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1 Inhalt Einleitung... 2 Materialien... 4 Gewinnung der Bakterien... 6 Zerstörung der Bakterien... 7 Trennung von Plasmid-DNA und genomischer DNA... 8 Reinigung der Plasmid-DNA Elution der gereinigten Plasmid-DNA Bestimmung der Plasmid-DNA Konzentration Nachweis des isolierten Plasmid-DNA mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese Protokoll: Plasmidpräparation

2 Einleitung Nukleinsäuren lassen sich aus den unterschiedlichen Zellen und Geweben isolieren und aufreinigen. In der folgenden Übersicht (Abb. 1) sind einige Möglichkeiten dargestellt. Es ist möglich sowohl DNA als auch RNA zu isolieren. Plasmid-DNA lässt sich sowohl aus Bakterien oder Hefezellen isolieren. Abhängig von der Menge an benutztem Zellmaterial, unterscheidet man Mini-, Midi- oder Maxipräparation. Genomische DNA oder RNA lassen sich aus Pflanzen, Pilzen oder Tieren gewinnen. Häufig wird DNA aus Blutzellen, wie Lymphozyten oder unterschiedlichen Geweben gewonnen. Darüber hinaus werden DNA-Fragmente nach einer Agarosegelelektrophorese oder einer Polymerasekettenreaktion aufgereinigt. Abb. 1: Isolierung von Nucleinsäuren 2

3 Abb. 2 zeigt den Ablauf einer Plasmid-DNA Isolierung mit wenig Zellmaterial. Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 4 Schritt 5 Abb. 2: Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien, Mini-Präparation Zunächst wird eine Übernachtkultur der Bakterien, aus denen die Plasmide isoliert werden sollen, angelegt. Diese wird zentrifugiert, um die Bakterien vom Nährmedium zu befreien. In Schritt 1 werden die Zellen mit einem lysierenden Puffer behandelt. Er enthält Natriumhydroxid und Natriumdodeylsulfat. Zellwände und Zellmembranen werden zerstört, genomische DNA denaturiert. Ein Großteil der Plasmid-DNA bleibt aufgrund des hohen Grades der Überspiralisierung in seiner ursprünglichen Form erhalten. In Schritt 2 werden genomische DNA und Zellbestandteile durch Zentrifugation von der Plasmid- DNA getrennt. Die Plasmid-DNA bleibt in Lösung, während das restliche Zellmaterial pelletiert wird. In Schritt 3 wird der Überstand auf einen Filter gegeben. Die Nukleinsäuren binden spezifisch an die Filteroberfläche aus Glasfasern. In Schritt 4 werden Waschpuffer durch den Filter geschickt. Die an den Filter gebundene DNA wird gereinigt: Salze, Protein- und Zellreste werden von den Waschpuffern mitgenommen, die DNA bleibt am Filter gebunden. Am Schluss, in Schritt 5, wird die Plasmid-DNA mit einem salzarmen Elutionspuffer vom Filter gewaschen. 3

4 Materialien Für die Plasmid-DNA Präparation werden folgende Materialien benötigt: Abb. 3: Materialien für eine Mini-Präparation 1 circa 1 5 ml einer Übernachtkultur von Bakterien, wenn high copy Plasmide isoliert werden sollen, 2 eine Tischzentrifuge, 3 eine Stoppuhr, 4 eine autoklavierbare Flasche für flüssigen bakterienhaltigen Abfall 5 und verschiedene Lösungen und Puffer für die Isolierung. 6 Der Suspensions- und Bindepuffer werden auf Eis gelagert. 7 Weiterhin sterile 1,5 ml Reaktionsgefäße, 8 und einen Nucleinsäure bindenden Filter mit Auffanggefäß. Darüber hinaus benötigt man eine Zentrifuge für die Bakterienkultur, Mikropipetten für Volumina zwischen 100 und 1000 µl. Die Pipettenspitzen sollten steril sein, um eine mögliche Kontamination der zu isolierenden DNA möglichst auszuschließen. 9 Tragen Sie zur eigenen Sicherheit Latexhandschuhe: Einige der Gebrauchslösungen enthalten Natruimhydroxid. 4

5 Es gibt eine breite Palette an Kits, die alle benötigten Lösungen und Filter enthalten. Die Zusammensetzung der einzelnen Lösungen mag sich je nach Hersteller ein wenig unterscheiden, aber alle arbeiten nach dem gleichen Prinzip. Der Supensionspuffer ist leicht alkalisch und enthält RNAse, um freigesetzte RNA zu zerstören. Der Lysepuffer ist alkalisch. Er enthält Natriumhydroxid und Natriumdodecylsulfat. Natriumdodecylsulfat zerstört die Bakterienzellwand. Natriumhydroxid denaturiert Proteine und genomische DNA. Kleine zirkuläre und stark überspiralisierte Plasmid-DNA wird kaum angegriffen. Der Bindepuffer ist sauer. Sein hoher Anteil an Kaliumacetat bewirkt eine Neutralisation und damit die Renaturierung der vorher denaturierten genomischen DNA. Aufgrund ihrer Größe kommt es allerdings zu keiner geordneten Renaturierung: DNA, Proteine und weitere Zellreste ballen sich zu einer verworrenen Masse zusammen und fallen aus. Kleine Plasmidringe, die denaturiert sind können sich leichter renaturieren und bleiben in Lösung. Die Präzipitation kann durch Kühlung beschleunigt werden, daher sollte der Bindepuffer auf Eis gelagert werden. Mit Hilfe von zwei Waschpuffern werden Verunreinigungen vom DNA-Filter gewaschen. Der Elutionspuffer löst die Plasmid-DNA vom Filter. 5

6 Gewinnung der Bakterien 1. Bakterien einer Übernachtkultur werden für 5 Minuten bei circa 4000 U/Min. zentrifugiert. Zusätzlich sollte ein Gegengewicht gegenüber dem Kulturröhrchen mit den Bakterien in der Zentrifuge platziert werden. 2. Abhängig vom Zentrifugentyp und den zentrifugierten Röhrchen, müssen vor dem Zentrifugieren die Verschlusskappen abgenommen werden 3. Nach der Zentrifugation sollten das Bakterienpellet und klares Medium zu unterscheiden sein. 2 1 Abb. 4: Bakterienpellet (1) und klares Zellmedium (2) 4. Der klare Überstand wird in die Abfallflasche gegeben. 5. Das flüssige Medium sollte möglichst vollständig entfernt werden, auch kleine Reste können das Ergebnis schmälern. Daher wird das Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch gestellt. Flüssigkeit läuft heraus, das Pellet bleibt im Röhrchen Abb. 5: Entfernung letzter Reste an Medium 6

7 Zerstörung der Bakterien 6. Es werden 250 µl Suspensionspuffer zum Pellet gegeben. Der Supensionspuffer ist leicht alkalisch und enthält RNAse, um später freigesetzte RNA zu abzubauen. 7. Das Bakterienpellt wird durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen resuspendiert. Abb. 6: Zugabe von Suspensionspuffer zum Bakterienpellet 8. Nun kann die Suspension in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt werden. 9. Es werden 250 µl Lysepuffer zu dem resuspendierten Pellet gegeben. Wie schon erwähnt, ist der Lysepuffer alkalisch. Er enthält Natriumhydroxid und Natriumdodecylsulfat. Natriumdodecylsulfat zerstört die Bakterienzellwand. Natriumhydroxid denaturiert Proteine und genomische DNA. Die kleine zirkuläre und stark überspiralisierte Plasmid-DNA wird kaum angegriffen. 10. Es wird vorsichtig gemischt. Das Reaktionsgefäß wird 3 bis 6 Mal invertiert. Die genomische DNA darf nicht zerbrochen werden, daher sollte auf keinen Fall gevortext werden. 11. Es wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Beim Öffnen des Reaktionsgefäßes nach 5 Minuten kann man häufig einen feinen Faden freigesetzter genomischer DNA zwischen Deckel und dem Gefäßrand beobachten. Abb. 7: DNA-Faden 7

8 Trennung von Plasmid-DNA und genomischer DNA 12. Es werden 350 µl kalter Bindepuffer zugegeben 13.. und vorsichtig gemischt. Das Reaktionsgefäß wird dazu 3 bis 6 Mal invertiert. Der Bindepuffer ist sauer. Sein hoher Anteil an Kaliumacetat bewirkt eine Neutralisation und damit die Renaturierung der vorher denaturierten genomischen DNA. Aufgrund ihrer Größe kommt es allerdings zu keiner geordneten Renaturierung DNA, Proteine und Zellreste ballen sich zusammen und fallen aus. Kleine Plasmidringe, die denaturiert sind können sich leichter renaturieren und bleiben in Lösung. Abb. 8: Vorsichtiges Mischen durch Invertieren des Reaktiongefäßes 8

9 14. Das Reaktionsgefäß wird für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Kälte beschleunigt den Prozess. 15. Anschließend wird 10 Minuten bei U/Min. in der Tischzentrifuge zentrifugiert. 16. Nach der Zentrifugation hat sich ein weiß-graues Pellet im unteren Bereich des Reaktionsgefäßes gesammelt. Es handelt sich um Zelltrümmer und genomische DNA. Abb.9: Ausfallende Zelltrümmer mit genomischer DNA ( ) vor Zentrifugation Abb. 10: Ausgefallene Zelltrümmer und genomische DNA ( ) nach Zentrifugation 17. Der Überstand enthält Plasmid-DNA. Er wird vorsichtig und ohne Pelletreste auf den Filter pipettiert. Der Filter sollte in einem Auffangefäß stehen. 18. Filter mit Auffangefäß werden 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. Die Lösung passiert den Filter, die Plasmid-DNA bindet am Filtermaterial. 9

10 Reinigung der Plasmid-DNA Nach der Zentrifugation ist die Plasmid-DNA an den Filter gebunden, das Auffanggefäß enthält den Bindepuffer. 19. Die Flüssigkeit wird in das Abfallgefäß entsorgt. Das Auffanggefäß kann weiter verwendet werden. 20. Auf den Filter werden 500 µl Waschpuffer I gegeben. Mit Hilfe des Waschpuffers werden Verunreinigungen vom Filter gewaschen, die neben der Plasmid-DNA dort gebunden haben. 21. Das Ensemble wird 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. 22. Der Durchlauf wird verworfen. 1 2 Abb. 11: Waschschritt I, Verwerfen des Durchlaufs, Filter (1), Auffanggefäß (2) 23. Für einen zweiten Waschschritt werden 700 µl Waschpuffer II auf den Filter pipettiert 24. Wieder wird für 1 Min. bei U/Min. zentrifugiert. 25. Der Durchlauf wird verworfen. 26. Das gesamte Ensemble wird abermals für 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. Dadurch wird noch im Filter verbliebende Flüssigkeit eliminiert. 10

11 Elution der gereinigten Plasmid-DNA 27. Das Auffanggefäß wird durch ein sauberes und steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß ersetzt Abb. 12: Vor der Elution wird der Filter (1) in ein sauberes steriles Reaktionsgefäß gestellt (2). Das Auffanggefäß (3) wird verworfen. 28. Es werden 100 µl Elutionspuffer auf den Filter pipettiert. Der salzarme Elutionspuffer löst die Plasmid-DNA vom Filter. 29. Alles wird für 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. 30. Der Filter wird verworfen. Das Reaktionsgefäß enthält nun die gereinigte Plasmid-DNA. 2 1 Abb. 13: Der Filter (1) wird weg geworfen, das Reaktionsgefäß (2) enthält die gereinigte Plasmid-DNA 11

12 Bestimmung der Plasmid-DNA Konzentration Mit Hilfe eines UV-Photometers kann die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt werden. Anhand des Verhältnisses der Optischen Dichten bei 260 nm : 280 nm lässt sich die Reinheit der Aufarbeitung überprüfen. Eine proteinfreie Nucleinsäurelösung weist ein Verhältnis der Absorption von 1.8 bis 2.0 auf. Für den Nullabgleich benutzt man das Lösemittel, indem auch die DNA gelöst wurde. 1. Für die Konzentrationsbestimmung wird die DNA-Lösung der Aufreinigung verdünnt. Üblich sind Verdünnungen zwischen 1:10 und 1:100. Die Verdünnung kann man direkt in der Messküvette herstellen. Zunächst wird Lösemittel vorgelegt, die DNA wird dazu pipettiert. 2. Vermischt wird durch Auf- und Abpipettieren. 3. Für den Nullabgleich wird eine Küvette, die nur Lösemittel enthält in das Photometer gestellt. Nach erfolgtem Nullabgleich zeigt das Photometer eine Absorption von Null. 4. Nun wird die DNA-Probe gemessen. Einen Absorptionswert von 1 erhält man bei einer ungefähren Konzentration 50 μg doppelsträngiger DNA pro ml. Ausgehend von diesem Wert lässt sich über die eigene gemessene Absorption die Konzentration der DNA leicht berechnen. Abb. 14: Messung der Absorption der Probe mit dem UV-Photometer 12

13 Nachweis des isolierten Plasmid-DNA mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese Mit Hilfe eines Restriktionsansatzes und anschließender elektrophoretischer Auftrennung der erhaltenden DNA-Fragmente, kann man testen, ob die richtige DNA isoliert wurde. 1. Für einen 20ul Restriktionsansatz werden entsprechende Volumina folgender Reagenzien in ein sauberes und steriles Reaktionsgefäß pipettiert: Steriles deionisiertes Wasser, ein für das Restriktionsenzym passender Restriktionspuffer, Volumen an DNA-Lösung, welches 1μg DNA enthält und ein passendes Restriktionsenzym. Restriktionsenzyme sind temperaturempfindlich. Sie sollten immer auf Eis gelagert werden 2. Der Ansatz wird vorsichtig gemischt. 3. Durch kurzes Zentrifugieren des Ansatzes sammeln sich alle Komponenten sicher am Boden des Reaktionsgefäßes. 4. Der Ansatz wird eine Stunde bei 37 C inkubiert. 5. Nach der Inkubationszeit wird das Reaktionsgefäß nochmals kurz zentrifugiert, um eventuell gebildetes Kondensat mit dem Reaktionsansatz zu vereinen. 6. Durch Zugabe von DNA-Auftragepuffer wird die Restriktionsreaktion gestoppt. 7. Anschießend wird wieder kurz zentrifugiert. Alle Komponenten sammeln sich sicher am Gefäßboden. Der DNA-Größenmarker / die DNA-Leiter kann ebenfalls kurz zentrifugiert werden. 8. Dann werden der Restriktionsansatz und die DNA-Leiter vorsichtig in die Taschen des gefluteten Agarosegels pipettiert. 9. Der Deckel der Elektrophoresekammer wird geschlossen. Es wird eine Gleichspannung von circa 100 V angelegt. Die DNA-Fragmente sollten zur Anode wandern. 10. Abhängig von der Größe des Gels, läuft die Elektrophorese zwischen 30 Minuten und einer Stunde. Abb. 15: Auftragen der Proben in die Geltaschen 13

14 Das Photo zeigt das Ergebnis einer Gelelektrophorese. Die DNA wurde mit Ethidiumbromid* angefärbt. Kathode (-) Taschen In Spur 1 wurde die Plasmid-DNA aufgetragen. Das Plasmid wurde vom Restriktionsenzym an zwei unterschiedlichen Stellen geschnitten. Es sind zwei Fragmente zu erkennen. Anode (+) 1 2 Abb. 16: Agarosegelelektrophorese Spur 2 zeigt die DNA-Leiter. Sie enthält Fragmente folgender Größen: bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3000 bp 2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp * Hinweis: Beim Arbeiten mit Ethidiumbromid sollten Nitrilhandschuhe getragen werden. 14

15 Protokoll: Plasmidpräparation Materialien Für eine Plasmidpräparation aus Bakterienwerden folgende Materialien und Reagenzien benötigt: circa 1 5 ml einer Übernachtkultur von Bakterien, wenn high copy Plasmide isoliert werden sollen, eine Zentrifuge für die Bakterienkultur, eine Tischzentrifuge, eine Stoppuhr, eine autoklavierbare Flasche für flüssigen bakterienhaltigen Abfall verschiedene Lösungen und Puffer für die Isolierung* sterile 1,5 ml Reaktionsgefäße, einen Nukleinsäure bindenden Filter mit Auffanggefäß, Mikropipetten für Volumina zwischen 100 und 1000 µl und sterile Pipettenspitzen, Latexhandschuhe. * Es gibt eine breite Palette an Kits, die alle benötigten Lösungen und Filter enthalten. Üblich sind Suspensionspuffer Lysepuffer Bindepuffer Waschpuffer I Waschpuffer II Elutionspuffer. Gewinnung der Bakterien 1. Ca. 5 ml Bakterien einer Übernachtkultur werden für 5 Minuten bei circa 4000 U/Min. zentrifugiert. Es sollte ein Gegengewicht gegenüber dem Kulturröhrchen mit den Bakterien in der Zentrifuge platziert werden. 2. Abhängig vom Zentrifugentyp und den Röhrchen, müssen vor dem Zentrifugieren die Verschlusskappen abgenommen werden. 3. Nach der Zentrifugation sollten das Bakterienpellet und klares Medium zu unterscheiden sein. 4. Der klare Überstand wird in eine autoklavierbare Abfallflasche gegeben. 5. Das Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch gestellt, das flüssige Medium sollte möglichst vollständig herauslaufen. Zerstörung der Bakterien 6. Es werden 250 µl Suspensionspuffer zum Pellet gegeben. 7. Das Bakterienpellt wird durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen vollständig resuspendiert. 8. Bei Bedarf kann die Suspension in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt werden. 9. Es werden 250 µl Lysepuffer zu dem resuspendierten Pellet gegeben. 10. Zum Mischen wird das Reaktionsgefäß 3 bis 6 Mal invertiert. Nicht vortexen. 11. Anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 15

16 Trennung von Plasmid-DNA und genomischer DNA 12. Es werden 350 µl kalter Bindepuffer zugegeben. Zelltrümmer fallen aus. 13. Zum Mischen das Reaktionsgefäß 3 bis 6 Mal invertieren. 14. Das Reaktionsgefäß wird für 5 Minuten auf Eis inkubiert. 15. Anschließend wird 10 Minuten bei U/Min. in der Tischzentrifuge zentrifugiert. 16. Nach der Zentrifugation hat sich ein weiß-graues Pellet im unteren Bereich des Reaktionsgefäßes gesammelt. 17. Der Überstand enthält Plasmid-DNA. Er wird vorsichtig und pelletfrei auf den Filter pipettiert. Der Filter sollte in einem Auffangefäß stehen. 18. Filter mit Auffangefäß werden 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. Reinigung der Plasmid-DNA 19. Die Flüssigkeit wird in das Abfallgefäß entsorgt. Das Auffanggefäß kann weiter verwendet werden. 20. Auf den Filter werden 500 µl Waschpuffer I gegeben. 21. Das Ensemble wird 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. 22. Der Durchlauf wird verworfen. 23. Für einen zweiten Waschschritt werden 700 µl Waschpuffer II auf den Filter pipettiert 24. Wieder wird für 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. 25. Der Durchlauf wird verworfen. 26. Das gesamte Ensemble wird abermals für 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. Dadurch wird noch im Filter verbliebende Flüssigkeit eliminiert. Elution der gereinigten Plasmid-DNA 27. Das Auffanggefäß wird durch ein sauberes und sterlies 1,5 ml Reaktionsgefäß ersetzt. 28. Es werden 100 µl Elutionspuffer auf den Filter pipettiert. 29. Filter mit Reaktionsgefäß werden für 1 Minute bei U/Min. zentrifugiert. 30. Der Filter wird verworfen. Das Reaktionsgefäß enthält nun die gereinigte Plasmid-DNA. 16

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