Molekularbiologische Übungen I. Kolloquiumsunterlagen. Beispiel: E.coli

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1 Kolloquiumsunterlagen Seite 1 Molekularbiologische Übungen I Kolloquiumsunterlagen Beispiel: E.coli a.o. Prof. Mag. Dr. Herta Steinkellner PD Mag. Dr. Christian Luschnig

2 Kolloquiumsunterlagen Seite 2 Einführung: Molekularbiologische Verfahren unterliegen einer raschen Weiterentwicklung. Viele Methoden konnten sich deshalb so rasch entwickeln, da sie dem großen Erfahrungsschatz entstammen, der im Umgang mit Bakterien und Bakteriophagen gewonnen wurden. Escherichia coli ist mit Abstand der wichtigste Organismus der Molekularbiologie. Fast jede gentechnische Modifikation wird zuerst in E.coli realisiert und das eigentliche Klonieren, d.h. das Vereinzeln und die Vervielfältigung von einem bestimmten DNA-Abschnitt, findet nahezu ausnahmslos in E. coli statt. Die Basis des Klonierens ist die Isolierung, die Modifikation und die Verknüpfung spezifischer DNA Moleküle zu neuen Funktionseinheiten. (Der Begriff wird heute allerdings viel weiter gefasst und wird als Überbegriff für gentechnisches Arbeiten im Allgemeinen verwendet). Damit die neu kombinierte DNA schließlich in E. coli erhalten bleibt braucht man geeignete Vektorsysteme (Plasmide) und Verfahren, mit deren Hilfe sich die neu kombinierte DNA effizient in die E.coli Zellen einschleusen lässt (Transformation). Ziel dieses Beispiels ist (i) das Kennenlernen einiger einfacher Klonierungsstrategien und der Umgang mit den wichtigsten DNA-modifizierenden Enzymen, (ii) die Herstellung von Bakterienzellen zur Transformation, (iii) sowie eine einfache Methode zur Isolierung und Analyse von Plasmid DNA. Diverse Eigenschaften von Klonierungsplasmiden sollen näher gebracht, sowie ein prinzipielles Verständnis oftmals kompliziert erscheinender bakterieller Genotypen ermöglicht werden. In diesem Kurs wird eine Klonierung durchgeführt: Zu diesem Zweck wird ein Insert aus einem Pool unterschiedlich großer Fragmente von λ-dna in die multiple cloning site eines gebräuchlich verwendeten Klonierungsvektors (puc18) gesetzt. Von einigen ausgewählten Transformanten wird die Plasmid DNA isoliert und diese auf die Größe und Orientierung der erhaltenen Fragmente überprüft. Tipp: dieses Skriptum ersetzt auf keinen Fall ein Lehrbuch. Hier werden nur Minimalinformationen gegeben die sich auf bestimmte Themen konzentrieren. Nehmen Sie eines der empfohlenen Bücher (Kapitel 10) zur Hand um genügend Hintergrund Informationen zu erhalten um die Experimente auch tatsächlich zu verstehen!

3 Kolloquiumsunterlagen Seite 3 INHALTSVERZEICHNIS 1. Plasmid-Vektoren 1.1. Replikation von Plasmiden 1.2. Inkompatibilität von Plasmiden 1.3. Plasmid-codierte Selektionsmarker 1.4. Andere Eigenschaften von Plasmid Vektoren 1.5. Typische Plasmid Vektoren: Plasmide der puc Serie (Beispiel puc18) 2. Alpha Komplementation 3. E. coli: Phänotyp, Genotyp 4. Bakterielle Modifikations- und Restriktionssysteme 5. Restriktionsenzyme 6. Sonstige DNA-modifizierende Enzyme 7. Transformation von E.coli 7.1. Herstellung kompetenter Zellen 8. Anzucht der Bakterienkulturen und Plasmid-Präparation 8.1. Aufschluß der Bakterienkultur und Reinigung von Plasmiden 9. Gelelektrophorese von DNA 9.1. Agarosegele 10. Weiterführende Lehrbücher 11. Auswahl einiger Übungsbeispiele und Fragen

4 Kolloquiumsunterlagen Seite 4 1. Vektoren für die E.coli Transformation: 1.1. Plasmid-Vektoren Bakterielle Plasmide sind extrachromosomale DNA Moleküle, meist doppelsträngig zirkulär und in der Regel zwischen 2 und 200 Kilobasenpaare (1kb=1000 basen) groß. Ihre Replikation erfolgt unabhängig vom Bakterien-Chromosom, ist aber trotzdem von Enzymen der Wirtszelle abhängig. In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl, zum Teil sehr spezieller, Plasmid Vektoren entwickelt. Diesen Vektoren ist gemeinsam, dass sie eine Sequenz besitzen, die man als Replicon bezeichnet (siehe Anhang und Abbildung 4). Dies ist eine genetische Einheit, welche neben einem Replikationsursprung ( origin of replication ori) zur Initiierung der Replikation die dazugehörigen (cisacting) Kontrollelemente besitzt. Die Art eines Plasmid-Replicons bestimmt letztendlich die Kopienzahl (plasmid copy number, PCN) eines Plasmids. Die ori Sequenz wird von der DNA Polymerase von E. coli als Initiationsstartpunkt für die Replikation erkannt und stellt sicher, dass das Plasmid unabhängig von der genomischen DNA repliziert werden kann und neben der genomischen DNA in der Zelle propagiert wird. Mehr als 30 verschiedene Replicons wurden bereits in Plasmiden identifiziert. Die meisten, gegenwärtig verwendeten Plasmid-Vektoren tragen jedoch dasselbe Replicon, abgeleitet vom Plasmid pmb1 (nahe verwandt zum ebenso häufigen cole1 Replicon). Plasmide mit diesem Replicon liegen mit einer Kopienzahl von zumindest 15 bis 20 pro Zelle vor (multicopy plasmid). Plasmid Plasmidgröße Kopienzahl Ertrag/ml Kultur pgem 2700 bp ,8 4,1 µg puc 2700 bp ,9 4,1 µg pbr bp >25 >0,23 µg ColE bp >15 >0,15 µg pacyc 4000 bp ~10 ~0,09µg psc bp ~6 ~0,12µg Tabelle 1: Kopienzahl häufig verwendeter Plasmide Zusätzlich zum pmb1/col E1 origin gibt es auch weitere origins wie den f1-origin, welcher die Replikation des Plasmids als Einzelstrang ermöglicht. T3 und T7 Regionen sind Promotoren, die von den RNA-Polymerasen der T3- und T7-Phagen spezifisch erkannt werden und so zur in vitro Synthese von RNA-Transkripten des klonierten Fragments benutzt werden können Inkompatibilität von Plasmiden Zwei Plasmide, die den gleichen Replicon-Typ (Regulation der Replikation) aufweisen, können ohne entsprechende Selektion in einer bakteriellen Kultur nicht koexistieren. Grund ist die Kompetition der Plasmide während der Replikation und der Weitergabe (partitioning) in die Tochterzellen. Schon

5 Kolloquiumsunterlagen Seite 5 innerhalb weniger Generationen kann somit eines der Plasmide eliminiert werden. Dieses Phänomen ist als "Inkompatibilität" bekannt. Inkompatibilitätsgruppe negatives Kontrollelement cole1, pmb1 RNAI (Kontrolle des pre-rnaii processing) IncFII, pt181 RNA (Kontrolle der RepA Synthese) P1, F, R6K, psc101, p15a Iterons (Kontrolle der RepA Konz.) Tabelle 2: Inkompatibilitätsgruppen 1.3. Plasmid-codierte Selektionsmarker Weiters enthalten alle Vektoren einen oder mehrere Selektionsmarker. Dabei handelt es sich um Gene, deren Produkte der E. coli Zelle besondere Eigenschaften verleihen, sodass sie leicht von nicht transformierten Zellen zu unterscheiden sind. Meistens handelt es sich dabei um ein Resistenzgen, das ein Enzym für die Inaktivierung eines spezifischen Antibiotikums codiert. So codiert beispielsweise das Ampicillinresistenzgen (bla, amp r ) das Enzym ß-Lactamase, welches das Antibiotikum Ampicillin inaktiviert. Auf Ampicillin-hältigem Medium können somit die Zellen, die während der Transformation nun tatsächlich ein Plasmid aufgenommen haben, aus dem großen Überschuss an nicht transformierten Zellen selektiert werden. Weit verbreitet sind auch andere Antibiotikaresistenzen wie: Tetracyclin. Kanamycin, Chloramphenicol, Streptomycin 1.4. Andere Eigenschaften von Plasmid Vektoren Ein weiterer wichtiger Bestandteil von Klonierungsvektoren ist ein speziell ausgewiesener Bereich, der die zu klonierenden DNA Fragmente aufnehmen soll. Dieser Bereich enthält eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsendonukleasen (= DNA schneidende Enzyme), die jeweils nur einmal in dem Plasmid vorhanden sind. Diese Sequenz bezeichnet man multiple cloning site (MCS). Durch diese unique vorkommenden Restriktionsschnittstellen ist es möglich, ein Plasmid gezielt an einer Stelle zu schneiden (zu linearisieren) und eine fremde Sequenz einzufügen. Die MCS liegt oft innerhalb des codierten Teils des lacz-gens welches eine weitere wichtige Eigenschaft zur Unterscheidung von rekombinanten Plasmiden von nicht rekombinanten Plasmiden erlaubt. Der Einbau der Insert-DNA in die MCS zerstört den Leseraster des lacz-gen-fragments, und die betroffenen Bakterien-Kolonien bleiben in Gegenwart von X-Gal farblos (Alpha-Komplementation). 2. Das lacz Gen ( Alpha-Komplementation") Mithilfe der sogenannten "Alpha-Komplementation" können beim Klonieren positive Klone (Bakterien- Zellen, die ein rekombinantes Plasmid enthalten) sehr einfach identifiziert werden. Das System beruht darauf, dass das Gen für die β-galactosidase in zwei Fragmente vorliegt: Der N-Terminale Teil (α-

6 Kolloquiumsunterlagen Seite 6 Fragment) ist auf dem Plasmidvektor codiert, der C-terminale Teil (ω-fragment) liegt auf dem Bakterienchromosom. Durch die gleichzeitige Expression beider Fragmente kann die Aktivität der β- Galactosidase hergestellt werden. Die entsprechenden Zellen/Kolonien verfärben sich dann in der Gegenwart des β-galactosidase-substrates X-Gal blau. X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-Dgalactosid) ist normalerweise farblos, Wird es jedoch durch β-galactosidase gespalten wird, entsteht das tiefblaue 5-Brom-4-Chlor-Indigo. Falls die Expression des α-fragments unter der Kontrolle des lac-repressors (Hintergrundinformation dazu in jedem Standardlehrbuch lac-operon ) steht (z.b. puc18) muss natürlich neben dem Substrat (X-Gal ist kein Aktivator der Lactose Gene!) auch ein Aktivator (inducer) wie das IPTG (Isopropyl- β-d-thiogalactosid) zugegeben werden. Befindet sich nun die MCS (multiple cloning site) innerhalb des Plasmid-codierten N-Terminus des lacz Gens, wird durch die Insertion eines DNA-Fragments in die MCS der Leserahmen des α- Fragments unterbrochen bzw. dessen Funktion zerstört. Es kommt zu keiner α-komplementation - die entsprechende Kolonie erscheint weiß. lacz alpha a (ampr) MCS puc bp ori (pmb1 derived) Abbildung 4: Das Klonierungsplasmid puc 18 enthält den kodierenden Bereich für das α-komplement der β-galactosidase als Reporter Gen (lacz alpha) Die Transkription des Gens wird durch den regulierbaren lac Promotor/Operator kontrolliert. Im vorderen Bereich des β-galactosidase Gens befindet sich die MCS. Diese enthält eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, die das Plasmid jeweils nur einmal schneiden. Fügt man in die MCS ein DNA Fragment ein, so wird dadurch das β-galactosidase Gen zerstört. Das ist die Basis für ein blau/weiss screening mit X-Gal. Wie fast alle gängigen Vektoren enthält puc18 einen Replikationsursprung (ori), den die Polymerasae aus E. coli erkennt und damit das Plasmid autonom, d.h. unabhängig von bakteriellen Genom replizieren kann. Weiters enthält puc18 das Antibiotika- Resistenzgen amp r (bla), das Ampicillin Resistenz vermittelt.

7 Kolloquiumsunterlagen Seite 7 Abbildung 5a: Funktion der β-galactosidase und die Verwendung von X-Gal puc18 (2,7 kb) Recomb. puc18 MCS Transformation in E.coli und Selektion auf X-Gal hältigen Agarplatten MCS (+ Insert) Expression von β-galactosidase β-galactosidase Gen zerstört Abbildung 5b: Blau/Weiss Selektion durch das β-galactosidase Reporter-Gen. Zellen, in denen Teilbereiche des β-galactosidase Gens deletiert sind, können kein funktionelles Enzym synthetisieren. Dieser Defekt kann in Plasmiden der puc Serie korrigiert (komplementiert) werden, da auf diesen Plasmiden der fehlende Genbereich (α-fragment) zusammen mit den Kontrollelementen vorhanden ist. Solche komplementierten Zellen können leicht dadurch identifiziert werden, dass dem Medium der Indikator X-Gal dazugegeben wird. Dieses farblose Substrat der β-galctosidase wird von dem Enzym an der glycosididischen Bindung hydrolysiert und dann an der Luft zu einem blauen Indigo-Farbstoff oxydiert. Die Kulturen färben sich also blau. Enthält die MCS in den Klonierungsvektoren ein Fremd- DNA Fragment, so wird dadurch das Gen für das β-galactosidase-teilprotein zerstört. Zellen die ein derartiges rekombinantes Plasmid aufgenommen haben, können keine funktionsfähige β- Galactosidase synthetisieren und bleiben daher auch in Gegenwart des Indikators farblos (weiss).

8 Kolloquiumsunterlagen Seite 8 3. E. coli: Phänotyp, Genotyp Phänotyp: sichtbare oder sonstwie messbare Eigenschaften eines Organismus Der Phänotyp wird in Normalschrift angegeben, der erste Buchstabe wird groß geschrieben wird und gefolgt von einem Superscript + oder (manchmal auch r, resistent; s, sensitiv). Genotyp: die für die Ausprägung des Phänotyps verantwortlichen genetischen Faktoren Gene in "unverändertem Zustand" (Wildtyp-Allele) werden bei der Beschreibung des Genotyps nicht explizit angeführt. Gene werden mit drei kursiv geschriebenen Kleinbuchstaben (üblicherweise in Bezug zur Funktion des jeweiligen Gens) benannt. Manchmal wird zur Spezifikation einer bestimmten Mutation (eines best. Alleles) noch eine Nummer, oder ein Großbuchstabe angehängt. Die Superscripts + und sind zur korrekten Angabe des Genotyps nicht notwendig (redundant!). Die Kennzeichnung von Deletionsmutanten erfolgt durch ein Δ (manchmal auch "del" oder "d"), gefolgt von der in Klammern gesetzten Bezeichnung des deletierten Gens. Manchmal folgt, in Klammern gestellt, der Bezeichnung des Genotyps eine Bezeichnung des Phänotyps (wenn dieser nicht klar aus ersterem ersichtlich). z.b. Genotyp des E. coli Stammes DH10B: F - mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 enda1 reca1 deor Δ(ara, leu)7697 arad139 galu galk nupg rpsl Marker F - mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 enda1 reca1 deor Δ(ara, leu)7697 arad139 galu galk nupg rpsl Anmerkung Stamm enthält kein F Episom, keine Konjugation möglich Mutation verhindert die McrA-Restriktion methylierter DNA Deletion eines ganzen Genclusters von 6 Restriktionsenzymen (mrr-hsdr-hsdm-hsdsmrcb-mrcc) Stamm trägt den defekten Lambda-Prophagen Φ80, dieser trägt das dlaczδm15-allel, dlaczδm15codiert das ω-fragment der β-galactosidase Deletion des kompletten lac Operons Mutation der unspezifischen Endonuclease I (ermöglicht stabilere DNA Präparationen) Mutation verhindert homologe Rekombination Mutation in einem Repressor des deocabd Operons konstitutive Expression (Aufnahme großer Plasmide möglich) Deletion eines Genclusters (reicht vom ara bis ins leu-operon) Mutation der L-ribulose 5-phosphate 4-epimerase L-Arabinose kann nicht metabolisiert werden Mutation der UDP-Glucose Pyrophosphorylase Galaktose kann nicht metabolisiert werden Mutation der Galaktokinase Galaktose kann nicht metabolisiert werden Mutation eines Nucleoside-Transporters Mutation im Protein S12 der 30S Untereinheit Steptomycin-Resistenz Tabelle 3: Genotyp des E. coli Stammes DH10B

9 Kolloquiumsunterlagen Seite 9 4. Bakterielle Modifikations-und Restriktionssysteme Sowohl Pro- als auch Eukaryoten enthalten Enzyme, die DNA methylieren. Bei Eukaryoten dient die Methylierung der Unterscheidung von Genen in verschiedenen funktionellen Zuständen. Bei Prokaryoten dient das Methylierungsmuster zum Erkennen "fremder" DNA. Es scheint zu keinem der bakteriellen Methylierungssysteme ein eukaryotisches Gegenstück zu geben. E.coli DNA selbst enthält kleine Mengen an 6-Methyladenin und 5-Methylcytosin. Das Methylierungsmuster der E. coli DNA wird durch die Aktivität dreier Methylasen erzeugt, diese werden von den Genen dam und dcm sowie vom Gencluster hsdrms codiert (hsdrms codiert ein Typ I Methylierungs- und Restriktionssystem). Die vom dam-gen codierte Methylase transferiert eine Methylgruppe vom S-Adenosinmethionin zur N 6 -Position eines Adeninrestes in der Sequenz GATC. Die dcm codierte Methylase modifiziert einen Cytosinrest innerhalb der Sequenz CCAGG und CCTGG an der C 5 -Position. In DNA mit einem GC-Gehalt von 50% trifft man statistisch alle 4 4 = 256 bp bzw. 4 5 = 512 bp auf solch eine dam bzw dcm-modifizierung. Die Erkennungssequenz für die im hsdrms Gencluster codierte EcoKI Methylase (5 -AACNNNNNGTGC) wird viel seltener angetroffen, statistisch einmal in 8 kb. dam G m A T C C T m A G dcm C m C A G G G G T m C C dcm C m C T G G G G A m C C hsdrms A m A C N N N N N G T G C T T G N N N N N C m A C G E. coli Stämme mit Mutationen in allen drei Systemen haben keine methylierten Basen. Sie sind aber lebensfähig, weshalb die Methylierung kein lebenswichtiges Ereignis darstellen kann. Variationen im Methylierungsmuster machen fremde DNA dem Angriff durch wirts-codierte Restriktionsenzyme zugänglich, die das Fehlen von Methylgruppen an den entsprechenden Stellen erkennen. E. coli hat zumindest vier Restriktionssysteme, um fremde DNA zu erkennen und zu zerstören:

10 Kolloquiumsunterlagen Seite 10 hsdrms-system Die hsdrms Gene codieren das sogenannte EcoKI Restriktionssystem. Der EcoKI Enzymkomplex, attackiert eine spezifische DNA Sequenz (5 -AACNNNNNGTGC) und führt in die DNA (in variablem Abstand von der Erkennungssequenz) eine Doppelstrang-Schnitt ein. Wenn diese Sequenz nicht vorhanden, bzw. die darin vorkommenden Adenine methyliert sind, wird die DNA nicht angegriffen. Sollte eine der drei Untereinheiten defekt sein, kommt es ebenso zu keiner Restriktion. Derselbe Enzymkomplex methyliert jedoch auch sein eigenes Substrat (doppelsträngige DNA die 5 - AACNNNNNGTGC enthält, siehe oben), allerdings sehr langsam, wodurch nicht methylierte "Fremd- DNA" selten "überlebt". Bedeutung für das molekularbiologische Arbeiten DNA von Säugern, höheren Pflanzen und auch vielen Prokaryonten (nicht Drosophila melanogaster und Saccharomyces cerevisiae) enthält Methyl-Cytosin ( m CG, m CNG). Zur Konstruktion genomischer Libraries müssen somit unbedingt mcra, mcrb, mrr-defiziente (restriktions-defiziente) E. coli Stämme verwendet werden! Durch die CG-Methylierung können bestimmte Restriktionenzyme (nämlich solche, deren Erkennungssequenz das CG-Motiv enthält oder auch nur überlappt) blockiert werden. Informationen zur Sensitivität von Restriktionsenzymen hinsichtlich einer CG-Methylierung finden sich in den Katalogen der diversen Anbieter (z. B. DNA, die aus einem Dcm + - oder Dam + - E. coli Stamm präpariert wurde, kann von manchen Restriktionsenzymen deren Erkennungssequenz das Dam- bzw Dcm- Motiv enthält (bzw. auch nur überlappt) nicht mehr geschnitten werden. So kann zum Beispiel DNA aus einem Dam + - E. coli Stamm nicht mehr vom Restriktionsenzym MboI geschnitten werden, sehr wohl aber von Sau3AI - obwohl beide die gleiche Erkennungssequenz GATC aufweisen. Der Grund ist, dass MboI (im Gegensatz zu seinem Isoschizomer Sau3AI) methylierungssensitiv ist und die dammethylierte GATC Restriktionsschnittstelle nicht mehr geschnitten werden kann. Informationen zur Sensitivität von Restriktionsenzymen hinsichtlich einer dam- bzw dcm-methylierung finden sich in den Katalogen der diversen Anbieter (z. B. Der Methylierungsstatus einer Plasmid DNA kann auch die Transformationseffizienz beeinflussen. So kann zum Beispiel eine dam-methylierte Plasmid-DNA nur mit weit geringer Effizienz in einen Dam - E.coli Stamm transformiert werden. 5. Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme sind Endonucleasen bakteriellen Ursprungs. Sie sind in der Lage doppelsträngige DNA-Moleküle an spezifischen Erkennungsstellen zu binden und zu schneiden. Die entstehenden

11 Kolloquiumsunterlagen Seite 11 Restriktionsfragmente besitzen eine je nach Lage der Schnittstellen definierte Länge und können durch ein anschließendes Auftrennungsverfahren (Gelelektrophorese) entsprechend ihrer Größe identifiziert werden. Die ungefähre Bestimmung der Größe (in Basenpaaren, bp) erfolgt durch den Vergleich mit einem parallel aufgetragenen Größenstandard, bestehend aus DNA Fragmenten definierter Größe. Die biologische Funktion der Restriktionsenzyme ist die Zerkleinerung und somit Inaktivierung eingedrungener Fremd-DNA, beispielsweise von Phagen-DNA. Eigene DNA wird durch Modifizierung wie zum Beispiel Methylierung vor dem Eingriff der eigenen Restriktionsenzyme geschützt. Restriktionenzyme spalten hydrolytisch die Phosphodiesterbindungen beider Stränge eines DNA- Moleküls und unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Erkennungssequenz, ihrer Schnittstelle und ihres Ursprungsorganismus. Man unterscheidet mindestens 3 Typen: Typ I, bzw. Typ III Restriktionsenzyme besitzen sowohl Endonuclease als auch Methylase-Funktion, benötigen ATP und kommen aufgrund ihrer unspezifischen Schnittstellen kaum in der DNA-Analytik zum Einsatz. Typ II-Restriktionsenzyme besitzen -im Gegensatz dazu- nur eine Restriktionsaktivität und haben den großen Vorteil, DNA innerhalb einer definierten Erkennungssequenz zu spalten. Die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme sind typischerweise 4-8 Nukleotide lang und meist palindromisch; d.h. die Schnittstelle liegt in der Regel innerhalb der Erkennungssequenz, wodurch die entstehenden Fragmente definierte Enden erhalten, welche für eine nachfolgende Klonierung verwendet werden können. Man unterscheidet zwischen sogenannten sticky und blunt ends a 5 b 3 c Abbildung 6: a: Blunt end DNA, z.b. generiert durch SmaI, b und c: sticky ends DNA mit 5 -overhang (z.b. generiert durch BamHI) bzw. mit 3 -overhang (z.b. generiert durch SacI). Restriktionsenzym Isoliert aus Erkennungsseq. Ende Isoschizomere BamHI Bacillus amyloliquefacines Stamm H G/GATCC sticky (5 -overhang) BstI erstes isoliertes Enzym (I) SmaI Serratia marcecescens Sb CCC/GGG blunt XmaI SacI Streptomyces achromogenes GAGC/TC sticky (3 -overhang) SstI Tabelle 4: Beispiele der Namensgebung einiger gebräuchlicher Restriktionsenzyme Nachfolgend sei am Bsp. dreier Restriktionsenzymen ihre Herkunft, die Namensgebung, die Art der entstehenden Enden und Kompatibilität zu anderen Restriktionsenzymen veranschaulicht:

12 Kolloquiumsunterlagen Seite 12 Detaillierte Listen aller für das Labor verfügbaren Restriktionsenzyme können in Laborkatalogen der jeweiligen Anbieter nachgesehen werden (siehe Anhang). Außerdem findet man dort detaillierte Information zu Inkubationstemperaturen (meistens 37 C; manche Enzyme benötigen jedoch 50 C oder 65 C zur Enfaltung der optimalen Aktivität) Puffersystemen Hitzeinaktivierung Isoschizomere (2 Enzyme haben eine gemeinsame Erkennungssequenz und Schnittstelle) und Neoschizomere (2 Enzyme haben eine gemeinsame Erkennungssequenz, aber unterschiedliche Schnittstellen) Listen kompatibler Enden (je nach 5`bzw. 3`Überhang) Methylierungssensitivität 6. Sonstige DNA-modifizierende Enzyme Zusätzlich zu den Restriktionsenzymen sind mittlerweile eine große Anzahl an modifizierenden Enzymen erhältlich, welche in der Molekularbiologie Anwendung finden. An dieser Stelle sei nur auf jene verwiesen, die hauptsächlich für die Klonierung zum Einsatz kommen. SAP: Shrimp Alkaline Phosphatase: ist eine Alkalische Phosphatase, die die Dephosphorylierung des 5 -Phosphats von DNA und RNA katalysiert, was zur Folge hat, dass an diesem 5'-Ende keine weiteren Nukleotide mehr angebaut werden können. Eine der häufigsten Einsatzgebiete der SAP ist bei der Klonierung von Genen oder anderen DNA Abschnitten in Plasmide: Der zirkuläre Vektor (das Plasmid) wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten und damit linearisiert. Zum linearisierten Vektor wird das gewünschte Gen, das im Optimalfall mit den gleichen Enzymen geschnitten wurde, hinzugegeben. Im Idealfall lagern sich die Enden des Vektors an die des eingebrachten DNA-Doppelstrangs an, und eine Ligase fügt das neue Plasmid zusammen. Entstehen bei der Linearisierung des Vektors blunt ends oder sticky ends mit gleicher Überlappungssequenz, so können die beiden Enden des Vektors religieren und damit die Ausbeute an neu zusammengesetzem Plasmid verringern um dies zu verhindern, dephosphoryliert man die 5'-Enden des Vektors. Taq DNA Polymerase (siehe Beispiel Genotyp ) Dieses Enzym aus Thermus aquaticus ist eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase (Temperaturoptimum: C). Native Taq DNA Polymerase hat keine 3 5 Exonuclease-Aktivität (proof reading-activity) und eine schwache 5 3 Exonuclease-Aktivität.

13 Kolloquiumsunterlagen Seite 13 Anwendungen PCR (Polymerase Chain Reaction): zur Amplifikation von definierten DNA Fragmenten (genaue Beschreibung: siehe Beispiel A) Sequenzierung (genaue Beschreibung: siehe Beispiel A) DNA-Markierung mit Radionucleotiden, oder chemischen Farbstoffen (Digoxigenin, Biotin,... genaue Beschreibung: siehe Beispiel A) Will man ein PCR-Produkt ohne weiteren Verdau klonieren, kann man sich die Terminale Transferase- Nebenaktivität der Taq DNA Polymerase zunutze machen: diese hängt an das 3`-OH Ende mit hoher Effizienz ein zusätzliches Deoxyadenosin an. Das PCR Produkt erhält somit ein "sticky end" (A- Überhang) und kann in Klonierungsvektoren mit einem 3`-Thymidin Überhang ligiert werden (diese Vektoren sind käuflich zu erwerben). Durch einen andern Typ von Taq-Polymerase, zum Bsp. die Pfu Polymerase können aber auch blunt end Fragmente generiert werden (genaue Beschreibung: siehe Beispiel A). T4 DNA Ligase Die Ligase des Bakteriophagen T4 katalysiert die Verknüpfung von 5 -Phosphat und 3 - Hydroxylgruppen zweier doppelsträngiger DNA Moleküle. Das Enzym kann somit zur Ligation von kompatiblen sticky - oder blunt-end - Fragmenten doppelsträngiger DNA eingesetzt werden. Dieses Enzym wird daher zur Wiedervereinigung von manipulierten DNA Fragmenten (z.b. Konstruktion von rekombinanten Plasmiden) verwendet. Die T4 DNA Ligase benötigt Mg 2+, bzw. Mn 2+ und ATP (befindet sich üblicherweise im Puffer). Die optimale Temperatur einer Ligation (4-15 C) stellt einen Kompromiss zwischen der optimalen Temperatur für die Aktivität des Enzyms (37 C) und der optimalen Temperatur zur Assoziation der DNA-Enden dar. Eine hohe DNA-Konzentrationen (z. B. durch Zugabe von Polyethylenglycol), die Dephosphorylierung des Vektors und ein Überschuss an Insert DNA sollten selbst bei blunt-end Ligationen eine vernünftige Ausbeute an rekombinanten Plasmide ergeben. 7. Transformation von E. coli Einer der wichtigsten Schritte bei der Etablierung eines rekombinanten Organismus ist das Einbringen der zuvor in vitro neu kombinierten DNA in die Wirtszelle. Dieser Prozess wird Transformation genannt, wenn die DNA passiv, d.h. auf physikalischem Weg in die Wirtszelle eingeschleust wird. Als Infektion bezeichnet man hingegen, wenn die DNA mit Hilfe von Phagen, also auf biologischem Weg, in die E. coli Zelle gebracht wird. Für die Transformation werden in der Regel Derivate des Escherichia coli-stammes K12 verwendet. Dieser Stamm ist ein sogen. "Sicherheitsstamm", das bedeutet, dass ihm die für die Pathogenizität

14 Kolloquiumsunterlagen Seite 14 essentiellen Gene fehlen. Der Stamm XL1-Blue besitzt z. B. den großen Vorteil, recombinationsdefizient (reca - ) zu sein (unerwünschte DNA-Rekombination kommt nicht vor). Transformieren lassen sich sogenannte kompetente Zellen. Deren Membranen wurden durch gezielte Behandlung (chemisch, physikalisch) durchlässig gemacht. Grundsätzlich können zwei Arten von kompetenten E. coli Zellen unterschieden werden: chemisch-kompetente und elektrokompetente Zellen. Sowohl das Protokoll zur Präparation als auch zur Transformation der kompetenten Zellen unterscheidet sich in wesentlichen Aspekten. Chemische Transformation mittes CaCl 2 : Für diese Art von Transformation werden die Membranen von E. coli Zellen durch Behandlung mit CaCl 2 vorübergehend für DNA durchlässig gemacht. Präpariert werden die Zellen durch Herstellen einer "log-phase" Bakterien Zellensuspension in eiskaltem 100 mm Calciumchlorid. Für die eigentliche Transformation inkubiert man die kompetenten Zellen zusammen mit der zu transformierenden DNA in einer CaCl 2 Lösung für 30 min bei 0 o C. Durch die Ca 2+ Ionen in der Zellsuspension wird die DNA als Polyanion mikrokristallin auf der Oberfläche der kompetenten Zellen präzipitiert. Danach erfolgen rasche Temperaturwechsel: ein sogenannter Hitzeschock (90 sec bei 42 o C) mit darauffolgender kurzer Inkubation bei 0 o C. Durch diese Wechsel wird die DNA über nicht genau geklärte Mechanismen passiv in der Zelle aufgenommen. Zur Regeneration wird der Transformationsansatz danach in Nährmedium (LB, SOC) bei 37 o C inkubiert. Während dieser Inkubation können neue phänotypische Eigenschaften die vom Plasmid in die Zelle eingebracht werden aktiviert werden (beispielsweise eine Antibiotikaresistenz). Zum Abschluss werden die Zellen auf dem geeigneten Selektivmedium ausplattiert. Die Transformationseffizienzen liegen bei diesem Verfahren bei ca Transformanten pro μg DNA. Elektrische Transformation (Elektroporation): Eine weitere Methode, um DNA in prokaryontische (also auch E. coli), aber auch pflanzliche oder tierische Zellen einzubringen, ist die Elektroporation. Diese Methode beruht auf der Beobachtung, dass Strompulse mit hoher Spannung die Fusion von zellulären Plasmamembranen induzieren können. Zusätzlich können Zellen nach einem "elektrischen Schock" exogene DNA-Fragmente aus der Umgebungslösung aufnehmen. Auch hier gilt, dass neben vielen exogenen/technischen Faktoren (z. B. Temperatur, Spannung, Leitfähigkeit, DNA-Topologie) auch genetische, Bakterienstammabhängige Faktoren die Effizienz der Transformation beeinflussen. Die Transformationseffizienz bei diesem Verfahren kann bis zu 10 9 Transformanten pro μg DNA (10 9 cfu: colony forming units) sein, was deutlich höher ist als bei der chemischen Methode. Ein Vorteil der Elektroporation gegenüber der Transformation mit chemisch-kompetenten Zellen ist weiters, dass hierbei auch sehr große DNA- Fragmente erfolgreich transformiert werden können (Größenlimit bei chemisch kompetenten Zellen ist um die 50 kb). Transformationseffizienz ist die Anzahl der erhaltenen Kolonien (cfu) / µg DNA. Beispiel: Sie erhalten 1500 cfu und haben für die Trafo 150 pg DNA eingesetzt, die Trasnformationseffizienz ist somit 1,0 x 10 7.

15 Kolloquiumsunterlagen Seite 15 Plasmid E.coli Zelle CaCl 2 30 min O o C Elektroporation Feldstärke 10-14kV/cm 90 sec 42 o C 1-2 min, 0 o C + Medium, 37 o C + Medium, 37 o C Ausplattieren auf Selektionsagar Abbildung 1: Die bakterielle Transformation: Um Bakterien zu transformieren (linke Hälfte der Abbildung), müssen ihre Membranen durch eine Behandlung von CaCl 2 vorgeschädigt sein. Die Bakterien werden kompetent gemacht. Die Transformation erfolgt durch Co-Inkubation des Plasmides mit Zellen in Anwesenheit von CaCl 2 auf Eis. Danach erfolgt ein sog. Hitzeschock bei 42 o C. Bei der Elektroporation (rechte Hälfte der Abbildung) werden Zellen vor der Transformation salzfrei gewaschen und dann zusammen mit DNA in eine Küvette gegeben, die an zwei gegenüberliegenden Seiten mit Plattenelektroden ausgekleidet sind. Nach Anlegen einer Feldstärke wird die DNA bei der Entladung in die Bakterienzelle aufgenommen. 8. Bakterien Anzucht und Reinigung von Plasmid DNA: Nach erfolgter Manipulation von DNA Fragmenten und Transfer von (hoffentlich) rekombinanten Plasmiden in E.coli müssen diese nun hinsichtlich der gewünschten Eigenschaften überprüft werden. Dazu ist es notwendig, die Plasmide von Bakterien die auf Selektonsagar gewachsen sind, zu isolieren und zu analysieren. Es wurden viele Methoden zur Reinigung von Plasmiden aus Bakterien entwickelt wobei alle drei Schritte gemeinsam haben: (i) Anzucht der Bakterien (ii) Ernte und Lyse der Bakterien (iii) Reinigung der Plasmid DNA

16 Kolloquiumsunterlagen Seite 16 Anzucht der Bakterien Plasmide werden fast ausschließlich aus Flüssigkulturen (mit geeignetem Antibiotikum) gereinigt, die zuvor mit Einzelkolonien von Agarplatten inokuliert wurden. Viele der heute verwendeten Plasmide (z.b. aus der puc Serie) replizieren in einer derart hoher copy number, dass sie in ausreichender Menge bei einfachem Wachstum bis zur log-phase in einem Standard LB (Luria Broth) Medium geerntet werden können. Bei sehr großen Plasmiden oder low-copy number Plasmiden kann man die Erträge durch selektive Vermehrung von Plasmiden durch Zugabe von Chloramphenicol steigern. Chloramphenicol inhibiert die Proteinsynthese des Wirtes und verhindert so eine Replikation der chromosomalen DNA. Die Plasmid DNA wird aber weiterhin repliziert wodurch es zu einer selektiven Anreicherung kommt. Durch Verwendung von besonders nahrhaften Medien wie Terrific Broth kann es ebenfalls zur Vermehrten Ausbeutung von Plasmid DNA kommen. Nach dem Volumen, der für die Plasmid-Präparation eingesetzten Bakterienkultur, unterscheidet man Miniprep (2 10ml), Midiprep (25 100ml) und Maxiprep (> 100ml). Ernte und Lyse der Bakterien Für die Lyse der Bakterien zur Gewinnung niedermolekularer DNA stehen mehrere Methoden zur Verfügung. Die am häufigsten verwendete Methode ist die alkalische Lyse. Dabei wird die Bakterienkultur zentrifungiert, der Kultur-Überstand verworfen und das Pellet in einem EDTA-haltigen Puffer resuspendiert. EDTA komplexiert zweiwertige Kationen (Mg 2+, Ca 2+ ), welche für die Stabilität der bakteriellen Zellwände wichtig sind. Dem Resuspensions-Puffer wird bei manchen Protokollen auch RNaseA (degradiert bakterielle RNA) und Lysozym (greift die bakterielle Zellwand an) zugesetzt. Reinigung der Plasmid DNA Grundsätzlich erfolgt die Reinigung von Plasmiden über eine alkalische-lyse oder über eine Koch-Lyse. Beide Methoden nützen die relativ hohe Stabilität der niedermolekularen zirkulären Plasmid DNA gegenüber der leichter zu denaturierenden hochmolekularen chromosomalen DNA. alkalische-lyse Die lysierte Bakteriensuspension wird einer alkalischen Lösung (NaOH) in Kombination mit einem starken Detergens (SDS) ausgesetzt. Das Einwirken von einem anionischen Detergens bei hohem ph löst die Phospholipide und Proteinkomponenten der Zellwände, denaturiert chromosomale DNA und Proteine aber auch Plasmid DNA. Im Gegensatz zu chromosomaler DNA hat die vergleichsweise niedermolekulare Plasmid DNA eine höhere Wahrscheinlichkeit zu renaturieren. Solange die Dauer und die Intensität der Denaturierung nicht zu lange ist, kann Plasmid DNA durch anschießende Neutralisation somit wieder in ihre Ursprungsform gebracht werden. Das Lysat wird anschließend mit saurem Kaliumacetat-Puffer neutralisiert. Denaturierte Proteine, hochmolekulare RNA, denaturierte chromosomale DNA (chromosomale DNA haftet an der

17 Kolloquiumsunterlagen Seite 17 Zellmembran) und bakterielle Zell-Abbauprodukte bilden in Anwesenheit von Kaliumdodecylsulfat unlösliche Komplexe und werden gemeinsam mit dem Salz präzipitiert (Kaliumdodecylsulfat ist wesentlich schlechter in Wasser löslich als Natriumdodecylsulfat). Die unlöslichen Komponenten werden dann abzentrifugiert und die Plasmid DNA kann mit Ethanol oder Isopropanol gefällt und gewaschen werden. Koch-Lyse Eine andere Aufschlußmethoden stellt z. B. die sogenannte Koch-Lyse dar. Dabei werden die bakteriellen Zellwände durch Zugabe von Lysozym zerstört, und die lysierten Bakterien für kurze Zeit aufgekocht. Die bakteriellen Abbauprodukte werden abzentrifugiert. Aus dem Überstand werden durch Zugabe von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bakterielle Proteine und Membranen denaturiert während die Plasmid DNA in der wässrigen Phase bleibt. Nach einem Zentrifugationsschritt zur Phasentrennung kann aus dem Überstand die Plasmid-DNA präzipitiert werden. Weiters können große Plasmide über CsCl-Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt werden. Verwenden von Plasmid Reinigungs kits Diese Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (1979) entwickelten Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (Tris HCl, 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach vom Trägerpartikeln desorbiert. Zur Durchführung derartiger Nukleinsäureextraktionen sind demgemäß zahlreiche Reagenzien-Zusammenstellungen (sog. Kits) kommerziell erhältlich. Diese kommerziell verfügbaren Kits (im Praktikum wird Invisorb Spin Plasmid Mini Kit Two verwendet) basieren auf dem Prinzip der Bindung von Nukleinsäure an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen fein gemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk), Diatomeenerden, oder auch Silicagele. Diese Systeme sind extrem einfach in ihrer Durchführung und verfahren immer nach folgendem Prinzip: Lyse des Ausgangsmaterials, nachfolgende Bindung der Nukleinsäure an die feste Phase einer Glas- oder Silicamembran, welche sich in einem Zentrifugationssäulchen an einer Trägersuspension befindet; Waschen der gebundenen Nukleinsäuren und Elution der Nukleinsäuren mit einem Puffer geringer lonenstärke;. Die Basis für die Auswahl geeigneter chaotroper Salze bilden die Reihen von Hofmeister zur Aussalzung von negativ geladenen, neutralen oder basischen Eiweißlösungen. Die chaotropen Salze sind dadurch charakterisiert, Proteine zu denaturieren, die Löslichkeit unpolarer Substanzen in Wasser zu erhöhen, sowie hydrophobe Wechselwirkungen zu zerstören. Gerade diese Eigenschaften

18 Kolloquiumsunterlagen Seite 18 bewirken auch mit Puffersystemen chaotroper Salze, die übergeordnete Struktur des wässrigen Milieus zu zerstören, um so die Bindung der Nukleinsäuren an ausgewählte feste Phasen zu vermitteln. Die bekanntesten Vertreter zur Nukleinsäureisolierung sind, Natriumperchlorat, Natriumjodid, Kaliumiodid, Guanidinium-/so-thiocyanat und Guanidinium-Hydrochlorid. 9. Analyse von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese Agarose ist das wichtigste Trägermaterial für die Elektrophorese von Nukleinsäuren. Es handelt sich dabei um ein Polymer, das aus verknüpften Galactoseeinheiten besteht. Die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Moleküle wird dabei von mehreren Faktoren beeinflusst: der Form der DNA (superhelikal, offen, linear doppelsträngig, einzelsträngig), den Laufbedingungen, der Agarosekonzentration, der angelegten Spannung, der Wahl des Laufpuffers oder auch die Präsenz eines interkalierenden Farbstoffs, wie zum Beispiel Ethidiumbromid. In der Regel wandert die superhelikale (SC für supercoiled ) Form der DNA schneller im Gel als die lineare (L). Die offene Form (OC für open circular ) wandert im Agarosegel wesentlich langsamer als die superhelikale oder lineare DNA (siehe Abbildung 7). Generell ist die Wanderungsgeschwindigkeit von DNA Fragmenten in Agarosegelen proportional zur angelegten Spannung. Große DNA Fragmente wandern mit zunehmender Spannung jedoch zunehmend langsamer im Gel, so dass sich hohe Spannungen für die Auftrennung großer Fragmente nicht eignen. Sehr kleine Fragmente trennt man am besten durch Erhöhung der Agarosekonzentration in 2-3%igen Agarosegelen auf. Für die Auftrennung verwendet man Tris-Acetat-(TAE) oder Tris-Borat-(TBE)Laufpuffer. Die Konzentration der Ionen im Laufpuffer ist von großer Bedeutung. Sind zu wenige Ionen im Laufpuffer vorhanden, so ist die elektrische Leitfähigkeit minimal und die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA zu gering. Ist die Ionenkonzentration zu hoch, wird der Laufpuffer durch die sehr hohe Leitfähigkeit zu stark erhitzt, was zur Denaturierung der DNA führen kann. A B A B. Abbildung 7: DNA-Elektrophorese in Agarose Gelen. Die Wanderung der DNA erfolgt in Pfleilrichtung. Die DNA wurde durch Inkubation des Geles in EtBr- unter UV Licht sichtbar gemacht (EtBrinterkaliert zwischen den Basenpaaren). A: OC entspricht der open circle und SC der super coiled Form des Plasmides. Die SC Form läuft somit schneller im Gel als die OC Form. B: L= linearisiertes Plasmid. Das in Spur B aufgetragen Plasmid wurde mir dem single-cutter EcoRI geschnitten.

19 Kolloquiumsunterlagen Seite 19 Flussdiagramm eines Klonierungvorganges: 1 2 Linearisieren des Vektors Herstellen des Inserts Die Enden der DNA müssen kompatibel sein 3 Ligation von Vektor und Insert 4 Herstellen von kompetenten E.coli Zellen 5 Transformation 6 Selektion auf geeignetem Medium (blau/weiss; Antibiotikum) Anzucht der interessanten Klone 7 Plasmid (Mini-) Präparation 8 Analyse der Plasmide (Ararosegelelektrophorese)

20 Kolloquiumsunterlagen Seite Empfohlene Literatur (in der Fachbibliothek Muthgasse zu finden) Der Experimentator: Molekularbiologie, Genomics (Spektrum Verlag) C. Mühlhardt (für Einsteiger). Kapitel: 1., 2.5., 3.1., 3.2., 2.1., 2.2., 6.1. (nicht )., , 6.3., 6.4., 6.5., Gentechnische Methoden (Spektrum Verlag) G. Schrimpf (zur Vertiefung) Kapitel: 1.10., 1.11., 3.2., (pp: ). Weiterführende Literatur: Principles of Gene Manipulation. Primrose, S.B., Twyman, R.M., and Old, R.W Blackwell Science Ltd. (Lesesaal, 53.02; Kapitel 1,2,3,4,6) Gentechnologie für Einsteiger. T.A. Brown 2001 (Lesesaal, 53.02) Gene Cloning & DNA Analysis. T.A. Brown 2001 (Lesesaal, 53.02), Part 1: pp Molekulare Biotechnologie Glick & Pasternack 1995 (Lesesaal 53.02) Kapitel 2: Molecular Biotechnology Glick & Pasternack 1995 (Lesesaal 53.02) Kapitel 2. Molekulare Genetik. Knippers, R Georg Thieme Verlag Stuttgart (7.Auflage, 8. neubearbeitete Auflage erscheint demnächst). (Lehrbuchsammlung, 53.10; pp 23-28, LacZ:

21 Kolloquiumsunterlagen Seite 21 Anhang: Typische Plasmid Vektoren: Plasmide der puc Serie (Beispiel puc18) lacz alpha a (ampr) MCS puc bp ori (pmb1 derived) puc18 und puc19 sind kleine (2686 bp), high copy number E. coli Plasmide. Bis auf die entgegengesetzt orientierte MCS sind sie identisch. puc Plasmide besitzen ein pmb1 Replicon, liegen aber in Kopien pro Zelle vor. Grund dafür ist eine Punkt- Mutation im RNAII Primer, welche (abhängig von der Temperatur) die Interaktion mit dem Repressor RNAI beeinträchtigt, außerdem fehlt puc Plasmiden das rop Gen ein bla Gen (amp r ), welches das Enzym β-lactamase kodiert. Dieses vermittelt Resistenz gegen Ampicillin den Promotor (incl. CAP-Protein- und lac-repressor-bindungsstelle) und das 5 - Ende des lacz Gens, welches das N-terminale Fragment der β-galaktosidase codiert. Dieses ist somit IPTG induzierbar und zur sogenannten α-komplementation fähig

22 Kolloquiumsunterlagen Seite 22 Antibiotikaresistenzen und ihre Gene Ampicillin Abbildung 2: Ampicillin Das Ampicillin ist ein Aminopenicillin, interferiert mit der bakteriellen Zellwandsynthese (u.a. wird eine Transpeptidase und somit die Quervernetzung des Mureins blockiert) und zerstört so wachsende Zellen (Zellwände können dem wachsenden Turgordruck nicht mehr standhalten). Das Resistenzgen amp r (bla) codiert ein periplasmatisches Enzym, eine ß-Lactamase, welche den cyclischen ß- Lactamring des Antibiotikums spaltet. Gebräuchlich verwendete Konzentrationen von Ampicillin sind µg/ml. Chloramphenicol Abbildung 3: Chloramphenicol Chloramphenicol bindet an die 50S Untereinheit der bakteriellen Ribosomen (70S), verhindert die Ausbildung von Peptidbrücken und greift so in die bakterielle Proteinsynthese ein. Das entsprechende Resistenzgen Cm r (cat) codiert eine Acetyltransferase welche das Antibiotikum acetyliert und inaktiviert. Arbeitskonzentrationen: µg/ml Kanamycin Abbildung 4: Kanamycin Kanamycin (ein Aminoglycosid) bindet an 70S Ribosomen und inhibiert so u. a. auch die Protein- Biosynthese. Das Resistenzgen kan r codiert eine Aminoglycosid-Phosphotransferase, die das Antibiotikum phosphoryliert und so vermutlich den aktiven Transport in die Zelle und die Interaktion mit den Ribosomen verhindert. Arbeitskonzentration: µg/ml.

23 Kolloquiumsunterlagen Seite 23 Streptomycin Streptomycin (ein Aminoglycosid) bindet an die 30S Untereinheit prokaryotischer Ribosomen und verursacht ebenfalls Fehler beim Ablesen der mrna (stört die Bildung des Initiationskomplexes). Resistenzgene (str) codieren Enzyme welche das Antibiotikum modifizieren (Phosphorylierung, Adenylierung) und so die Ribosomenbindung verhindert. Arbeitskonzentrationen sind ebenfalls 30µg/ml. Tetracycline Tetracycline binden an die 30S Untereinheit der Ribosomen, verhindern den Transfer der aktivierten Aminosäuren zum Ribosom und stoppen so die bakterielle Proteinsynthese. Tetracyclin-Resistenzgene codieren Effluxpumpen, die Tetracyclin aktiv in Form von Metallkomplexen aus der Zelle ausschleusen. Arbeitskonz.: 10 µg/ml in Flüssigkultur, 12,5 µg/ml auf Platten. Abbildung 5: Tetracyclin

24 Kolloquiumsunterlagen Seite Auswahl einiger Übungsbeispiele/Fragen (teilweise mit Lösungen) Was versteht man beim Klonieren unter kompetente Zellen? Erklären sie das Prinzip einer E. coli Transformation? Welche 3 Minimalanforderungen muss ein Plasmid besitzen um es als Klonierungsvektor verwenden zu können? Was ist der Unterschied zwischen physikalischer und chemischer Transformation? Welche Selektionsmarker (Antibiotikaresistenzen) sind häufig auf Labor-Plasmiden zu finden? Was bezeichnet man Kopienzahl bei Plasmiden und wovon hängt diese hauptsächlich ab? Was versteht man unter Inkompatibiliät von Plasmiden? Was ist eine multiple cloning site (MCS) in einem Plasmid? Welche Eigenschaften besitzt eine multiple cloning site (MCS) und wofür wird sie beim Klonieren verwendet? Was sind Restriktionsendonukleasen, und wofür werden sie beim Klonieren verwendet? Wie entstehen blunt und sticky ends einer DNA? Kann aus einer blunt end DNA durch eine in vitro Modifikation ein sticky end gemacht werden? Auf welchem Prinzip beruht die Namensgebung der Restriktionsendonukleasen (z.b. BamHI, SmaI,...) Was ist ein Isoschizomer, bzw. Neoschizomer? Wie kann man DNA Produkte die mittels Taq-Polymerase (PCR) erzeugt werden klonieren? Wie sehen die DNA Enden aus die mittels Taq-Polymerase generiert werden? Welche Eigenschaften besitzt das Enzym alkalische Phosphatase und wozu verwendet man es beim Klonieren? Wie kann man bei einer Ligation verhindern, dass sich ein linearisierter Vektor alleine religiert? Welche Eigenschaften besitzt das Enzym T4 DNA Ligase und wozu verwendet man es beim Klonieren? Beschreiben Sie die Eigenschaften des DNA Polymerase I Large Fragment (Klenow- Fragment)? Wozu wird das Klenow-Fragment in der Molekularbiologie verwendet? Wie kann eine Lyse von E.coli Zellen für eine darauffolgende Plasmid Reinigung erfolgen? Auf welchem Prinzip beruht die Plasmid Reinigung mittels alkalischer Lyse? Was ist Agarose und wozu wird es in der Molekularbiologie verwendet? Was ist eine Gelelektrophorese? Wie kann man DNA nach einer Gel-Elektrophorese sichtbar machen? Sie habe einen Vektor mit 3 Überhängen und ein Insert mit 5 Überhängen. Wie können Sie ein rekombinantes Plasmid daraus machen? Sie habe einen Vektor mit blunt ends und ein Insert mit 5 Überhängen. Wie können Sie ein rekombinantes Plasmid daraus machen? Sie habe einen SmaI geschnittenen Vektor ein SmaI geschnittenes Insert. Wie können Sie effizient ein rekombinantes Plasmid daraus machen? Welchem Problem stehen Sie gegenüber?

25 Kolloquiumsunterlagen Seite 25 Wieviel ng einer Insert-DNA von 600 bp Länge müssen in einer Ligationsreaktion zu 50 ng eines 3 kb großen Vektors zugegeben werden, wenn das Verhältnis Insert:Vektor 3:1 sein soll? Lösung: 30 ng Schreiben Sie die DNA Sequenz an (5 3 ), die ensteht, wenn eine NcoI Site (5 -C/CATGG-3 ) mit NcoI geschnitten, anschließend mit Klenow aufgefüllt und religiert wird? Lösung: 5 -CCATGCATGG-3 Schreiben Sie die DNA Sequenz an (5 3 ), die ensteht, wenn eine XhoI Site (5 -C/TCGAG-3 ) mit XhoI geschnitten, anschließend mit Klenow aufgefüllt und religiert wird? Wie funktioniert die Präparation von Plasmid-DNA nach dem Prinzip der alkalischen Lyse. Warum findet sich am Ende kaum genomische DNA in der Präparation? Welche Eigenschaften (Genotyp) des E. coli Stamms DH10B sind für das Funktionieren der Alpha-Komplementation notwendig? Im Zuge einer Klonierung soll in die MCS eines puc Plasmids ein Insert ligiert werden. Welche Kolonien sind nach dem Ausplattieren auf X-Gal/IPTG Platten bevorzugt zur Restriktionsanalyse (Screening nach Rekombinanten) heranzuziehen (Begründung)? DNA wurde aus einem Dam + - E.coli Stamm präpariert, kann jedoch nicht mehr vom Restriktionsenzym MboI geschnitten werden, obwohl die Schnittstelle vorhanden ist. Was ist die Ursache und wie lösen Sie dieses Problem? Sie tragen geschnittene doppelsträngige versus ungeschnittene Plasmid-DNA auf einem Agarosegel parallel nebeneinander auf. Wie viele Banden erwarten Sie in beiden Fällen und wie wird das Laufverhalten ungefähr sein? Machen Sie eine Skizze. Sie wollen in einen blunt end geschnittenen Klonierungsvektor ein Insert setzen, welches NcoI (generiert 5`overhangs) verdaut ist. Wie lösen Sie dieses Klonierungsproblem? Wie bestimmt man die Transformationseffizienz kompetenter Zellen? Wie hoch ist die Transformationseffizienz von kompetenten DH10B Zellen wenn nach einer Transformation ein Zehntel des Gemisches - transformiert mit 2 µl einer puc18 DNA (1 ng/ml) - auf eine LB Amp100 Platten ausplattiert und am nächsten Tag darauf 26 Kolonien gezählt wurden? Lösung: 1.3 x 10 8 cfu/µg puc18 Was ist λ (lambda) DNA und wozu wird sie im E. coli Beispiel eingesetzt? Welche Komponenten müssen in einem Ligationsansatz sein? Welche Komponenten müssen Sie zusammengeben, damit Sie bei einem mit blunt-end geschnittenen Vektor die Phosphatreste eliminieren?