraler VertexRegion generiert, häufigstes Muster im Schlaf DeltaWellen 0,5 2 Hz, vor allem in frontaler Region generiert, Amplitude > 75 µv Schlafspindeln Hz, in zentraler VertexRegion generiert, 0,5/sSpindeln in 6 7 Zyklen, tritt auf im Schlafstadium 2 KKomplex initial negative steile Komponente mit anschließender langsamer biphasischer negativpositiver Welle, vor allem in zentraler VertexRegion generiert, im Schlafstadium 2, mit oder ohne Stimulus Tabelle 4: EEGMuster während der Schlafphasen Bei einer erneuten Revision dieser Kriterien durch die AASM im Jahr 2007 wurden das Schlafstadium 3 und 4 in ein gemeinsames Stadium N3 ( slow wave sleep ), auch als Tiefschlaf bezeichnet, überführt, während die Stadien 1 und 2 in N1 und N2 umbenannt wurden [55]. Schlafstadium Wachstadium 1 bzw. N1 EOG Augenblinzeln (0,5 2 Hz),Lesebewegungen der Augen langsame rollende Augenbewegungen EMG normaler oder hoher Tonus der Kinnmuskulatur relativ hoher submentaler Tonus Weitere Merkmale >50 % AlphaWellen >50 % ThetaWellen (47 Hz), scharfe VertexWellen 2 bzw. N2 hoher submentaler ThetaWellen (47 Tonus Hz), episodisch KKomplexe und Schlafspindeln 3 und 4 bzw. N3 leichte Reduktion >20 % Deltades submentalen Wellen, Amplitude Tonus mind. 75 µv REMStadium schnelle Atonie bzw. Sägezahnwellen, Augenbewegungen niedrigster niedrige submentaler Amplituden, Tonus im Verlauf Frequenzen wie im des Schlafs Wachstadium Tabelle 5: Übersicht über die Schlafstadien und ihre Charakteristika

32 29 Abb. 10: Definition der Schlafstadien und des Wachzustandes anhand der Parameter EEG, EMG und EOG Quelle: [133] 5.2 Polysomnographie Die Polysomnographie ist heutzutage der Goldstandard in der Diagnostik schlafbezogener Atemstörungen. Im Jahr 2005 erschien ein Update bezüglich der Indikationen für die Durchführung einer PSG und anderer damit verbundener Untersuchungen [99]. Der Vorteil liegt darin, dass es sich um ein standardisiertes Untersuchungsverfahren handelt, bei dem die Rahmenbedingungen konstant gehalten werden, und so die Ergebnisse vergleichbar sind. Bei allen für diese Arbeit untersuchten Patienten wurde eine PSG durchführt, wobei sie in einer Nacht für mindestens 6 Stunden im Schlaflabor am Monitor überwacht wurden.

33 30 Es wurden folgende Parameter bestimmt: EEG Bilaterales EOG Submentales EMG EKG Thorakale und abdominelle Bewegungen Atemfluss über Nase, gemessen mit einem oronasalen Thermistor während der diagnostischen PSG und mit einem Pneumotachographen während der CPAPUntersuchungen OxyhämoglobinSättigung, bestimmt mittels Fingeroxymeter (Microspan 3040G TM, Jaeger and Toennies, Würzburg, Deutschland) Videoaufzeichnung und Aufnahme des Schnarchens mit einem Mikrophon EEG EOG EOG EMG EKG Flow Thorax Abdomen O2Sättigung Schnarchen Abb. 11: Beispiel für eine diagnostische Polysomnographie bei OSAS Quelle: [142] EEG: Es wurden jeweils sechs Elektroden (C3, C4, A1, A2, O1 und O2) und eine Erdungselektrode am Kopf der untersuchten Personen angebracht, um die elektrische Aktivität des Gehirns zu messen. Aus diesen Ableitungen wurden die jeweiligen Schlafstadien im Lauf der Nacht bestimmt.

34 31 EOG: Eine Elektrode wurde lateral über dem rechten Auge und eine andere lateral unter dem linken Auge angebracht. Diese Ableitungen detektierten die Augenbewegungen während des REMSchlafstadiums. EMG: Drei Ableitungen wurden am Kinn angebracht. Dies diente zum Anzeigen von submentalen Muskelbewegungen während des Schlafs. EKG: Es wurden auch die üblichen EKGAbleitungen an der Brust der Patienten befestigt, um die Herzfrequenz während des Schlafs zu überwachen, und um festzustellen, ob der Abfall der Sauerstoffsättigung während der Apnoephasen zu Herzrhythmusstörungen führte. Thorakale und abdominelle Bewegungen: Zwei Bänder, zusammengehalten von einem Messfühler aus PiezoKristall, wurden an den Patienten angebracht. Eines der Bänder wurde um den Brustkorb, auf Höhe der Mamillen, und das andere um den Bauch geschlungen. Damit konnten die Exkursionen von Thorax und Abdomen während des Atemvorgangs bestimmt werden. Durch die Bewegungen von Thorax bzw. Abdomen wurde der Messfühler gedehnt und sendete wiederum Impulse zum Aufnahmegerät. Gemeinsam mit der Messung des Atemflusses konnten so die Apnoen charakterisiert werden. Atemfluss: Ein Thermistor wurde unterhalb der Nase der Patienten angebracht. Dadurch konnte festgestellt werden, wie viel Luft in die Atemwege der Patienten gelangte und wie viel Luft sie wieder ausatmeten. Dies wurde in Form eines Signals an ein Aufnahmegerät gesendet und diente dazu, das Auftreten und das Ausmaß der apnoeischen Phasen zu bestimmen. OxyhämoglobinSättigung: Die Sauerstoffsättigung im Blut wurde mit einem Oxymeter bestimmt, der am Finger der Patienten oder alternativ am Ohrläppchen angebracht wurde. Hiermit wurde der Sättigungsabfall während der episodisch auftretenden Hypo und/oder Apnoen bestimmt. Videoaufzeichnung und Aufnahme des Schnarchens: Durch die Videoaufzeichnung des Schlafs der Patienten konnte ein Abgleich mit den jeweiligen Ergebnissen der Einzeluntersuchungen vorgenommen werden, um festzustellen, ob abnorme Resultate durch ein tatsächliches Arousal, eine wache Episode oder durch normale Bewegungen während des Schlafs zustande kamen. Die Aufnahme des Schnarchens diente ebenfalls dazu, die Arousals der Patienten zu verifizieren.