Methods. AG Cypionka/Paleomicrobiology

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1 Methods AG Cypionka/Paleomicrobiology

2 Methodenskript AG Cypionka C O N T E N T Preparation of growth media...3 Mineral base medium for many anaerobic bacteria...4 Mineralisches Grundmedium für marine aerobe Bakterien...5 Spurenelementlösungen...5 Selenit-Wolframat-Lösung...6 Vitaminlösungen...6 Herstellung von HPG-Agarplatten...7 Oxic medium and agarplates...8 Casting the plates...8 Bestimmung von Ammonium-Stickstoff...9 Bestimmung von Nitrit-Stickstoff...9 Bestimmung von Nitrat-Stickstoff...9 Colorimetrische Sulfidbestimmung...11 Determination of dissolved sulfide...11 Turbidometrische Bestimmung von anorganischem Sulfat...12 Sulfat-Schnelltest...12 Photometrische Analyse von Thionaten...13 Colorimetrischer Sulfitnachweis...14 Colorimetrischer Schwefel-Nachweis...14 Photometrische Bestimmung von Orthophosphat...15 Proteinbestimmung nach Lowry...16 Proteinbestimmung nach Schmidt et.al. (1963)...16 Bradford protein assay (1976)...17 Dry mass determination...18 Bestimmung von Carotinoiden phototropher Bakterien...18 Bestimmung der Bacteriochlorophylle a, c, d und e...19 Cell number determination of (MPN) dilution series...20 Quantification of MPN dilution series with SybrGreenI...21 Determination of bacterial counts and colony forming units (cfu) from water and sediment samples...21 Enrichment and isolation of abundant heterotrophic sediment bacteria...22 Preparation of slides coated with agarose for microscopy...24 Determination of gram type Gram differentiation...24 Isolierung von Anaerobiern aus Tiefagar-Verdünnungsreihen...25 Agarverdünnungsreihe...25 Geißelfärbung...26 Catalase test...26 Oxidase test...27 Analyse des Substratspektrums aerober Bakterienisolate...27 Recording of growth curves...28 Bestimmung der β-glucosidase-aktivität...29 Bestimmung der β-glucosaminidase-aktivität...30 Bestimmung der Leucin-Aminopeptidase-Aktivität...31 Bestimmung der β-glucosaminidase-aktivität in Mikrotiterplatten...31 Bestimmung der Gesamtzellzahl...32 Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe...33 Determination of the total cell count with SybrGreenI...33 ATP-Bestimmung...35

3 Methodenskript AG Cypionka Determination of methane concentrations via Gas Chromatography...36 Zählung wachsender Zellen mit Nalidixinsäure...38 Life-Dead-Staining...39 Zählung aktiv respirierender Zellen...40 Isolierung von DNA...41 Freeze & Thaw DNA extraction from growing cultures...42 DNA/RNA Extraktion aus Sedimentproben...42 Schnelltest zur DNA-Quantifizierung...45 DNA extraction from sediments with FastDNA Spin Kit...45 Protokoll zur DNA-Extraktion aus Flüssigproben...46 Quantifizierung von DNA mit Pico Green...47 DNA-Quantification via a Microtiter plate reader...47 DNA extraction from aquifer sediments...49 Phage dislodgment and extraction from sediments samples...50 Agarose gelelectrophoresis...53 Purification of PCR products...54 DNA-sequencing via Sanger (Chain-abruption method)...55 Electrophoresis using the LiCor DNA Sequencing System DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)...58 Fluorescence-in situ-hybridization (FISH)...62 CARD (Catalyzed Reporter Deposition)-FISH...65 Quantitative PCR...70 Microcalorimetry...75 Determination of physicochemical gradients...78 Determination of the oxygen profile by a needle electrode...78 Molecular diffusion coefficients for various ions and gases in aqueous solutions...79 Fick s law of diffusion for sediments...79 Extraction of pore water...79 Determination of ammonia/ ammonium (refered to Solorzano)...80 Determination of nitrite...80 Photometric determination of sulfide in cultures of sulfate-reducing bacteria (Cord-Ruwisch, 1985)...81 Analysis of sulfate by ion chromatography...81 Determination of methane concentrations via Gas Chromatography...83 Literature...85

4 Methodenskript AG Cypionka Preparation of growth media The growth media are prepared in special glass vessels after WIDDEL (1980, figure 1). The chemicals are weighed in and dissolved in the below mentioned succession (see schemata). The bottling tube is covered with tinfoil and the connecting piece for gass inflow with the cotton filter is closed by a rubber bung. The lateral screw caps are also closed but for autoclaving one of them is screwn off a little in order to prevent the vessel from bursting during heating. The medium is autoclaved 30 minutes with 121 C. After autoclaving supplement solutions are added through one of the lateral connecting pieces. Figure 1: Glass vessel for preparing anaerobic medium (WIDDEL 1980). Oxic media: After autoklaving the lateral screw caps are leakproof closed and the rubber bung is removed out of the connecting piece for gass inflow. Now air is only able to get in the vessel through the cotton filter. To add the supplement solutions to the cooled down medium the vessel is connected to a N 2 gas inflow (5 kpa). The vessel with the completed medium remains connected to nitrogen influx because the excess pressure is needed for bottling. The completed medium is bottled to sterile containers. Anoxic media: After autoclaving the head space above the medium is flushed with N 2 /CO 2 (80/20, v/v) in short. The screw caps are leakproof closed and the medium is cooled down while stirring under N 2 /CO 2 (80/20, v/v) (5 kpa). The supplement solutions are aseptically added to the cooled down medium. The ph-value of the medium is adjusted (if necessary) to with sterile 1 N Na 2 CO 3 or 1 N HCl. The completed medium is bottled to sterile containers.

5 Methodenskript AG Cypionka Mineral base medium for many anaerobic bacteria (Cypionka & Pfennig 1986) (F => fresh water, B => brackwater, M => marine) F B M F B M Substance MW mm g/l KH 2 PO NH 4 Cl KCl CaCl 2 * 2 H 2 O MgCl 2 * 6 H 2 O NaCl resazurine (0.5 mg/ ml) ml After autoclaving and cooling down under N 2 add out off sterile stock solutions: Trace element solution (SL10) 1.0 ml Vitamin solution (V 7) 1.0 ml Se + W-solution 1) (0.1 mm) 2 * 10-8 M 0.2 ml 2) NaHCO 3 (1 M => 30 mm) 30 ml Dithionite (crystalline) a little until decolouration < 17 mg ph 3) adjust with sterile 1 M HCl or Na 2 CO 3 1) not required for all strains 2) Attention! Protective vessel; do not touch hot containers! 3) for medium F, for medium B and medium M Annotation: The only difference between medium F and the media B and M is the concentration of NaCl and MgCl 2. By addition of a salt concentrate (NaCl, 5 M, + MgCl 2, 0.2 M, 30 % salt) you are able to create medium B and M out off a medium with a lower salt content: 45 ml/ l F-medium for F => B 68 ml/ l F-medium for F => M 23 ml/ l B-medium for B => M Often used electron donators and electron acceptors (mm) H 2 (80 %) + CO 2 (20 %) + acetate (2 mm), lactate (20), Na 2 SO 4 (10) Na 2 S 2 O 3 (10), Na 2 S 2 O 5 (5), NaNO 3 (10)

6 Methodenskript AG Cypionka Mineralisches Grundmedium für marine aerobe Bakterien vor dem Autoklavieren dest. Wasser 1000 ml HEPES 2,38 g NaCl 24,32 g KBr (0,84 M) 1 ml MgCl 2 * 6 H 2 O 10 g H 3 BO 3 (0,4 M) 1 ml CaCl 2 * 2 H 2 O 1,5 g SrCl 2 (0,15 M) 1 ml KCl 0,66 g NH 4 Cl (0,4 M) 1 ml Na 2 SO 4 4 g KH 2 PO 4 (0,04 M) 1 ml Spurenelementlsg. SL 10 1 ml NaF (0,07 M) 1 ml Selenit-Wolfram-Lsg. 0,2 ml KBr, H 3 BO 3, SrCl 2, NH 4 Cl, KH 2 PO 4, NaF werden aus sterilen Stammlösungenzugesetzt. Vor dem Autoklavieren wurde das Medium mit 4 M NaOH auf ph 7,2-7,4 eingestellt. nach dem Autoklavieren dem abgekühlten Medium zusetzen. NaHCO 3 Lösung 0,2 g in 10 ml H 2 O 10-Vitaminlösung (5fach konz.) 2 ml Spurenelementlösungen (nach Tschech und Pfennig 1984) SL10 1) SL11 SL12 Destilliertes Wasser ad 1000 ml ad 1000 ml 2) ad 1000 ml 2) Salzsäure, 25 % 10 ml EDTA-Di-Natriumsalz 5.2 g 3.0 g FeSO 4 * 7 H 2 O g FeCl 2 * 4 H 2 O 1.5 g 1.5 g --- CoCl 2 * 6 H 2 O 190 mg 190 mg 190 mg MnCl 2 * 2 H 2 O 100 mg 100 mg 50 mg ZnCl 2 70 mg 70 mg 42 mg NiCl 2 * 6 H 2 O 24 mg 24 mg 24 mg Na 2 MoO 4 * 2 H 2 O 36 mg 36 mg 18 mg H 3 BO 3 6 mg 6 mg 300 mg CuCl 2 * 2 H 2 O 2 mg 2 mg 2 mg 1) Zuerst das Eisenchlorid in der Salzsäure lösen 2) Vor dem Auffüllen mit Wasser auf ph 6.0 einstellen Anwendung: 1 ml pro Liter Medium.

7 Methodenskript AG Cypionka SL9 Wie SL11, aber anstelle von EDTA-Di-Na: Nitrilotriessigsäure (NTA): 12.8 g Selenit-Wolframat-Lösung (nach Widdel 1980) Destilliertes Wasser NaOH Na 2 SeO 3 5 H 2 O Na 2 WO 4 2 H 2 O 1000 ml 0.4 g 6 mg 8 mg Vitaminlösungen 7-Vitamine-Lsg. 1) 10-Vitamine-Lsg 2) Destilliertes Wasser 180 ml 1000 ml Biotinlösung 3) 20 ml Biotin 10 mg Nikotinsäure 20 mg 25 mg Thiamin-Dichlorid 10 mg 25 mg p-aminobenzoesäure 10 mg 25 mg Ca-D(+)-Pantothenat 5 mg 25 mg Pyridoxamin-Dihydrochlorid 50 mg 50 mg Cyanocobalamin (Vit. B 12 ) 10 mg 5 mg Folsäure 10 mg Riboflavin 25 mg Liponsäure (Thioctinsäure) 25 mg 1) nach Pfennig ) 5fach konzentriert, nach Balch et al ) 10 mg Biotin in 100 ml Wasser, in der Wärme lösen Lösung in sterile Schraubdeckelflaschen sterilfiltrieren. Kühl und dunkel aufbewahren! Anwendung: 1 ml pro Liter Medium (7-Vitaminelsg), bzw. 2 ml pro Liter Medium (10- Vitaminelsg.).

8 Methodenskript AG Cypionka Herstellung von HPG-Agarplatten Herstellung des Mediums Das HPG-Medium beruht auf dem oxischen marinen Grundmedium. Da es erst direkt vor dem Giessen der Platten mit Agar versetzt wird, werden die Salze in nur 700 ml Wasser gelöst. vor dem Autoklavieren dest. Wasser 700 ml HEPES 2,38 g NaCl 24,32 g KBr (0,84 M) 1 ml MgCl 2 * 6 H 2 O 10 g H 3 BO 3 (0,4 M) 1 ml CaCl 2 * 2 H 2 O 1,5 g SrCl 2 (0,15 M) 1 ml KCl 0,66 g NH 4 Cl (0,4 M) 1 ml Na 2 SO 4 4 g KH 2 PO 4 (0,04 M) 1 ml Spurenelementlsg. SL 10 1 ml NaF (0,07 M) 1 ml Selenit-Wolfram-Lsg. 0,2 ml Hefeextrakt 0,03 g Na-Lactat (1 M) 5 ml Pepton 0,06 g Vor dem Autoklavieren wurde das Medium mit 4 M NaOH auf ph 7,2-7,4 eingestellt. Das Medium wird in Duran-Flaschen (blauer Schraubverschluss) abgefüllt und autoklaviert. Dem fertigen und abgekühlten Medium werden (in der Sterilbank) zugegeben: NaHCO 3 Lösung 10-Vitaminlösung (5fach konz.) Glucose-Lösung (0,5 M) Na-Thiosulfat (1 M) Vorsichtig und aseptisch arbeiten! 0,2 g in 10 ml H 2 O 2 ml 1,2 ml 1 ml Der ph-wert des fertigen Mediums muß nicht mehr kontrolliert werden. Giessen der Platten Bevor das Medium mit dem flüssigen Agar (4 %, mindestens fünfmal gewaschen) versetzt werden kann, muss es im Wasserbad auf etwa 50 C aufgeheizt werden. Nach der Zugabe des Agar in das warme Medium wird dieses gut durchmischt (es sollten möglichst keine Schlieren mehr zu sehen sein), und man kann mit dem Giessen der Platten unter der Sterilbank beginnen.

9 Methodenskript AG Cypionka Oxic medium and agarplates Oxic medium The components of the medium (table 2) will be weighted into 400 ml H 2 Odest using a 1 L cylinder and dissolved under stirring (magnetic stirrer). The provided solutions will be added using a sterile graduated pipette or one-way syringes/-cannulae. Table 2: Oxic medium for the cultivation of marine aerobes. Substances Net weight / L Sterile solutions Supply /L NaCl g Trace element solution SL 10 1 ml MgCl 2 * 6 H 2 O 10 g Tungsten/Selenite-solution 1 ml CaCl 2 * 2 H 2 O 1.5 g KBr (0.84 M) 1 ml KCl 0.66 g H 3 BO 3 (0.4 M) 1 ml Na 2 SO 4 4 g SrCl 2 (0.15 M) 1 ml HEPES 2.38 g NaF (0.07 M) 1 ml Glucose 5 g The medium used fort he plates will be filled up to 700 ml using H 2 O-dest. The medium used fort he liquid cultures will be filled up to 1 L. The media will be transfered into 1 L Schottbottles. The ph of the medium will be adjusted to using NaOH. The media will be autoclaved for 25 min at 121 C. After the medium cooled down, the following substances will be added: Ammonium-/Phosphate-solution NaHCO3 solution 10-Vitamin solution (5x concentrated) 10 ml 0.2 g in 10 ml H 2 O 2 ml The ph of the medium will be checked and if necessary adjusted using sterile solutions. Casting the plates The agar solutions (4% 12 g in 300 ml H 2 O dest, 5x washed) will be autoclaved for 15 min at 121 C and kept liquid using a water bath at 90 C. The medium will be preheated at 60 C using another water bath. Bubble free agar solution will be mixed with medium (Don`t shake! No striaes!). The agar-medium mix has to be cooled down a little and transfered in sterile Erlenmeyerflasks and the plates can be casted.

10 Methodenskript AG Cypionka Bestimmung von Ammonium-Stickstoff (nach Chaney und Marbach) Lösungen: A) 3 g Phenol + 3 mg Na-nitroprussid (Na-pentacyanonitrosylferrat (III) in 100 ml H 2 O dest. Gekühlt ca. 2 Wochen haltbar. B) 2 g NaOH in 80 ml H 2 O dest., abkühlen lassen, 0.5 ml NaClO-Lösung mit 13% wirksamem Chlor zusetzen und auf 100 ml auffüllen. (Vorsicht! Stark ätzend!). Vorgehen: 10 ml Probe werden in ein Reagenzglas pipettiert, 1 ml Lösung A zugesetzt, gemischt, 1 ml Lösung B zugesetzt und erneut gemischt. Eine Stunde bei Zimmertemperatur abgedunkelt stehen lassen. Bei zu starker Farbreaktion muß die Bestimmung mit verdünnter Probe durchgeführt werden. Anschließend Messung der Absorption bei 635 nm Wellenlänge gegen Ammoniumfreien Leerwert. Niederschlag vorher abzentrifugieren! Der Nachweis ist sehr empfindlich. Die Glasgeräte müssen sauber sein; evtl. vorher nochmals spülen. Eichkurve: mit (NH 4 ) 2 SO 4 im Bereich µm aufnehmen (Achtung: 2 x Ammonium!). Prinzip der Reaktion siehe Abb.1 Bestimmung von Nitrit-Stickstoff (nach Göttinger Kursskript) Lösungen: A) 1.65 g Sulfanilsäure wird in 375 ml heißem Wasser gelöst und mit 125 ml Eisessig versetzt. B) 0.5 g a-naphthylamin wird in 100 ml Wasser suspendiert, 125 ml Eisessig zugesetzt, bis zur Lösung gerührt und mit H 2 O ad 500 ml aufgefüllt. Vorsicht, stark carcinogen! Nicht mit den Händen berühren und nichts verschütten. Pipettierhilfe verwenden und benutzte Pipetten und Gefäße sogleich gut spülen. Vorgehen: 0.5 ml Probe in Reagenzglas, 0.5 ml Lsg. A zusetzen, mischen, 2.5 ml Lsg. B zusetzen. Messung nach 10 min. bei 530 nm. Eichkurve: µm mit KNO 2 (Vorsicht, carcinogen!) Prinzip der Reaktion siehe Abb.2 Bestimmung von Nitrat-Stickstoff (nach Goltermann) Lösungen: A) 1 N HCl B) 1 N NaOH C) Reduktionsmischung: C1) g CuSO 4 * 5 H 2 O in 100 ml H 2 O. C2) 0.12 g Hydrazinsulfat N 2 H 4 * H 2 SO 4 in 25 ml H 2 O.

11 Methodenskript AG Cypionka ml C1 werden mit 25 ml C2 gemischt und mit H 2 O ad 50 ml aufgefüllt. Diese Reduktionsmischung und die Lösung C2 sind nicht haltbar und müssen täglich frisch hergestellt werden. Vorgehen: 10 ml zentrifugierte, partikel- und sulfidfreie Probe (wenn nötig, Sulfid mit CO 2 austreiben) wird mit 0.25 ml Lsg. B versetzt, 0.25 ml Lsg. C zugefügt, gemischt und 30 min bei C stehengelassen. Anschließend wird 0.25 ml Aceton und nach 5 Min ml HCl zugefügt. Das durch Reduktion gebildete Nitrit wird anschließend nach der obigen Methode bestimmt. Vorsichtsmaßnahmen wie bei der Nitritbestimmung! Eichkurve: 0, 5 10, 20, 50, 100 und 200 µm KNO 3. Prinzip der Reaktion: Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Die Reaktion verläuft allerdings nicht ausschließlich bis zum Nitrit. Daher Nitrit-Eichkurve nicht einfach übernehmen, sondern Eichkurve von Nitrat ausgehend erstellen! Abb. 1-3: Reaktionsprinzipien einiger photometrischer Tests

12 Methodenskript AG Cypionka Colorimetrische Sulfidbestimmung (nach Cline) Reagenz: 1 g N,N-Dimethyl-p-Phenylendiammonium-Dichlorid (DMPD) und 1.5 g FeCl 3 * 6 H 2 O in 25%iger HCl lösen, mit 25%iger HCl auf 50 ml auffüllen. Vorsicht! Die Lösung ist stark sauer und carcinogen! Reagenz nicht mit Händen berühren, stets Pipettierhilfe verwenden, auf anhaftende Reste achten! Benutzte Pipetten und Gefäße nicht stehen lassen, sondern alsbald spülen. Vorgehen: In verschraubbaren 15 ml-reagenzgläsern 0.4 ml Reagenz (mit Eppendorfpipette) vorlegen. Dazu 5 ml Probe pipettieren. Reagenzglas verschließen, sofort mischen und nach frühestens 20 min die Extinktion bei 670 nm messen. Sollte die Extinktion größer als 1 werden, muß weniger Probe eingesetzt werden (und dann nach Entwicklung der blauen Farbe das Volumen mit dest. Wasser auf 5 ml ergänzt werden). Eichkurve: Als Standard dient eine Na 2 S-Lösung: 500 ml H 2 O wird in einem Meßkolben mit einem NaOH-Plätzchen versetzt und für mindestens 20 min durch eine lange Kanüle mit N 2 durchspült. Danach wird ein in dest. H 2 O gewaschener und getrockneter, genau gewogener Na 2 S * 9 H 2 O, von etwa 0.6 g, hinzugegeben und der Kolben (N 2 -begast) mit einem Gummiseptum verschlossen. Diese Stammlösung enthält etwa 5 mm Sulfid (= 5 nmol/µl bei 0.6 g Na 2 S * 9 H 2 O) und ist nur unter Stickstoff maximal 1 Tag haltbar. Für die Eichkurve werden in 12 Reagenzröhrchen 5 ml H 2 O vorgelegt, mit einem Gummiseptum verschlossen und 20 Minuten mit Stickstoff ausgeblasen. Mit einer Hamiltonspritze (Vorsicht beim Durchstechen des Gummiseptums!) werden 0, 2, 5, 10, 20 und 50 µl (0 bis 250 nmol Sulfid) der Sulfidstammlösung zugesetzt, gemischt und sofort 0.4 ml Reagenz mit einer 1 ml-spritze hinzugefügt (Doppelansätze). Nach 20 Minuten wird die Extinktion bei 670 nm gegen einen Ansatz ohne Sulfidlösung gemesssen. Zur Berechnung der molaren Konzentration der Na2S-Lösung wird das Formel-Gewicht für Na 2 S * 9 H 2 O angenommen, was sich bisher bewährt hat. Für sehr genaue Messungen müßte ein Aliquot der Na 2 S-Lösung in eine frische, genau eingestellte saure J-KJ-Lösung gegeben und das überschüssige Jod mit einer Na 2 S 2 O 3 -Lösung zurücktitriert werden. Prinzip der Reaktion siehe Abb.3 Determination of dissolved sulfide after Cord Ruwisch Sulfide is the final product of dissimilatory sulfate reduction. The presence of dissolved sulfide in cultures can be rapidly proven by its colloidal precipitation as CuS in a copper sulfate reagent, and quantified photometrically. Copper reagent: HCl (50 mm), CuSO4 (5 mm) Chemical reaction: CuSO 4 + H 2 S CuS + H 2 SO 4 Procedure Remove 0.2 ml of culture from the culture vessel using a syringe. Inject 0.1 ml culture free of gas bubbles into 4 ml of copper reagent (dispensed into glass tubes). Vortex and transfer the solution into a cuvette. The absorbance is immediately measured at 480 nm in a photometer (the colloidal CuS solution remains stable for 20-40s). Copper reagent free of sulfide serves as blank.

13 Methodenskript AG Cypionka Sulfide standard preparation Washed crystals of Na 2 S 9H 2 0 (~13 g) are dissolved in 50 ml anoxic water to serve as a stock solution (~1M; the final concentration should be determined via titration). An anoxic dilution serie of dissolved sulphide is prepared in the desired range (0-30mM). An aliquot of the stock solution is anaerobically transferred into a Hungate tube containing anoxic water. After shaking, an aliquot of this mixture is transferred into a second tube and so on. Calibration curves should be linear up to an absorbance of 0.5. A factor could be used to calculate the sulfide concentration from the measured absorbance. Reference: Cord Ruwisch R (1985) A quick method for the determination of dissolved and precipitated sulfides in cultures of sulfate-reducing bacteria. Journal of Microbiological Methods 4:33-36 Turbidometrische Bestimmung von anorganischem Sulfat (nach Cypionka und Pfennig, Tabatabai) Reagentien: A) 10 g Citronensäure * H 2 O, H 2 O ad 80 ml, lösen und mit 120 ml Glycerin (99.5%) mischen. B) 0.5 g BaCl 2 * 2 H 2 O, 5 g Citronensäure * H 2 O, H 2 O ad 50 ml. Vorgehen: 2 ml Probe (wenn nötig, klarzentrifugiert) mit 2 ml Lösung A schlierenfrei mischen. 0.5 ml Lösung B zusetzen und sofort schlierenfrei mischen. Nach Minuten erneut mischen und die Trübung bei 436 nm gegen sulfatfreie Kontrolle messen. Immer Doppelbestimmungen mit verschieden verdünnten Proben durchführen! Stets Eichstandards über den erwarteten Konzentrationsbereich der Proben mitmessen! Eichkurve im Bereich von µmol Sulfat pro Testansatz anlegen. Für die Erstellung der Tiefenprofile werden die von Sulfid und Partikeln befreiten Wasserproben (1 l) verwendet. Prinzip der Reaktion: Ba 2+ + SO 4 2- BaSO 4 (unlöslich) Citronensäure säuert den Ansatz an und komplexiert die Ba 2+ -Ionen. Aus den Komplexen entstehen bei der Reaktion mit Sulfat sehr kleine Kristalle mit hoher optischer Dichte. Glycerin verlangsamt die Sedimentation der Kristalle. Sulfat-Schnelltest mit 0.2 M HCl und 0.2 M BaCl 2 1 ml Kultur mit 2 Tropfen HCl ansäuern, umschütteln, 2 Tropfen BaCl 2 zusetzen. Sofortige Trübung zeigt Sulfat, langsam auftretende evtl. Thiosulfat (=> Schwefel) an.

14 Methodenskript AG Cypionka Photometrische Analyse von Thionaten (nach Kelly et al. 1969; Fitz & Cypionka 1990) Der photometrische Nachweis von Thiosulfat, Trithionat und Tetrathionat beruht auf der alkalischen Cyanolyse der Thionate, die zu Thiocyanatäquivalenten umgesetzt werden. Zur Unterscheidung der Thionate wird die Cyanolyse-Reaktion bei verschiedenen Temperaturen und zum Teil mit CuSO 4 als Katalysator durchgeführt. Die dabei entstehenden Thiocyanate können dann als rot-brauner Komplex mit Eisen (III) photometrisch quantifiziert werden. (0 C) I S 4 O CN - + H 2 O S 2 O SO HCN + SCN - (0 C, CuSO4) II S 2 O CN - SO SCN - (100 C, CuSO4) III S 3 O CN - + H 2 O SO SO HCN + SCN - Daraus folgt, daß bei der Messung von Ansatz I lediglich die Konzentration von Tetrathionat ermittelt wird. Bei der Messung des Ansatzes II werden die Konzentrationen von Tetrathionat, des bei der Cyanolyse entstehenden Thiosulfates und des bereits im Ansatz befindlichen Thiosulfates erfaßt. Bei der Messung des Ansatzes III wird die Gesamtkonzentration aller im Ansatz vorhandenen Thionate (Thiosulfat, Tri- und Tetrathionat) ermittelt. Lösungen: 1.) NaH 2 PO 4 - NaOH - Puffer 1 M, ph ) KCN 1.25 M 3.) CuSO 4 * 5 H 2 O M 4.) Fe(NO 3 ) 3 * H 2 O 1.5 M gelöst in 4 M HClO 4, Volumenzunahme beim Lösen! => 100 ml HClO g Fe(NO 3 ) 3 => 150 ml Gesamtvol. Als Standards werden 1 mm Lösungen von Thiosulfat, Tetrathionat und Trithionat täglich frisch angesetzt. Ansätze: In jedes Reagenzglas werden 0.06 ml der Lösung 1.) vorgelegt. Dann wird die Probe hinzupipettiert (max ml) und mit Aqua bidest. auf 2.31 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Der Standard wird als Mix mit allen drei Thionaten eingesetzt. Es wird für jeden Ansatz eine Nullprobe gemacht, mit welcher der Nullabgleich bei der photometrischen Messung durchgeführt wird. 3 verschiedene Ansätze (I,II u. III) Ansatz I zur Bestimmung von Tetrathionat: Ansatz I wird 10 min auf 0 C abgekühlt, bevor 0.06 ml der Lösung 2.) und 0.06 ml Aqua bidest. hinzugefügt werden (Mischen!). Der Ansatz bleibt dann ca. 20 min im Eisbad. Ansatz II zur Bestimmung von Thiosulfat: Ansatz II wird 10 min auf 0 C abgekühlt. Dann wird 0.06 ml der Lösung 2.) hinzupipettiert (Mischen!). Nach einer 10-minütigen Inkubationszeit werden 0.06 ml der Lösung 3.) hinzupipettiert (Mischen!), bevor der Ansatz weitere 10 min im Eisbad verbleibt.

15 Methodenskript AG Cypionka Ansatz III zur Bestimmung von Trithionat: Nachdem dem Ansatz III 0.06 ml der Lösung 2.) hinzugefügt werden, wird er 45 min im Wasserbad gekocht. Die Reagenzgläser sind dabei durch Glasmurmeln verschlossen. Danach wird der Ansatz auf 0 C abgekühlt (ca. 10 min) bevor 0.06 ml der Lösung 3.) hinzupipettiert werden (Mischen!). Danach bleibt der Ansatz weitere min im Eisbad. Abschließend werden zu allen Ansätzen 1 ml der Lösung 4.) hinzugefügt (Mischen!). Wenn die Ansätze dann auf Raumtemperatur wieder erwärmt sind, kann die Extinktion 460 nm gemessen werden. Entsprechend den oben angegebenen Reaktionsgleichungen sind die Konzentrationen der Thionate wie folgt zu ermitteln: Konzentration von Tetrathionat: Ansatz I Konzentration von Thiosulfat: Ansatz II - 2 x Ansatz I Konzentration von Trithionat: Ansatz III - Ansatz II Colorimetrischer Sulfitnachweis (nach Pachmayr) Reagenz A: Säureentfärbte Fuchsinlösung 400 mg Fuchsin werden mit Aqua bidest. und 125 ml Schwefelsäure (konz.) versetzt und mit Aqua bidest. auf einen Liter aufgefüllt. Reagenz B: Formaldehyd 32 %ige Lösung Ansatz: Die Probe wird mit Aqua bidest. auf 8.9 ml aufgefüllt. Dann erfolgt die Zugabe von 1 ml Reagenz A und 0.1 ml Reagenz B (mischen!). 10 min nach der letzten Zugabe erfolgt die photometrische Messung bei 570 nm gegen einen Ansatz ohne Sulfit. Colorimetrischer Schwefel-Nachweis (nach Chan und Suzuki, 1993) Lösungen: (1) 10 ml A. dest ml Aceton (2) 0.2 g NaCN ml Lösung (1) (3) 0.4 g FeCl 3 * 6 H 2 O + 5 ml A. dest (4) Aceton (5) Petrolether (6) 6.4 mg S in 10 ml DMSO (Endkonzentration 20 mm) (7) 3.2 mg S in 10 ml Petrolether

16 Methodenskript AG Cypionka Vorgehen: - Herstellen einer S -Eichreihe mit Lösung (6) (weißer Niederschlag) und Puffer von µm 0 µm = Leerwert - Extraktion: 0.5 ml Bakteriensuspension (oder Eichlösung) ml Lösung (5) in Eppendorf- Caps - mischen (30 sec) - Zentrifugation: Upm, 10 min in der Eppendorfzentrifuge der Überstand wird klar - Ansatz: 0.5 ml Überstand ml Lösung (2) in E.-Caps - mischen u. 2 min reagieren lassen - Meßansatz: 0.95 ml Lösung (4) ml Lösung (3) ml "Ansatz" in E.-Caps - mischen, es bildet sich ein bräunlicher Niederschlag - Zentrifugation: Upm, 1 min in der Eppendorfzentrifuge - Extinktion des Überstands messen bei 464 nm Photometrische Bestimmung von Orthophosphat Reagentien: A) Molybdatschwefelsäurereagenz: 14.4 ml konz. H 2 SO 4 (d = 1.84) werden in 30 ml H 2 O dest. gelöst und nach dem Abkühlen folgende Lösungen zugesetzt: 1 g Amidosulfonsäure in 10 ml H 2 O; 1.25 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 * 4 H 2 O in 20 ml H 2 O; 34.4 mg Kalium- antimontartrat in 10 ml H 2 O. Es wird mit H 2 O dest. auf 100 ml aufgefüllt. B) 1.0 g Ascorbinsäure in 10 ml H 2 O dest. Täglich frisch herstellen. Vorgehen: 10 ml Wasserprobe (filtriert) werden im Reagenzglas mit 0.4 ml Reagenz A und 0.25 ml Reagenz B versetzt. Nach mindestens 10 min wird die Absorption bei 865 nm Wellenlänge in 1 cm-küvetten gegen einen Reagenzienleerwert mit H 2 O gemessen. Eichkurve: Mit KH 2 PO 4 im Bereich von µmol/l. Vergleichsweise auch Eichwerte mit 400 und 4000 µmol/l einsetzen. Prinzip der Reaktion: Das Molybdän in der entstandenen Molybdato-phosphorsäure wird mit Ascorbinsäure zu Mo(+IV) reduziert, das mit dem übrigen Mo(+VI) eine blaue Verbindung aus gemischten Wertigkeitsstufen bildet.

17 Methodenskript AG Cypionka Proteinbestimmung nach Lowry Reagenzien: Kupferreagenz: 0.1 g CuSO 4 * 5 H 2 O in 20 ml 1%-iger K-Na-Tartratlösung lösen. 1 ml dieser Lösung mit 50 ml Na 2 CO 3 -Lösung (2%) vermischen. Die Lösung täglich frisch ansetzen. Folin-Reagenz: 1 Teil Folin-C.-Reagenz (Merck) mit 2 Teilen dest. Wasser mischen. NaOH: 0.3 M Vorgehen: 10 ml Zellsuspension in der Kühlzentrifuge abzentrifugieren (6000g, 10 min) und einmal mit 0.6 %-iger Kochsalzlösung waschen. Das Sediment wird sorgfältig in Kochsalzlösung resuspendiert und auf 10 ml aufgefüllt. In drei Proben von je 1 ml wird das Gesamtprotein nach LOWRY et al. bestimmt. Um die Zellen aufzuschließen, 1 ml Probe mit 0.50 ml 0.3 M NaOH versetzen und im Wasserbad bei 60 C in verschlossenem Reagenzglas während 90 min erhitzen. Nach dem Abkühlen 5 ml Kupferreagenz unter ständigem Schütteln zufügen und 10 min im Dunkeln stehen lassen. Dann wird 0.5 ml Folin-Reagenz zugesetzt, sofort geschüttelt und 30 min im Dunkeln gehalten. Dann wird zentrifugiert (6000g, 10 min) und anschließend bei 623 nm gegen einen Blindwert photometriert (d = 1cm). Mit Serumalbumin wird eine Eichkurve aufgestellt g pro Ansatz. Proteinbestimmung nach Schmidt et.al. (1963) (abgewandelte Biuretmethode nach La Riviére 1958) Reagenzien: (A) NaOH (B) K-Na-Tartrat NaOH CuSO 4 * 5 H 2 O KJ in H 2 O 4 M (= 160 g/l) 5 g 4 g 1 g 2.5 g 400 ml Vorgehen: - 10 ml Zellsuspension mit 0.9 % NaCl waschen und abzentrifugieren - Röhrchen mit 0.9 % NaCl auf 5 ml auffüllen ml Reagenz A zugeben, schütteln - genau 10 Minuten in kochendes Wasserbad (Glaskugeln auf die Reagenzgläser) - sofort in kaltem Wasser abkühlen - 2 ml Reagenz B zugeben, schütteln - 30 Minuten in 37 C Wasserbad - Bei Trübung Partikel abzentrifugieren - Extinktion bei 546 nm messen - Eichkurve mit BSA (Stammlösung: 50 mg/ml) im Bereich von 0 bis 10 mg/ansatz

18 Methodenskript AG Cypionka Bradford protein assay (1976) The assay is based on the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 to protein. When binding to protein occurs the absorbance maximum of the dye shifts from 465 nm to 595 nm. Therfore, absorbance can be measured photometrically at 595 nm. The assay is quick and reliable since a visible colour change occurs after 2 min and the extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold concentration range. Furthermore, both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, i.e. there is no or neglible disturbance by natrium and kalium ions or carbohydrates like sugars. Disturbances are only known from concentrated detergent like Sodiumdodecylsulfate (SDS), Trition X-100 or commercially available solutions. Controls are recommended. Bradford reagent Dissolve 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 ml 95% ethanol, add 100 ml 85% (w/v) phosphoric acid. Dilute to 1 liter when the dye has completely dissolved. Final concentrations are 0.01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250, 4.7% (w/v) ethanol, and 8.5% 8w/v) phosphoric acid. The Bradford reagent should be light brown/reddish in color. In case of blue components filtrate the solution using a round filter. Standard procedure 1) Transfer up to 5 ml of homogenised growing culture into 15 ml- centrifuge tubes. Centrifuge for 15 min/4000rpm/4 C. Decant supernatant and freeze the pellet until the Bradford assay is carried out. 2) Preheat a water bath (100 C) 3) Add 500 µl bidestilled water and 500 µl NaOH (0.5 M) to the cell pellet and mix thoroughly. 4) Cook the suspension for 10 min at 100 C 5) Transfer 200 µl in three parallels into 1.5 ml Eppendorf reaction tubes. Mix with 800 µl of Bradford reagent. 6) Incubate for 30 min at room temperature. 7) Transfer the whole volume into a half-micro disposable cuvette. 8) Measure the absorbance at 595 nm using the photometer. Don t forget blind controls. 9) Note all values and use the mean value for further calculations. Calibration curve A calibration curve is made from bovine serum albumin (BSA). A stock solution (1mg/ml) is diluted with bidistilled water in triplicates to prepare standard solutions with concentrations ranging from 0 to 8 µg protein/200µl.

19 Methodenskript AG Cypionka Dry mass determination (after Widdel, modified by Cypionka and Pfennig) Thoroughly clean all weighing dishes (do not touch with your fingers but use tweezers to handle the dishes during cleaning), place in clean Petri dish, dry at 80 C. So as to assure accuracy of your measurements, always weigh an empty container as a control. Precisely measure and note down the volume ( ml) and OD (at 436 nm) of the culture to be examined (the more the better). Transfer cells into centrifuge beakers (250 ml), counterbalance with water (including lids) (to precisely 0.5 g) and centrifuge for 20 minutes at 12,000 rotations per minute to obtain a solid pellet. (Cultures of sulfate-reducing bacteria contain sulfide, wich should be replaced completely with CO 2 before further procedures) Prepare 300 ml ammonium-acetate buffer (~50 mm, ph 6.5; if necessary, adjust with acetic acid). This buffer evaporates completely as NH3 and acetic acid when heated. Immediately after the centrifuge has stopped, carefully remove the supernatant, re-suspend the cells in the ammonium acetate buffer. If necessary, gather cells from several beakers in one, wash cells (= centrifuge again) Precisely weigh the dry containers. Write down empty weight. Immediately after the centrifuge has stopped, remove the supernatant. (!Carefully!) transfer the cells to the weighing dish in 0.5 ml dist. water using a Pasteur pipette. Rinse with water at least twice. Dry at 80 C until the weight remains constant (1-2 days). The final weighing has to occur immediately after the samples are taken out of the hot drying cabinet, as cells absorb considerable amounts of moisture while cooling down. Therefore, preset the analytical scale accordingly. Thoroughly clean all weighing dishes. Calculate the dry mass per OD and volume (ml). Bestimmung von Carotinoiden phototropher Bakterien (nach Eichler und Pfennig) a) Ernte der Bakterienmasse Gut gewachsene Kulturen werden abzentrifugiert (9000 rpm, 20 min), das überstehende Kulturmedium vorsichtig dekantiert und verworfen. b) Extraktion der Carotinoide Carotinoide sind in Gegenwart von Luft und Licht unbeständig! Extraktionsmittel: Ethanol abs.: Aceton = 1:1. Das Pellet von a) wird in dem restlichen Überstand (evtl. 0,2 ml dest. Wasser zusetzen) resuspendiert und vollständig in ein 10 ml-zentrifugenglas überführt. Dann werden 8 ml Extraktionsmittel zugegeben, gut durchgemischt und das Röhrchen nach Begasen mit N 2 mit einem Butylgummistopfen verschlossen. Röhrchen etwa 1 Stunde bei Zimmertemperatur extrahieren las-

20 Methodenskript AG Cypionka sen, nochmals durchmischen und Zellreste abzentrifugieren; Gummistopfen vorher abnehmen, Tischzentrifuge, 15 min. Farbigen Überstand bei 25 C im Rotationsverdampfer unter schwarzem Tuch einengen. Farbigen Satz mit 0,75 ml Extraktionsmittel aufnehmen, in ein Röhrchen überführen, mit N 2 begasen und mit Butylgummistopfen verschließen; im Dunkeln aufbewahren. c) Chromatographie auf Dünnschicht-Platten Laufmittel: Petroleumbenzin : Aceton = 9:1 Chromatographiekammer mit Fließpapier auslegen, mit N 2 begasen und schließen. Dann 100_ml Laufmittel einfüllen und 1 h sättigen lassen. Den Extrakt von b) mit Hamilton-Spritze vorsichtig auf die Startlinie einer Kieselgel-Dünnschicht-Platte unter einem N 2 -Strom zum Trocknen auftragen (etwa 100 µl auf 3 cm Strecke auftragen, daneben etwa 50 µl auf 3 cm). Vergleichsextrakte ebenso behandeln. Platte in der abgedunkelten Kammer entwickeln. Wenn Laufmittel etwa 16 cm hoch gestiegen ist (mit Bleistift markieren), Platte kurz trocknen mit N 2 und nochmals entwickeln. Dann Platte mit N 2 trocknen. Auf der trocknen Platte Banden mit Spatel vorsichtig markieren (Laufhöhe!), Platte mit Glasplatte abdecken und möglichst rasch auf durchsichtige Folie und Papier kopieren. Farben der Banden genau aufschreiben und anhand der Banden der Vergleichsorganismen identifizieren. Bestimmung der Bacteriochlorophylle a, c, d und e (nach Oelze, bzw. Steenbergen und Korthals) Bakterienkultur (2 bis 5 ml) wird über ein Glasfaserfilter (f 25 mm) bzw. (bei Stämmen mit besonders kleinen Zellen) über Membranfilter (Porenweite 0,2 µm, f 2,5 cm) abfiltriert. Nach Überführen in 3 ml Aceton wird im Dunkeln bei 4 C über Nacht extrahiert. Die Messung erfolgt gegen reines Extraktionsmittel für Bchl a bei 771 nm Bchl c bei 663 nm Bchl d bei 652 nm Bchl e bei 647 nm. Die Pigmentkonzentration errechnet sich nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz E = c * d * ε mit E = Extinktion am Absorptionsmaximum c = Pigmentkonzentration d = Schichtdicke der Küvette (1 cm) ε = Extinktionskoeffizient am Absorptionsmaximum für Bchl a = 92.3 ml * mg -1 * cm -1 Bchl c = 92.6 ml * mg -1 * cm -1 Bchl d = 98.0 ml * mg -1 * cm -1 (dito anzunehmen für Bchl e)

21 Methodenskript AG Cypionka Cell number determination of (MPN) dilution series with three parallels For quantification of viable cell counts a MPN dilution series with appropriate medium is prepared with three parallels. For this purpose the culture is diluted stepwise 1: 10 and incubated at least for one week. The number of wells or tubes that show microbial growth can be correlated to the MPN-index which can be found in a statistic table that contains the cell numbers/ml. number of MPN-Index confidence interval (95%) positive tubes with cells / ml upper lower 100 µl 10 µl 1 µl < < <

22 Methodenskript AG Cypionka Quantification of MPN dilution series with SybrGreenI according to Martens-Habbena et al. Preparation of staining-solution The SybrGreenI stock solution (10.000x) is diluted in TAE buffer (ph 7,4) which contains 1% of a 1M ascorbic acid. The working solution must be prepared freshly each day at five times the desired final assay concentration. Quantification 200µl subsamples from each well of the 2ml 96-well plates and 50µl SybrGreenI solution are transferred to black microplates and mixed cautiously. Fluorescence is measured after 2h of incubation in the dark. Fluorescence intensities are determined in a microplate reader (Fluostar Optima) at 485nm (excitation) and 520nm (emission). All measurements are carried out in three reading cycles, with integration of 20 flashes, a 0,5 s delay time between reading, and without shaking before each cycle. Determination of bacterial counts and colony forming units (cfu) from water and sediment samples (fter Cavalli-Sforza) Depth profiles (sediment surface, tidewaywater and other depth layers) of living cell counts (aerobes and anaerobes) will be generated. For the determination of living cell counts, dilution series of tidewaywater and sediment samples will be generated using artificial seawater (Tidewaywater: 1:10, 1:100, sediment: 1.100, 1:1000, 1:100000) and 100 µl will be deleted onto agar plates, respectively (see figure). For every dilution factor, two parallels will be inoculated and one of them will be incubated under oxic conditions, one under anoxic conditions. The progress of colony forming will be recorded daily. Therefore, the colonies will be counted and distinguished macroscopic as well as microscopic as colony forming units and specified morphological.

23 Methodenskript AG Cypionka The living cell counts will be determined using the following equation (according to Cavalli-Sforza): x = Σ i C i Σ i (n i *z i ) x = average count of colony forming units in the volume of the inoculum C 1, C 2,..., C i = number of counted colonies on the plates n 1, n 2,..., n i = plates/dilution series z 1, z 2,..., z i = dilution factors For instance: Dilution: 10-6 : 303, 290, 285 colonies 10-7 : 32, 21 colonies Average cell number x = 931/(3* *10-7 ) = 2.91*10 8 Enrichment and isolation of abundant heterotrophic sediment bacteria Procedure: The growth in the liquid dilutions and on the agar plates will be checked (OD-measurements, microscopy of colony cells: suspend the colony in 50 µl Tris-buffer, transfer 5 µl of them onto a microscope slide and put a cover slip on it, use the 40x lens). The liquid cultures and agar plates having the highest growth are used to generate singling streaks using the 13-streak-method and incubated. If the subculture is grown, the form and color of the colony as well as the cell types will be compared to the initial culture via microscopy. A second singling streak (13-streakmethod) will be performed of distinctive types in the enrichments. The growth will be checked daily, the presence of colonies will be recorded and colony types will be specified. Pure cultures will be harvested and used for physiological characterization.

24 Methodenskript AG Cypionka OD-measurement: The OD-measurements will be done using the same photometer during the complete period of measurements. The aerobe approaches will be determined using the one-cuvette-method. The photometer will be adjusted to zero by using water as blank value. After drying the cuvette using a filter paper, the sample will be measured in the same cuvette. The OD should be at a maximum of 0.3, otherwise 70 mm phosphate buffer will be used for dilution. The screw covered tubes containing the anaerobe growing cells will be kept locked until the end of the experiments (even if the OD > 0.3). They will be measured against a water containing tube. For every tube the minimum of absorption will be set by rotation and marked on the edge. For further measurements the tube will always be set in the same position.

25 Methodenskript AG Cypionka Preparation of slides coated with agarose for microscopy Or how to trick microbial cells into posing for microscopic photos (after Pfennig and Wagener, modified by Cypionka) Heat 100ml of an agarose solution (2%, w/v) prepared in a Schott flask with blue cap in the microwave. The solution should be free from reams. Use a preheated water bath (~ 45 C) to keep the liquid soluted. In order to get a smooth agarose film preheat clean object slides (free from fluff) on a clean flat underground by using infrared light. Dispense 2 ml of agarose solution in zigzag lines onto one slide by using a clean glass pipette. Avoid drainage of the agarose solution. Before usage, the agarose slides have to air dry for a few days. The slides can be kept in closed boxes for some time. Preparing microsope slides for observation First of all, cell conentrations in cultures should be high enough for photography. Otherwise you should use a centrifuge to concentrate the cells. Transfer three drops of ~20, 22 and 25 µl, respectively, onto the agarose-coated slide by using a micropipette ( ml). Each drop has to be covered immediately with a cover glass (18x18 mm). Normally, the liquid part of the cell suspension is soacked into the agarose, while the bacterial cells are arranged on the top. In special cases it is necessary to prevent the cell suspension from vaporescence. A paraffin solution is used to seal all sides of the cover glass by using a warm spatula. Don t forget to take some nice pictures of your cells! It is worth it. See also How to get the perfect photomicrograph of Heribert Cypionka ( Determination of gram type Gram differentiation Gram-negative bacteria do not retain the initial crystal violet stain. They are decolorized by the organic solvent and hence show a pink/red counterstain. Gram-positive bacteria instead retain the violet dye. This difference basically lies in the cell wall structure of the bacteria. a) Gram staining (modified by Bartholomew) 1) Plate freshly grown cells (not older than 24 h) onto a clean object slide or cover slip and allow the film to air dry. Fix the dried film by passing it quickly through the Bunsen flame ( heat fixation ; do not pyrolyse the cells!). Do the same procedure on the same slide with two reference strains, one gram-negative, and one gram-positive strain. 2) Stain the fixed cells for up to 1 min with Huckers ammonium oxalate-crystal violet reagent. 3) Drain staining solution. Wash off briefly with water for 5 sec. Drain. 4) Flood the slide with Gram's Iodine solution for ca. 1 minute. Wash off with water. Drain. 5) Drain staining solution. Wash off briefly with water for 5 sec. Remove excess water. 6) Counterstain: 3 x 30 sec each in 3 drops of n-propanol. 7) Wash off with water for 5 sec. 8) Check quality using a microscope. 9) Flood slide with safranin solution and allow to counterstain for 30 seconds. Drain counterstain solution and wash off with water. Remove excess water. Dry. 10) Find dry and stained bacteria under 10x-40x lenses. Then examine the bacteria using oil immersion but no cover glass.

26 Methodenskript AG Cypionka ) Compare your results with the gram test of gram-negative and gram-positive reference strains. b) KOH solution test (after Gregersen) Put some drops of KOH solution (3%) onto a clean slide. Add cell material (colonies or cell pellets) by using an inculating loop and mix for ~5 to 10 seconds. Carefully pull back the platine loop. Slimy filaments are indicative for gram-neagtive cells. Gram-positive bacteria won t produce slimy material with solution of potassium hydroxide. Reference: Gregersen T (1978) Rapid method for distinction of gram-negative from grampositive bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 5: Isolierung von Anaerobiern aus Tiefagar-Verdünnungsreihen Herstellung sog. "Shake-Röhrchen": In einer 500 ml Schott- Flasche (mit Rührfisch und Deckel leer gewogen!!!) 300ml bidest. Wasser geben und 12g gemahlenen Agar zusetzen und Suspension 10 min rühren. Danach Agar absetzen lassen (ca. 20 min), Wasser vorsichtig dekantieren. Dieser Waschvorgang dient dazu, wachstumshemmende Bestandteile und Hydrolyseprodukte zu entfernen, und wird fünfmal wiederholt. Anschließend auf der Waage auf 300 g + Leergewicht der Flasche (zuvor mit Deckel und Rührfisch ermittelt) auffüllen und autoklavieren (20 min bei 120 C). AGAR-PIPETTEN SOFORT IN EINEN GROßEN Erlenmeyerkolben MIT HEIßEM WASSER STELLEN UND AUSKOCHEN Agarverdünnungsreihe Benötigt werden: Pro Reihe 7 durchnumerierte und beschriftete sterile Reagenzröhrchen mit passenden sterilen Gummistopfen (Ersatzgummistopfen parat haben) 5-fach gewaschenen und sterilisierten Agar (4%) 1 Wasserbad mit 42 C 1 Wasserbad mit 65 C 1 Wasserbad mit kaltem Wasser (Eiswasser) 2 Bunsenbrenner 1 50 ml-fläschchen mit komplettem Medium sterile 1ml, 10ml Pipetten Vorgehen: Agar in der Flasche durch Kochen verflüssigen und bei 65 C flüssig haltenund 3ml in die durchnumerierten und beschrifteten Röhrchen (im Wasserbad (42 C) mit lockerem Stopfen vorgewärmt) geben. Zu den Agar-Röhrchen in dem Wasserbad (42 C) je 6 ml Medium zusetzen Eine Reihe Reagenzgläser aus dem Wasserbadnehmen und bei RT in einen Reagenzglasständer stellen.

27 Methodenskript AG Cypionka Tropfen der Kultur (0,5 ml) in das 1. Röhrchen geben, einmal umschwenken 1 Tropfen ca. 05 ml in das zweite Röhrchen gießen, das erste Röhrchen in das kalte Wasserbad stellen usw. (Das Röhrchen, aus dem gegossen wird, vorher außen abtrocknen, damit nicht Wassertropfen ausverdünnt werden.) Möglichst zügig die Röhrchen mit N 2 /CO 2 (80/20) begasen und bei gewünschter Temperatur inkubieren. Im Agar gewachsene Einzelkolonien können mit 1ml Spritze und Kanüle ausgestochen, mikroskopiert und zur Gewinnung von Reinkulturen erneut in Medium verdünnt werden und gegebenenfalls erneut shaken. Geißelfärbung (nach Ryu) Zunächst wird ein mikroskopisches Präparat einer Bakteriensuspension hergestellt. Sobald der Großteil der Zellen angeheftet ist, wird die Färbelösung zu dem Präparat gegeben. Nach einer Einwirkzeit von 5-15 min sollten die Geißeln sichtbar sein. Lösung I: 5%-ige Phenollösung 10 ml Tanninsäure 2 g AlK(SO 4 ) 2 x 12 H 2 O, ges. Lösung 10 ml Lösung II: ges. Lösung Kristallviolett (12 g/100 ml MeOH) Färbelösung: Lsg.I : Lsg.II = 10 : 1 Catalase test Reagent: (will be provided) 5% H2O2 solution, produced by diluting a 30% stock solution with distilled water. Store in a cool and dark place. Do not touch by hand! Contamination (e.g. dust, metal etc.) provokes corrosion. Procedure: Place some bacterial mass from the middle of one fresh colony on a clean slide. Then give one drop of the diluted H2O2 solution onto it using a clean Pasteur-pipette. Formation of gas (O2) shows catalase activity.

28 Methodenskript AG Cypionka Oxidase test Reagents: H 2 O Ascorbic acid Tetramethyl-p-phenylendiamin-HCl 100 ml 0.1 g 1.0 g Attention, carcinogen! Reagents (will be provided, freshly prepared every day!). Do not touch by hand and do not spill! After using, wash immediately the vessels and pipettes! Procedure: Soak a strip of filter paper (cellulose) with some drops of the reagent (not too wet!). Give some bacterial mass taken from a colony with an inoculation loop on the strip, and rub it in by a rounded glass rod. Blue coloration shows oxidase activity. As a control compare with a preparation of strains of known acitivity (e.g. E.coli). Analyse des Substratspektrums aerober Bakterienisolate Der Substrattest stellt den Mittelpunkt der physiologischen Charakterisierung von Bakterienisolaten dar. Getestet wird das bakterielle Wachstum auf 59 verschiedenen Kohlenstoffverbindungen (Angabe in Klammern = Endkonzentration in mm): Komplexsubstrate: Pepton (0.05 %), Casamino Acids (0.05 %), Hefeextrakt (0.005 %) Polymersubstrate: Cellulose (0.05%), Stärke (0.1 %), Chitin (0.05 %), Xylan (0.05 %), Laminarin (0.05 %) Disaccharide: Saccharose (5), Cellobiose (5), Maltose (5), Trehalose (5) Monosaccharide: Arabinose (5), Rhamnose (5), Xylose (5), Fructose (5), Glucose (5), Mannose (5), Zuckerabkömmlinge: Mannitol (5), Gluconat (5), Glucosamin (5) Carbonsäuren: Formiat (5), Acetat (5), Propionat (1), Butyrat (2.5), Valerat (0.5), Capronat (0.5), Caprylat (0.5), Crotonat (0.2) Dicarbonsäuren: Malonat (5), Succinat (10), Fumarat (5), Malat (5), Tartrat (2) Andere org. Säuren: Glycolat (5), Pyruvat (5), Lactat (10), 2-Ketoglutarat (5), Citrat (2) Alkohole: Methanol (2), Ethanol (5), Propanol (5), Butanol (5), Glycol (5), Glycerin (5), Tween 80 (0.001 %) Aminosäuren: Alanin (2), Arginin (2), Asparagin (2), Cystein (2), Glutamin (2), Isoleucin (2), Phenylalanin (2), Tryptophan (2), Prolin (2) Amine: Betain (2) Aromaten: Benzoat (2), Salicylat (2) Heterozyklen: Nicotinat (2) Der Test wird in 200 µl-mikrotiterplatten (siehe Schema) unter aseptischen Bedingungen angesetzt. Dazu werden 140 µl Medium (s.o.), 40 µl Substratlösung (aus einer Masterplatte) und 20 µl der Bakterienflüssigkultur in jedes Well pipettiert und bei 20 C inkubiert. Es müssen eine zellfreie und eine subtratfreie Kontrolle angesetzt werden! WICHTIG: Zellen vor dem Überimpfen waschen, um den Eintrag von fremden Substraten zu verhindern! Dafür 1.5 ml der Flüssigkultur in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren, den Über-

29 Methodenskript AG Cypionka stand mit einer Pipette abnehmen und mit frischem Medium wieder auf 1.5 ml auffüllen. Alle Arbeitsschritte werden in einer Sterilbank durchgeführt. Die Auswertung erfolgt über die durch bakterielles Wachstum hervorgerufene Trübung bzw. entstehende Bakterienpellets in den einzelnen Wells. Allerdings sollten Stichproben mikroskopisch überprüft werden. WICHTIG: Es muss beachtet werden, dass einige der eingesetzten Substanzen selbst eine Trübung hervorrufen! Abb. Inkubationsschema für Substrattest auf Mikrotiterplatten Recording of growth curves The most important parameter of growth experiments is growth yield per substrate. This is represented by dry weight and cell counts. Growth rates of bacteria cultures are determined by turbidity measurements (optical density, OD) using the Ratio/XR Turbidimeter (HACH, Germany). To convert OD to cell counts, a conversion factor has to be determined. Therefore, a culture exhibiting a strong turbidity is analysed in respect to its cell concentration and then serially diluted. The OD of the dilutions is noted and the respective cell counts calculated (cells/od). Equation to calculate growth rates: µ = growth rates (h -1 ) x = OD (current date) x 0 = OD (at the beginning of exponential growth) t t 0 = period examined (h) µ = ln( x) ( t ln( x t ) 0 0 ) Turbidity measurements of microbial growth The turbidity (OD436 against water) is measured, to estimate the growth yield. The photometer is set to zero with water in a 3 ml-cuvette (if possible from glass) and the OD of the bacteria suspension is measured. At values higher than 0.3 aerobic cultures should be diluted prior to the measurement (with 70 mm phosphate buffer). This is not the case for anaerobically growing cells! These are instead measured against a tube filled with water. When the tubes are measured for the first time, the minimum absorption for each tube is found by turning the tube around in the photometer. This position is marked on the tube with a felt pen, and the same position is used (after adjusting) to measure OD throughout the experiment. Taking samples