NMR Studies of Large Biomolecular Systems

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1 DISS. ETH NO NMR Studies of Large Biomolecular Systems A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by Cédric Eichmann Dipl. Phys. ETH born on June 11, 1981 citizen of Gommiswald (St. Gallen) accepted on the recommendation of Prof. Dr. Roland Riek, examiner Prof. Dr. Gunnar Jeschke, co-examiner Prof. Dr. Gerhard Wider, co-examiner 2011

2 IV Zusammenfassung Die atomare Strukturbestimmung mittels Kernspinresonanz (NMR) im flüssigen Zustand und Röntgenkristallographie ist gut etabliert. Integrale Membranproteine, Proteinaggregate und grosse dynamische Systeme, wie der Komplex zwischen dem Ribosom und der naszierenden Polypeptidkette, stellen noch immer grosse Herausforderungen für die Strukturbiologie dar. Nur wenige hochaufgelöste Strukturen solcher Proteinklassen sind heutzutage vorhanden. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde anhand des α-helikalen Membranproteins YgaP von Escherichia coli, welches in gemischten DHPC-7/LMPG Mizellen ein Molekulargewicht von ~40 kda hat, ein Rezept zur Strukturbestimmung α-helikaler integraler Membranproteine entwickelt. YgaP besteht aus einer lipophilen membranassoziierten und einer N-terminalen zytoplasmatischen Domäne, welche homolog zur Rhodanese Familie der Sulfurtransferasen ist. Es wurden Bedingungen gefunden, die es erlaubten simultan hochaufgelöste NMR Spektren beider Domänen in ihrer natürlichen Konformation aufzunehmen. Die experimentellen Daten ermöglichten die NMR Strukturbestimmung der zytoplasmatischen Rhodanese Domäne und der membranassoziierten homo-dimeren Domäne von YgaP. Die enzymatische Schwefel-Transfer Aktivität der Rhodanese Domäne frei in Lösung und von YgaP wurde mittels Natriumthiosulfat und Kaliumcyanid Titrationsexperimenten untersucht. Dabei wurden die durch die katalytische Reaktion verursachten konformationellen Änderungen in der freien Rhodanese Domäne, der gebundenen Rhodanese Domäne und der transmembranen Domäne von YgaP detektiert. Zusätzlich deutet der Einfluss von Nitroxid auf die freie Rhodanese Domäne auf allosterische Strukturänderungen hin. Spezielles Interesse gilt der Suche nach natürlicheren membranimitierenden Umgebungen als sie in Detergenz-Mizellen vorzufinden sind. Sogenannte Nanodiscs, die aus einer phospholipiden Doppelschicht bestehen, stellen ein solches System dar. Deshalb wurde YgaP in Nanodiscs integriert. Dieser Ansatz resultierte in

3 V einer erhöhten Probenstabilität verglichen mit Detergenz-Mizellen und ermöglichte die Aufnahme zweidimensionaler NMR Spektren. Weiter wurde das entwickelte Rezept zur Strukturbestimmung α-helikaler Membranproteine auf das humane integrale Membranprotein himp7 angewandt, das aus einer N-terminalen extrazellulären und drei nachfolgend transmembranen α-helices besteht. Der zweite Teil der Dissertation befasst sich mit dem Studium naszierender Polypeptidketten am Ribosom-Ausgang. Mittels NMR Spektroskopie wurde die Proteinfaltung eines Polypeptids während der Translation untersucht. Dabei diente die 13 C, 15 N markierte in vivo ribosom-arretierte SH3 Domäne von α-spectrin und C-terminal verkürzte Varianten davon als Modellsystem. Diese Konstrukte ermöglichten Momentaufnahmen des Translationsprozesses zu studieren. Die NMR Experimente zeigten, dass die naszierende SH3 Domäne unstrukturiert bleibt und sich erst in eine kompakte β-blatt Anordnung faltet, wenn die vollständige Sequenzinformation vorhanden ist. Zusätzlich wurde gezeigt, dass das Ribosom weder bedeutende konformationelle Einschränkungen auf die SH3 Domäne ausübt, noch signifikant mit vorhandenen ungefalteten naszierenden Abschnitten der SH3 Domäne interagiert. Die Daten deuten auf eine domänenweise Faltung der SH3 Domäne am Ribosom hin, ohne intermediäre Faltungzustände entscheidend zu begünstigen. Die Domäne folgt einem thermodynamisch vorteilhaften Pfad, in welchem die sequentiellen Faltungseinheiten stabilisiert werden. Dabei werden während des ko-translationellen Faltungsprozesses die lokalen kinetischen Minima umgangen.

4 VI Summary The determination of atomic resolution structures by solution state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and X-ray crystallography is well established. However, integral membrane proteins, protein aggregates, and large dynamical systems such as the complex between the ribosome and the nascent chain pose great challenges to structural biology. Up to now, only a few highresolution structures of these classes of proteins are available. In the first part of this thesis, the α-helical integral membrane protein YgaP from Escherichia coli with a molecular weight of ~40 kda in mixed DHPC-7/LMPG micelles was used as a model system to establish a NMR recipe for α-helical integral membrane protein structure determination. In addition to the lipophilic transmembrane region, YgaP consists of a N-terminal cytoplasmic domain homologous to the rhodanese family of sulfurtransferases. Conditions were found which allowed recording high-resolution NMR spectra while conserving simultaneously the native conformation of both domains. The experimental data led to the solution NMR structure of the cytoplasmic rhodanese domain and the homodimeric transmembrane domain of YgaP. The enzymatic sulfur-transfer activity of the free form of rhodanese and fulllength YgaP was investigated performing series of titrations with sodium thiosulfate and potassium cyanide. It was shown that conformational changes occur within the free form of rhodanese, the rhodanese domain, and the transmembrane α-helices of YgaP due to the catalytic reaction. Additionally, the influence of nitric oxide on the free form of rhodanese provided evidence for allosteric structural changes. The search for more natural membrane mimetics than detergent micelles is of special interest. As an alternative approach YgaP was reconstituted in selfassembling phospholipid bilayer nanodiscs yielding enhanced sample stability when compared with detergent micelles and allowed recording two-dimensional NMR spectra.

5 VII The developed recipe for structure determination of α-helical membrane proteins was further applied to the human integral membrane protein himp7, which consists of an extracellular N-terminal α-helix followed by three transmembrane α-helices. A second large biomolecular system studied in this thesis is the nascent chain of a polypeptide at the ribosome exit. To elucidate the folding of a polypeptide during translation, NMR spectroscopy was employed to monitor the conformation of the SH3 domain from α-spectrin at sequential stages of elongation via in vivo ribosomearrested 13 C, 15 N labeled nascent polypeptides. These nascent chains exposed either the entire SH3 domain or C-terminally truncated segments thereof, thus providing snapshots of the translation process. It was shown that nascent SH3 polypeptides remain unstructured during elongation but fold into a compact, native-like β-sheet assembly when the entire sequence information is available. Moreover, the ribosome neither imposes major conformational constraints nor significantly interacts with exposed unfolded nascent SH3 domain moieties. The data provided evidence for a domainwise folding of the SH3 domain on ribosomes without significant population of folding intermediates. The domain follows a thermodynamically favorable pathway in which sequential folding units are stabilized, thus avoiding local kinetic traps during the process of cotranslational folding.