11. Isolierung von Plasmid DNA, Restriktionsverdau und DNA-Elektrophorese

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1 11. Isolierung von Plasmid DNA, Restriktionsverdau und DNA-Elektrophorese 11.1 Einführung in die Problemstellung Plasmid-DNA In der Gentechnik spielen Plasmide als Vektoren eine herausragende Rolle für die Klonierung und Expression von Genen. Plasmide sind kleine, extrachromosomale, ringförmige und sich autonom vermehrende DNA Moleküle, die in vielen Bakterien vorkommen. Sie enthalten Gene, die Antibiotika-Resistenzen verleihen. Sie kommen in unterschiedlicher Kopienzahl in den Bakterienzellen vor. Zum Beispiel tritt das bekannte Plasmid pbr 322 in E. coli in Kopien pro Zelle auf, während die Plasmide der puc-reihe Moleküle pro Zelle erreichen. Da die DNA von Plasmiden wesentlich kleiner ist als selbst zerstückelte chromosomale DNA und zudem die Plasmidringe in einer superhelikalen Form vorkommen, läßt sich diese DNA leicht abtrennen und in mehr oder weniger reiner Form gewinnen. Die Isolierung geringer Mengen von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen ist für die Analyse rekombinanter Klone essentiell. Es existieren viele verschiedene Miniprep-Verfahren zur Isolierung von Plasmid DNA. Aus der Vielzahl der Verfahren haben sich insbesondere die Methode der alkalischen Lyse nach Birnboim und die Plasmidisolierung an einer DNA-bindenden Matrix in Nukleobond Säulchen bewährt Restriktionsendonukleasen (Restriktasen) Viele DNA-Moleküle sind für eine detaillierte Analyse zu lang. Durch gezielte Spaltung mit Restriktionsendonukleasen, die spezifisch für definierte Basensequenzen sind, werden definierte Spaltfragmente diskreter Länge gewonnen. Durch Verwendung unterschiedlicher Restriktasen lassen sich charakteristische Spaltkarten für eine bestimmte DNA-Species, wie z.b. ein ringförmiges Plasmid, aufstellen. Im Praktikumsversuch wird das ringförmige Plasmid pc3.1 TOPO UbcH9 (5523 bp) verwendet. Für die Restriktasen BamH I (Spaltsequenz 5'-GGATCC-3') und Xho I (Spaltsequenz 5'- CTCGAG-3') ist je ein Spaltort auf pc3.1 TOPO UbcH9 vorhanden. Sie befinden sich vor beziehungsweise nach UbcH9. Spaltung mit einer der beiden Restriktasen führt zu einer Linearisierung des Ringes, aber die Schnitte werden von den Enzymen an unterschiedlichen Stellen gesetzt. Wirken beide Enzyme gleichzeitig (Doppelspaltung), liefert das ringförmige Plasmid 2 Spaltstücke. Hierbei wird UbcH9 (477 bp, aus Homo sapiens cdna kloniert) freigesetzt DNA-Elektrophorese Alle DNA-Moleküle besitzen eine negative elektrische Nettoladung. Diese ist nahezu unabhängig vom ph-wert des Mediums. Für alle DNA-Moleküle ist das Verhältnis von Ladung/ Masse etwa gleich. Eine elektrophoretische Trennung wird daher im Wesentlichen nach Unterschieden in der Molekülgröße und Molekülform erfolgen. Zur elektrophoretischen Auftrennung wird die Methode der Trägergelelektrophorese angewendet. Die Technik der Trägergelelektrophorese ist einfach und sehr leistungsfähig. Die Lage der DNA im Gel kann direkt durch Anfärben mit Ethidiumbromid im UV-Licht (gefährliche Cancerogene!) bestimmt werden ng DNA sind noch nachweisbar. Die Porengröße des Trägergels wird der Größe der zu trennenden DNA angepaßt. Polyacrylamidgele werden zur Trennung kleiner Fragmente (5-500 bp) eingesetzt. Häufig wird Agarose als Träger verwendet. Hierbei handelt es sich um ein lineares Polysaccharid, das aus Rotalgen gewonnen wird 1

2 (teuer!). Agarose wird in Gegenwart des gewünschten Puffers geschmolzen. Sie erstarrt nach dem Erkalten zu einer Matrix, deren Porengröße durch die Agarosekonzentration bestimmt wird. Tab. 1 zeigt die wirksamen Trennbereiche für lineare DNA-Moleküle. %(w/v) Agarose im Gel Trennbereich für lineare DNA Moleküle (kb) Die Wanderungsgeschwindigkeit (Wanderungsstrecke) ist dem Logarithmus (lg) der Zahl der Basenpaare umgekehrt proportional. Moleküle mit gleicher Zahl an Basenpaaren, aber unterschiedlicher Konformation (ringförmige DNA mit oder ohne Superhelixwindungen, Topoisomere) haben andere Wanderungsgeschwindigkeiten als lineare Moleküle. Die relativen Beweglichkeiten der verschiedenen Formen sind abhängig von der Gelkonzentration. Die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Moleküle ist außerdem von der angelegten Spannung (nicht größer als 5 V/cm; ca V/Gel) abhängig. Temperatur und Basenzusammensetzung der DNA sind in Agarosegelen für den Trenneffekt von untergeordneter Bedeutung. Von Einfluß auf die Wanderungsgeschwindigkeit ist die Zusammensetzung der Elektrophoresepuffer. Sie enthalten EDTA und Tris-Acetat (TAE), Tris- Borat (TBE) oder Tris-Phosphat (TPE) und werden im ph-bereich bei 50 mm Konzentrationen verwendet. Für gewöhnliche Elektrophoresen wird auf TAE als Elektrophoresepuffer zurückgegriffen Trennung von Topoisomeren durch Agarosegel-Elektrophorese Chromosomale DNA von Prokaryoten, Plasmid-DNA, z.t. auch Phagen-DNA liegen in vivo als in sich geschlossene DNA-Ringe vor. Auch die DNA von Eukaryoten bildet durch Anheftung an die Kernmembran DNA-Schleifen. Diese Ringstrukturen bilden zusätzlich zur normalen Doppelhelix Superhelixwindungen aus, deren Zahl variieren kann. Man bezeichnet die DNA-Moleküle mit unterschiedlichen Windungszahlen als Topoisomere. Die völlig entspannte DNA ohne Superhelixwindungen nennt man relaxierte DNA. Die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld ist für diese unterschiedlichen geometrischen Formen verschieden, so daß man sie voneinander trennen kann. In vivo wird die Superstruktur der DNA durch Topoisomerasen enzymatisch reguliert. Alle Topoisomerasen können superhelikale DNA in relaxierte DNA umwandeln. In Abhängigkeit vom Reaktionsmechanismus unterscheidet man Topoisomerasen vom Typ I und Typ II, je nachdem, ob die Reaktion über intermediäre Bildung eines Einzelstrangbruches oder eines Doppelstrangbruches in der DNA erfolgt. Topoisomerasen vom Typ II sind ATP-abhängig. In Prokaryoten kommt eine unikale Topoisomerase II vor, die Gyrase, die in relaxierte DNA Superhelixwindungen einführen kann. Im Praktikumsversuch sollen verschiedene Konformationszustände der DNA nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgt durch die unterschiedlichen Wanderungsstrecken im Agarosegel. 2

3 11.2 Aufgabenstellung und Versuchsdurchführung Aus Kulturen von E. coli-bakterien mit dem Plasmid pc3.1 TOPO UbcH9 ist das Plasmid pc3.1 TOPO UbcH9 zu isolieren. Dies erfolgt mit dem Kit von Macherey-Nagel (Plasmid-DNA Purification, Nucleobond; s. Web-Seite für Details) nach der im Praktikum ausgehändigten Vorschrift. Das Prinzip hierbei ist, daß Bakterien ohne Schädigung chromosomaler DNA lysiert werden, und die kleinen ringförmigen Plasmide über eine Säule zunächst gebunden und dann eluiert werden. Benötigte Materialien: Bakterienkolonie; LB-Medium, Ampicillin (100 µg/ml); Vorkultur ÜN, 37 C). Am Plasmid pc3.1 TOPO UbcH9 sind zu analysieren: Linearisierung des ringförmigen Plasmids (BamH I oder Xho I) Bildung von Fragmenten durch Doppelspaltung (BamH I und Xho I) Analyse der DNA-Konformationsisomere Achtung: 1. EtBr ist carcinogen und deshalb mit Sorgfalt zu handhaben (Hautkontakt vermeiden). 2. Bei Anwendung von UV-Licht Augen schützen, Aufenthalt in UV-Umgebung auf die notwendige Zeit begrenzen Reaktionsansätze Die Enzyme sind grundsätzlich auf Eis aufzubewahren! Zügiges Arbeiten und das genaue und rechtzeitige Lesen von Versuchsanweisungen sind essentiell im Labor. Unverdaut 19 µl H 2 O dd 60 min bei 37 o C inkubieren Linearisierung 0.5 µl BamH I oder Xho I 2 µl Puffer Tango (Fermentas) (1 x) 16.5 µl H 2 O dd 60 min bei 37 o C inkubieren Doppelspaltung (Enzyme BamH I plus XhoI) 0.5 µl BamH I und Xho I 4 µl Puffer Tango (Fermentas) (2 x bei Doppelverdau) 14 µl H 2 O dd 60 min. bei 37 o C inkubieren 3

4 Längenstandard 5 µl SmartLadder oder NEB-Marker Analyse der Reaktionsprodukte durch Elektrophorese im 1 %igen Agarosegel 1 g Agarose ml TAE-Puffer (1x) erhitzen, gut homogenisieren, abkühlen auf ca. 50 o C, 10 µl EtBr (1 mg/ml) zugeben, in Gelkammer mit Kamm einfüllen, nach Erkalten Kamm ziehen, TAE-Puffer (1x) einfüllen. Proben auftragen: zuvor mit ~7 µl DNA-Ladepuffer (4 x) versetzen. Elektrophorese 100 V, ca. 1 h Auftragsschema 1 Marker (DNA-Längenstandards), 5 µl 2 pc3.1 TOPO UbcH9 DNA (0.5 µg ) 3 pc3.1 TOPO UbcH9 DNA (0.5 µg ) X geschnitten mit BamH I 4 pc3.1 TOPO UbcH9 DNA (0.5 µg ) X geschnitten mit Xho I 5 pc3.1 TOPO UbcH9 DNA (0.5 µg ) X geschnitten mit BamH I+Xho I Auswertung Dokumentation im UV Kennzeichnung der Slots Abschätzung der Länge der Spaltstücke unter Zuhilfenahme des Längenstandards (Beziehung Fragmentgröße/Wanderungsstrecke) Reagenzien TAE (Tris-Acetat-Ethanol) (50 x) (Agarose Gelelektrophorese) DNA-Probenpuffer (4 x) (Agarose Gelelektrophorese) EDTA 0.5 M 242 g Tris-base 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) 57.1 ml HAc ad 1 l H 2 O 50% (w/v) Glycerol 1 mm EDTA 0.4% (w/v) Bromphenolblau 0.4% (w/v) Xylencyanol ph 8.0 (ph mit NaOH einstellen) 11.3 Kontrollfragen 1. Welche Struktureigenschaften von DNA sind für die Trennung von DNA-Molekülen durch Trägergelelektrophorese zu berücksichtigen? 2. Was sind Restriktionsendonukleasen und welche Bedeutung haben sie für die DNA-Strukturanalyse und die Klonierung? 4

5 3. Welche typischen Eigenschaften haben ringförmige DNA-Moleküle und wie verhalten sie sich in der Gelelektrophorese? Warum hat DNA eine negative elektrische Ladung? Zu welchem Pol des elektrischen Felds wandert DNA? Wie funktioniert DNA-Ladepuffer? 4. Woraus besteht DNA? Welche Bindungen halten sie zusammen? Struktur von Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin, Uracil? 5. Gibt es nackte DNA? Wie wird die Ladung der DNA kompensiert? Warum ist das wichtig? Was sind Histone, Spermidin, Spermin, und Putrescin? 6. Warum existieren vier Nukleotide und nicht nur eins? Was ist Uracil? 7. Sie inkubieren DNA und ein sie potentiell schneidendes Restriktionsenzym eine Stunde bei 4 C/ 37 C/ 60 C. Was erwarten Sie? 8. Warum ist EtBr gefährlich? Warum bedeutet es ein sehr hohes Risiko bei Schwangerschaft? 9. Worauf beruht das Plasmid-Isolierungsverfahren, nach dem mit dem Kit von Macherey und Nagel gearbeitet wird? Was wäre passiert, wenn man das Bakterienlysat ausgiebig gevortext oder gar mittels Spritzen geschert hätte? 11.4 Literaturhinweise Informationen zum Vektor (hier nicht im Detail wichtig) sind zu finden unter: Stryer, L., Lehrbuch der Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg-Berlin oder analoges Lehrbuch der Biochemie, Kapitel: Die genetische Information der DNA sowie weitere zur Analyse, Konstruktion und Klonierung von DNA relevante Kapitel. 5

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