2. Lernaufgabe: Das Lac-Operon

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1 2. Lernaufgabe: Das Lac-Operon Zielstufe: 11. Schuljahr, Gymnasium Lektionsinhalt: Im 1. Teil lernen die SuS die prokaryontische Genregulation anhand des Lac-Operons kennen. Im 2. Teil bekommen die SuS einen Einblick, wie ein Teil des Lac-Operons als Selektionshilfe in der Molekularbiologe beim Klonieren eines Genes in ein Plasmid dient. Vorwissen: Die SuS kennen den Aufbau und Vielfalt der Bakterien. Sie verstehen den Ablauf der DNA-Replikation, sowie Transkription und Translation in den Zellen. Sie wissen, was Enzyme sind und kennen ihre Wirkungsweise. Sie sind mit den Grundlagen der Gentechnik vertraut. Lernziele: Die SuS kennen das Jacob-Monod-Modell Die SuS kennen die negativen und positiven Genregulation am Beispiel des Lac-Operons Die SuS kennen die Blau-Weiss Selektion in der Gentechnik Sozialform: 1 Teil Einzelarbeit, 2. Teil Partnerarbeit Material: Lernaufgabe (1 pro Schüler) Labormaterialien (siehe Experiment) Zeitaufwand: Total 50 Minuten 5 min Einführung durch die LP 35 min Bearbeitung der Lernaufgabe 10 min Labor 1

2 1. Teil Die prokaryontische Genregulation Weil die Umwelt sich immer ändert, brauchen Bakterien nicht die ganze Zeit die selben Enzyme. Wenn Nahrung vorhanden ist, muss das Bakterium Verdauungsenzyme herstellen. Sobald eine bestimmte Aminosäure knapp wird, muss es diese verstärkt synthetisieren, usw. Im Jahre 1961 zeigten die französischen Mikrobiologen François Jacob und Jacques Monod dass E. coli in der Lage ist, die Expression seiner Gene zu regulieren. Sie beobachteten, dass die Gene für den Stoffwechsel, Strukturgene, auf einem Chromosom gruppiert sind und zur gleichen Zeit transkribiert werden. Deshalb entwarfen Jacob und Monod das Operon-Model, um die Genregulation bei Prokaryonten zu erklären. Sie bekamen später den Nobelpreis für ihre Forschung. Ein Operon besteht typischerweise aus folgenden Elementen: Promotor: Eine kurze DNA-Sequenz, wo die RNA-Polymerase zuerst andockt, um mit der Transkription der gruppierten Gene beginnen. Operator: Ein kurzer DNA Abschnitt, an dem ein aktiver Repressor bindet. Wenn ein aktiver Repressor an einen Operator bindet, kann sich die RNA-Polymerase nicht an den Promotor binden und die Transkription kann nicht stattfinden. So kontrolliert der Operator die Transkription der Strukturgene. Strukturgene: Eines bis mehrere Gene die für Enzyme in einem Stoffewechselweg codieren. Das Regulatorgen trägt die Information für das Regulatorprotein (Repressor). Es kann in der Nähe des Operons, aber auch an einer anderen Stelle des Genoms liegen. Das Lac-Operon: Regulation induzierbarer Enzyme Das wohl am besten verstandene System zur Regulation der Enzymsynthese ist das Lac-Operon von E. coli. Der Stoffwechsel der Bakterien ist bemerkenswert effizient. Wenn keine Notwendigkeit für bestimmte Proteine oder Enzyme besteht, sind die Gene dazu inaktiviert. 2

3 Zum Beispiel wenn keine Lactose (Milchzucker) vorhanden ist, besteht auch keine Notwendigkeit, die Gene für die Lactose abbauenden Enzyme zu exprimieren. Aber wenn keine Glucose als Energiequelle verfügbar ist und Lactose im Umgebungsmedium vorhanden ist, beginnt E. coli die für den Stoffwechsel der Laktose notwendigen Enzyme herzustellen. Diese Enzyme werden codiert durch drei Gene: Ein Gen für das Enzym β-galactosidase, welches Lactose in seine beiden Bestandteile Glucose und Galactose spaltet, ein zweites Gen kodiert für die Permease, welches sich in die Zellmembran der Bakterienzelle setzt und für den Transport der Lactose in die Zelle hinein verantwortlich ist; und ein drittes Gen kodiert für ein Enzym namens Transacetylase, dessen Funktionen noch nicht endgültig geklärt sind. Negative Kontrolle: Mit Hilfe von Repressoren wird am Operator darüber entschieden, ob die Transskription stattfindet. a) Lactose abwesend, Repressor aktiv, Operon abgeschaltet Der Lac-Repressor ist inaktiv und blockiert in Abwesenheit von Lactose durch seine Bindung an den Operator das Lac-Operon b) Lactose anwesend, Repressor inaktiv, Operon angeschaltet. Allolactose, ein Isomer der Lactose, dereprimiert das Operon durch Inaktivierung des Repressors. Dadurch wird die Bildung der Enzyme des Lactose-Stoffwechsels induziert. 3

4 Positive Kontrolle: das Katabolit-Aktivator-Protein Die RNA-Polymerase hat nur eine niedrige Affinität für den Promotor des Lac-Operons. Diese wird durch die Wirkung des Katabolit-Aktivator-Protein (camp-rezeptor-protein (CRP; manchmal auch CAP genannt) erhöht, das an die DNA bindet, wenn sie mit zyklischen AMP (camp) verbunden sind, und dessen Konzentration in der Zelle umgekehrt proportional zur Glucosekonzentration ist a) Liegt Glucose in niedriger Konzentration vor, so aktiviert camp das CRP, und das Lac-Operon produziert reichlich mrna für den Lactose-Abbau. b) Befindet sich Glucose im Medium, so ist die campkonzentration niedrig, und CRP ist nicht in der Lage, die Transkription zu stimulieren. Daher wird die Zelle bevorzugt Glucose verstoffwechseln und die dafür vorhandenen Enzyme nützen, auch wenn Lactose zur Verfügung steht. Diese Stoffwechselregulation stellt sicher, das E. coli nur dann die Enzyme für Lactoseabbau herstellt, wenn keine Glucose vorhanden ist. 4

5 Fragen: 1. Was passiert, wenn eine Mutation ein regulatorisches Protein eines reprimierbaren Operons funktionsunfähig macht? 2. Was geschieht, wenn der Glucosespiegel in der Zelle steigt? 3. Ordnen Sie die Bilder und schreiben Sie einen Satz dazu. 5

6 2. Teil: Blau-Weiss Selektion: LacZ in der Anwendung Plasmide sind zirkuläre, doppelsträngige DNA-Moleküle, die sich unabhängig vom bakteriellen Genom in Bakterien vermehren können. Die Minimalausstattung eines Plasmids besteht aus einem Replikationsstart, mit dem das Plasmid vermehrt werden kann, einem Selektionsgen (meist ein Antibiotikaresistenzgen) und eine Klonierungsstelle, an der fremde DNA eingebaut werden kann. Die Möglichkeit, DNA in ein Plasmid hineinzuklonieren, macht sie zu wichtigen Werkzeugen in der Molekularbiologie. Als Beispiel der Anwendung sei hier das Hormon Insulin erwähnt. Menschen, die an der Zuckerkrankheit (Diabetes) leiden, müssen Insulin aufnehmen, da die Bauchspeicheldrüse zu wenig oder gar kein Insulin produziert. Früher wurde Insulin aus der Bauchspeicheldrüse von Schweinen oder Rindern gewonnen. Der Bedarf konnte kaum gedeckt werden. Durch das Einklonieren des Insulin-Gen in ein Plasmid und das anschliessende Einschleusen des Plasmids in ein Bakterium kann der bakterielle Transkriptions- und Translationsapparat das Gen in ein funktionsfähiges Peptid übersetzen. Durch die Klonierung eines DNA-Fragments kann ein Gen über diese Klonierungsstelle deaktiviert werden. Genau dies geschieht bei der Blau-Weiß-Selektion, bei der das lacz-gen, ein Gen der βgalactosidase, durch die Insertion von Fremd-DNA unterbrochen wird. LacZ kodiert für das Nterminale α-fragment der β-galactosidase, das alleine keine β-galactosidase-aktivität besitzt. Bringt man es aber zusammen mit dem ebenfalls inaktiven C-terminalen ω-fragment, wird diese Aktivität auf wundersame Weise wieder hergestellt, ein Vorgang, der als α-komplementation bezeichnet wird. Bakterienkolonien, in denen das LacZ-Gen durch die Insertion eines DNA-Fragments zerstört ist, bleiben nach Inkubation mit IPTG und X-Gal weiß, wahrend Klone ohne Insertion das α-fragment exprimieren und sich blau färben. Die Sache funktioniert allerdings nur, wenn man auch einen Bakterienstamm verwendet, der das ω-fragment exprimiert. Man sollte sich im Zweifelsfall davon überzeugen, dass die Bakterien das entsprechende Gen besitzen es trägt die Bezeichnung LacZΔM15. Durchführung im Labor: Führen Sie das folgende Experiment zu zweit durch. 1. Sie bekommen 2 Reaktionsgefässe mit jeweils einem transformierten Plasmid mit Insert und einem Plasmid ohne Insert. (d.h. Die Plasmide wurde schon in die Zellen eingeschleust) 2. Beschreiben Sie die Petrischale und plattieren Sie die jeweils einen Ansatz auf jeweils eine Platte (Die Petrischalen wurden von der Lehrperson gegossen). 3. Stellen Sie die Petrischalten in den Inkubator. Die Petrischalen werden über Nacht inkubiert. Die Lehrperson nimmt die Petrischalen anschliessend aus dem Inkubator und stellt sie in den Kühlschrank. 6

7 In der Nächsten Biologiestunde können sie die Platten anschauen und folgende Frage beantworten: Erklären Sie die blauen und weissen Kolonien. In welchem Reaktionsgefäss befindet sich die Fremde DNA? Anhang Praktikum: POPINF ohne Insert mit lacz popinf mit Insert ohne lacz 1. Add 1-2µl expression plasmids per tube competent cells.(you may use less if you use a standard Qiagen spin column due to the much higher concentration of plasmid obtained). 2. Incubate on ice for 30 minutes. 3. Heat-shock the cells for 30 seconds at 42 C (you may need to extend this if using a heating block). 4. Return the cells to ice for 2 minutes. 5. Add 450µl of GS96 (plus glycerol)or LB (no antibiotic selection!) per tube. The use of GS96 here allows the cells to recover without shaking and this enables a concentrated aliquot of cells to be pipetted from the bottom of the tube for plating. 6. Transfer to 37 C incubator (shaking is not required if GS96 media is used) and incubate for 1 hour. 7. Plate on LB Agar (10g peptone, 5g yeast extract, 5 NaCl and 15g Agar per liter) supplemented with Antibiotic, X-Gal and IPTG (dilute the sterile Antibiotic 50mg/ml stocks 1:1000, dilute the 20% X-Gal [in DMF] stock 1:1000 and dilute the sterile IPTG 500mM stock 1:500 in warm agar before pouring-> 10 ml per small petri dish). 8. Plate 10µl of cells, shake vigorously by hand, and allow at least minutes for the plates to dry off before turning. 9. Omnimax 2T with LacZΔM ppoinf with insert and popinf without insert (not digested with KpnI and Hind III) 7

8 Lösungen: 1. Was passiert, wenn eine Mutation ein regulatorisches Protein eines reprimierbaren Operons funktionsunfähig macht? Die Strukturgene werden stets transkribiert. 2. Was geschieht, wenn der Glucosespiegel in der Zelle steigt? Wenn der Glucosespiegel in der Zelle steigt, fällt gleichzeitig die camp Konzentration, und ohne camp löst sich das CRP vom Operon. Weil das CRP inaktiv ist, geht die Transkription auf ein niedriges Niveau zurück, sogar in Anwesenheit von Lactose. 3. 8

9 Literatur: Biologie, N.A. Campbell, 6. Auflage Genetik in Cartoons, L. Gonick, M. Wheels, 4. Auflage Der Experimentator Molekularbiologie/Genomics, C. Mülhart, 6. Auflage Protokoll, blue/white selection, M. Bumann 9