The Iceberg Concept of Infection
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- Annegret Heintze
- vor 8 Jahren
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1 The Iceberg Concept of Infection Zelluläre Reaktion Zelltod Zytopathischer Effekt (CPE) Transformation Virusvermehrung ohne erkennbare Schäden oder unvollständige Virusreifung Exposition ohne Rezeptorbindung oder Penetration Reaktion des Wirtes Tod Schwere Erkrankung Moderate oder leichte Symptome Asymptomatische Infektion Exposition ohne Infektion
2 Infektion Ansteckung (lat. inficere = hineinbringen), Haften, Eindringen und Vermehrung von Erregern in einem Wirt Monoinfektion - Mischinfektion - Superinfektion z.b. Primärinfektion mit Influenzaviren (Virusgrippe), Sekundärinfektion mit Staphylokokken oder Streptokokken Reinfektion erneute Infektion nach Ausheilung bei geringer Ausprägung einer Immunreaktion
3 Allgemeine Eigenschaften von Krankheitserregern Infektion Anhaften, Eindringen und Vermehrung eines Krankheitserregers (Mischinfektion, Superinfektion, Reinfektion) Pathogenität Grundeigenschaft einer Erregerspezies nach Infektion des Wirtes Krankheitssymptome zu verursachen Virulenz Summe aller krankmachenden Eigenschaften stark variabel, LD 50 Attenuierung Virulenzminderung, Abschwächung: Erhalt von Immunogenität und Fähigkeit zur Vermehrung Organtropismus charakteristisch für Viren breite Wirtsspezifität, enge Organspezifität:Tollwutvirus enge Wirtsspezifität, breite Organspezifität: HSV
4 Pathogenität - Virulenz - Infektionskrankheit Erreger Wirt Spezies apathogen resistent Spezies pathogen nicht resistent (empfänglich) Stamm avirulent nicht anfällig Individuum virulent Infektion anfällig (Disposition) Infektionskrankheit
5 Infektionsverlauf Nicht jede Infektion führt zu einer Infektionskrankheit. Die meisten Infektionen verlaufen klinisch inapparent. Klinisch apparente Infektionen werden als Infektionskrankheit bezeichnet.
6 Formen der Infektion Akute Infektion Viruselimination; zeitlich begrenzt, lokal Antikörperbildung Vorkommen sowohl apparent als auch inapparent (subklinisch) Persistierende Infektion keine (vollständige) Viruselimination nach Primärinfektion Latente Infektion: keine Virusproduktion, lebenslange Infektion, Reaktivierung (Rezidiv, Exazerbation) Chronische Infektion: produktiver Replikationszyklus Transformation Immortalisierung, Tumorentstehung
7 Virus-Zell-Interaktion Infektionstyp Virusproduktion Reaktion der Zelle abortiv - keine lytisch ++ Zelltod persistierend temporäre Symbiose produktiv + variabel/alterung latent - keine Transformation -/+ Immortalisierung
8 Interaktion bei Virusinfektionen Virus Wirtsorganismus Immunsystem
9 Konsequenzen der Virusinfektion Direkter Effekt: Destruktion Funktionsverlust Indirekter Effekt: Immunpathologie Autoimmunität
10 Immunantwort MHC Glykoproteine T-Zell-Rezeptor (TCR) Proteine des TCR-Komplexes Präsentation viraler Peptide an Oberfläche infizierter Zellen & APC Erkennung von Fremdantigenen, die von MHC präsentiert werden nicht antigenspezifisch Immunglobuline humorale Immunität
11 Antivirale Immunantwort humoral zellulär B-Lymphozyten Antikörper Bindung Neutralisation T-Helfer-Zellen Bindung an MHC II auf APC Cytokine Immunologisch aktive Zellen Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Bindung an MHC I auf virusinfizierten Zellen Perf., Gran. Fas/ FasL Apoptose
12 Aktivierter T-Lymphozyt FasL - Gen Perforin/ Granzym TCR MHC / Viruspeptid Virusinfizierte Zelle Apoptose
13 Antigenerkennung durch T-Zellen
14 Verlaufsformen/Typen viraler Infektionen Akute Infektion * Immunität z.b. Masern Viruselimination Reinfektion z.b. Influenza * Latente Infektion * Chronische Infektion z.b. Hepatitis C * Slow Virus Infektion * z.b. Masern-SSPE Reaktivierung z.b. Herpesviren * * Virus kann isoliert werden * nur Nukleinsäure kann nachgewiesen werden
15 Kriterien für persistierende Virusinfektionen 1. Nicht-lytische Virus-Wirt-Interaktion 2. Versagen der Erkennung von viralen Proteinen durch das Immunsystem des Wirtes
16 Persistenz - Unterlaufen der Immunabwehr Antigenshift der Glykoproteine Neutralisierende Antikörper blockierende Antikörper ( Unwirksamkeit neutralisierender Antikörper) AK-vermittelte Zytotoxizität limitierte Genexpression (HSV) Verlust von Glykoproteinen (Masern) Antigenshift (Influenza) Zytotoxische T-Lymphozyten Infektion von Zellen ohne MHC (neurotrope Viren) Suppression MHC-I (Adenoviren) Delokalisation von MHC (HIVnef)
17 Faktoren, die an der Entstehung persistierender Virusinfektionen beteiligt sind Virale Eigenschaften Mutationen Integration der viralen Nukleinsäure Tropismus Regulation der MHC-Genexpression Zelluläre Eigenschaften Differenzierungsgrad Interferonsynthese Enzymdefekte Immunreaktionen Immundefekte Antigene Modulation Selektion von Virusvarianten
18 Spektrum virusinduzierter Erkrankungen Akute Infektionen Masern, Mumps, Röteln Poliomyelitis, Hepatitis A und E, Windpocken, Virusgrippe, Erkältungskrankheiten Chronische Infektionen produktiv Hepatitis B und C, HIV latent HSV, VZV, HIV langsam (slow virus) SSPE, PML Virusinduzierte Tumoren Cervixkarzinom, Papillome, Nasopharynxkarzinom, Lymphome
19 Virus-Wirt-Interaktion Akute Infektion Lytische Infektion Chronische Infektion Persistierende Infektion Produktiv Latent Reaktivierte Infektion Virämie Transformierende Infektion
20 Transformation z.b. HPV (Papillomiren) Slow Virus Disease z.b. SSPE Virale Pathogenese Zytopathogenität z.b. Poliovirus Immunpathogenese spezifisch Zerstörung virus- Infizierter Zielzellen durch CTL z.b. HBV unspezifisch Freisetzung von Zytokinen Fieber z.b. Adeno- & Masernvirus
21 Pathogenität - Virulenz - Infektionskrankheit Erreger Wirt Spezies apathogen resistent Spezies pathogen nicht resistent (empfänglich) Stamm avirulent nicht anfällig Individuum virulent Infektion anfällig (Disposition) Infektionskrankheit
22 Weitere Begriffsbestimmungen Infektiosität Fähigkeit von pathogenen Erregern, in einen Wirt einzudringen, sich dort zu vermehren und sich und weiter auszubreiten. Lebende und tote Vektoren (Träger), die derartige vermehrungsfähige Erreger mit sich tragen, bezeichnet man als infektiös. Kontagiosität Fähigkeit eines Erregers von einem infizierten Organismus direkter Kontakt auf nicht infizierte Organismen überzugehen und eine Infektion auszulösen.
23 Weitere Begriffsbestimmungen Kontagionsindex Richtgröße zur Quantifizierung einer Erkrankungswahrscheinlichkeit an einer Infektion. Epidemiologische Größe, die die Anzahl der tatsächlich Erkrankten angibt, bezogen auf 100 nichtimmune Exponierte. z.b. für Masern, Pocken, Varizellen % für Poliomyelitis (und Diphtherie) % Manifestationsindex Anzahl der manifest Erkrankten/Anzahl der Infizierten, Empirisch hoch >90% (z.b. Masern, Windpocken, MKS) mittel >1, <90% (z.b. Röteln, Mumps) niedrig <1% (z.b. Poliomyelitis)
24 Transmission von Viren Horizontal Blutkontakt (HCV, HIV) Speichel (EBV, Mumps) Organe (CMV, HBV) Aerosole ( Masern, Influenza) Arthropoden (FSME, Dengue) Nahrung (HAV, Hantaviren) fäkal-oral (Entero-, Rotaviren) Vertikal Schwangere - Fetus - pränatal (Röteln, CMV) - konnatal (VZV, HBV)
25 Eintrittspforten Respirationstrakt (Tröpfcheninfektion, aerogen) Intestinaltrakt (fäkal-oral) Blut, Blutprodukte (parenteral) Biss- und Stichwunden durch Tiere/Insekten
26 Möglichkeiten des Auftretens von Erregern durch infizierte Organismen in der Umwelt Wege Art der Ausscheidung direkter Weg Nasen- und Rachensekrete (Schleimhäute der Atemwege, des Verdauungstraktes, Speicheldrüsen, Tonsillen) Stuhl/Kot Urin Augensekret Muttermilch Genitalsekrete Haut- und Schleimhautveränderungen indirekter Weg Blut (während Virämie) Lebensmittel Abfälle, Kadaver
27 Koch-Henle sche Postulate Jacob Henle, 1840: Lehre vom lebenden Ansteckungsstoff Präzisierung durch Robert Virchow, Der Erreger muss in jedem Fall bei der entsprechenden Krankheit (mikroskopisch) nachweisbar sein (optischer Nachweis). Der Erreger darf nicht bei Gesunden als zufälliger und nicht pathogener Keim vorkommen. 2. Der Erreger muss sich aus dem Patientenmaterial isolieren und in unbelebten Nährböden fortzüchten lassen (kultureller Nachweis). Dabei darf er seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlieren. 3. Der Erreger muss auch nach Reinzüchtung außerhalb des natürlichen Wirts in der Lage sein, die Krankheit in einem empfänglichen Organismus wieder zu erzeugen (Pathogenitätsnachweis). Die Koch-Henle schen Postulate gelten nur für monokausale Infektionskrankheiten.
28 Koch-Henle sche Postulate 1. Der Erreger muss in jedem Fall bei der entsprechenden Krankheit (mikroskopisch) nachweisbar sein (optischer Nachweis). Der Erreger darf nicht bei Gesunden als zufälliger und nicht pathogener Keim vorkommen. 2. Der Erreger muss sich aus dem Patientenmaterial isolieren und in unbelebten Nährböden fortzüchten lassen (kultureller Nachweis). Dabei darf er seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlieren. 3. Der Erreger muss auch nach Reinzüchtung außerhalb des natürlichen Wirts in der Lage sein, die Krankheit in einem empfänglichen Organismus wieder zu erzeugen (Pathogenitätsnachweis). Gegenbeispiele: zu 1. - klinisch gesunde Träger, Dauerausscheider; - Normalflora mit fakultativ pathogenen Keimen zu 2. - Viren zu 3. - Gewebeschäden / Tumorbildung nicht immer experimentell reproduzierbar - latente und persistierende Virusinfektionen
29 Spektrum virusinduzierter Erkrankungen Akute Infektionen Masern, Mumps, Röteln Poliomyelitis, Hepatitis A und E, Windpocken, Virusgrippe, Erkältungskrankheiten Chronische Infektionen produktiv Hepatitis B und C, HIV latent HSV, VZV, HIV langsam (slow virus) SSPE, PML Virusinduzierte Tumoren Cervixkarzinom, Papillome, Nasopharynxkarzinom, Lymphome
30 Parameter von Virusinfektionen Epidemiologie und Durchseuchung Übertragungswege (Ausbreitung) Inkubationszeit und Manifestationsgrad Reaktionen des Immunsystem Rekonvaleszenz und Immunität bzw. Persistenz - Reaktivierung
31 Pathogenetische Stadien von Virusinfektionen Zelle Adsorption Penetration Uncoating Transkription Translation Assembly Maturation Freisetzung Wirt Viruseintritt in den Wirt Primäre Replikation Virämie Zell- und Gewebstropismus Zell- und Organschäden Immunreaktion Viruspersistenz Slow Virus Disease Infektionskrankheit Inkubationszeit Prodromalstadium Generalisation Organmanifestation Rekonvaleszenz
32 Pathogenese der Poliovirus-Infektion Tag Infektion Darm Pharynx GALT GALT regionale Lymphknoten lymphogen hämatogen Blut-Liquor- Schranke Leber Milz Virusvermehrung in Organen Virämie Fieberhafter Infekt Virusausscheidung im Stuhl Beginn der Antikörper- Synthese Kontrolle der Virusinfektion CSF Meningitis Ausbreitung ins ZNS Enzephalitis Paresen Blut-Hirn- Schranke Nervenzellen 20
33 Pathogenetische Stadien von Virusinfektionen Zelle Infektionskrankheit Adsorption Penetration Uncoating Transkription Translation Assembly Maturation Release Inkubationszeit Prodromalstadium Generalisation Organmanifestation Rekonvaleszenz
34 Schwerpunkte der Medizinischen Virologie Diagnostik und Prophylaxe sog. Kinderkrankheiten, Infektionen der Atemwege HIV, HCV, Viren mit onkogenem Potential Immunsupprimierte Patienten Schwangerschaft Therapie HIV, Hepatitis B und C, Herpesviren, Virusgrippe Viruslast-Bestimmung und Resistenz-Testung Emerging Viruses Filoviren, West-Nil-Virus, Virales Hämorrhagisches Fieber SARS-Coronavirus, H5N1- & H7-Influenzaviren Prion-Erkrankungen (TSE)
35 Aufgaben der Medizinische und der experimentellen Virologie Neue Nachweismethoden PCR, Resistenztestung, Rapid Viral Diagnosis Struktur-Funktions-Untersuchungen Reverse Genetics Enzyme (z.b. Protease-Inhibitoren, Caspase-Aktivierung) Fusion & Intergase Gentherapie und Impfstoffentwicklung Adenovirale, retrovirale, herpesvirale oder AAV-Vektoren DNA-Impfung (HCV, HIV, etc.) Zelluläre Immunität Epidemiologie und Übertragung Reservoir, Vektoren, Impfkampagnen
36 Erregerübertragung Art der Übertragung Medien, Wege, etc. Schmier-, Kontaktinfektionen über Mund, Nase, Auge (fäkal-oral) oder Haut Tröpfcheninfektion (Aerosole) Nasensekret, Speichel parenteral (iatrogen) Blut, Blutprodukte Verletzungen (Haut/Schleimhaut) Stechmücken, Zecken, Sandflöhe, Bisse sexuell Schleimhäute der Genitalien diaplazentar, intrauterin hämatogen - aszendierend Stillen Muttermilch - Kontakt germinativ, transovariell Eier bei Mücken, Zecken, Vögel
37 Virusdiagnostik Zellkultur (Virusisolation) - zytopathischer Effekt in vitro Antigennachweis - in Patientenmaterial - In Zellkultur (nach Isolation) Nukleinsäurenachweis - PCR, LCR, bdna - ISH, Sequenzierung Elektronenmikroskopie Bestimmung von Antikörpern - IgM, IgG, (IgA)
38 Diagnostisches Spektrum der Medizinischen Virologie Direkter Virusnachweis Indirekter Nachweis Virusisolation (CPE) Antigennachweis in Zellkultur in Patientenmaterial Nukleinsäurenachweis PCR, (LCR, bdna) ISH, Sequenzierung Elektronenmikroskopie Bestimmung von Antikörpern IgG, IgM, IgA
39 Antikörpernachweise Welche viralen Proteine induzieren Antikörper? Welche Klasse von Antikörper werden gebildet? Wann und wie lange sind diese Antikörper im Serum? Sind die Antikörper spezifisch für einen Erreger? Welche Antigenquelle ist geeignet - gereinigtes Virus aus Zellkultur - Isolierte Virusproteine (z.b. Hämagglutinin) - synthetisch hergestellte Peptide oder Proteine
40 Serologischer Verlauf einer EBV-Infektion Reaktivierung Heterophile Antikörper VCA-IgG VCA-IgM EA-Antikörper EBNA-IgG 2 Wochen 3-4 Monate Jahre
41 Nachweisverfahren für Antikörper Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA/EIA) Immunfluoreszenz Western - Blot Neutralisationstest (NT) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Agglutinationstests
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45 Immunoassay Markierung FITC POD AP Isotope Biotin Antikörper im Patientenserum Konjugatantikörper Träger mit AG
46 Enzym-Immuno-Assay Patientenseren negative Kontrolle positive Kontrolle
47 ELISA Y Y Y Y Y AK-produzierende Zellen Antigen an der Festphase Test mit Fang-Ak
48 nativer Zustand des Antigens veränderter Zustand des Antigens Y Y
49 Substrat + Chromogen Y Capture-Assay
50 Immunfluoreszenz
51 FITC-markierte virale Proteine Oberfläche Zytoplasma Kern
52
53 Nachweis von Virusantigen durch Immunperoxidasereaktion
54 unsichtbare Banden Immunblot i.d.r.
55 Westernblot Verlauf einer HIV-Infektion gp160 gp120 p66 p51/55 gp41 p31 p24 p18 frühe Serokonversion reaktiv späte Infektionsphase
56 Exemplarischer Verlauf der Serokonversion nach Infektion mit HIV J., männl. Untersuchungszeitpunkte 1 keine Symptome, 6 Tage nach Infektionsereignis 2 Fieber, Abgeschlagenheit, Lymphknotenschwellung, 23. Tag 3 keine Symptome, 42. Tag 4 keine Symptome, 3 Monate (106. Tag) 5 keine Symptome, 7 Monate (223. Tag)
57 Virusnachweis mittels EM Norovirus Astrovirus Calicivirus Adenovirus
58 Virusnachweis mittels CPE Humane Lungenfibroblasten Affen-Nierenzellen CMV mock infiziert Rötelnvirus mock infiziert
59 Antikörperdiagnostik Vorteile Nachteile lange Erfahrung standardisierbar automatisierbar relativ schnell relativ preiswert quantifizierbar Serumpaar notwendig aussageschwach bei Immunsuppression und persistierenden Infektionen und bei Infektionen mit sehr kurzer Inkubationszeit Kreuzreaktivität (Spezifität) Ig-Gabe verfälscht Befunde begrenzt auf Serum und Liquor Leihimmunität bei Neugeborenen
60 Nachweisverfahren für virale Antigene Ag-ELISA Rota- & Adenoviren im Stuhl Direkte Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörper - RSV in Aspiraten, CMV in BAL, etc. Indirekte Immunperoxidase-Assays - CMV (pp65) in PBL Kurzzeitkulturen (Shell Vial) und Nachweis viraler Proteine - IE-Proteine der Herpesviren - Strukturproteine respiratorischer Viren
61 In Situ Hybridisierung Chromogen Farbstoff Streptavidin biotinyliertes Enzym (AP) HPV-Gensonde biotinyliert HPV-DNA
62 Genomnachweis in klinischen Proben HPV EBV
63 Genomnachweise PCR (Polymerase Chain Reaction) RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) n-pcr LCR (Ligase Chain Reaction) NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (b-dna Technik)
64 PCR Reagenzien Target - DNA aus Untersuchungsmaterial 2 für den Erreger spezifische Primer Nukleotidmix - dntp's thermostabile DNA-Polymerase (Taq) Puffer für Polymerase mit MgCl 2
65 PCR Protokoll Denaturierung bei 95 C, linear - ss ca 30 Zyklen Annealing bei T m der Primer Extension bei 72 C ss ---> ds Denaturierung bei 95 C ds ---> ss final extension 72 C 4 C bis zur weiteren Verarbeitung
66 Denaturierung bei 95 C Annealing der Primer Extension bei 72 C Denaturierung bei 95 C Zyklen final extension 72 C
67 2. Zyklus 1. Zyklus Auffüllen des Stranges 5 3 Primer doppelstr. (Oligo s) DNA DNA/RNA Annealing der Primer Denaturierung bei 95 C
68 Nachweis des PCR-Produktes M Fluoreszenz 1000 Kopien 10 Kopien Zyklen
69 Diagnostische Parameter einer CMV-Infektion nach Nierentranspantation IgG IgM pp65 Fieber Ganciclovir Geq/ml x DNA ,25 5 0, Tage nach NTX
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