Reagenzien Isolierung von Nukleinsäuren

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1 Aufbewahrung bei Raumtemperatur Anwendung Isolierung ultrareiner Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen von 1 ml bis 800 ml. Die Plasmid-DNA eignet sich für Manuelle und automatisierte Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Transfektion Transformation und Ligation Cloning In vitro Transkription Restriktionsanalyse dsdna-mutagenese PCR Produktmerkmale Reine DNA, Plasmidreinheit entsprechend der CsCl-Dichtegradientenzentrifugation, keine Kontaminationen durch RNA oder chromosomale DNA Die qualitativ hochwertige Plasmid-DNA eignet sich für alle anspruchsvollen Downstream-Anwendungen Hohe Bindungskapazität garantiert reproduzierbare Reinigungsergebnisse und hohe Ausbeuten Schnelle Aufreinigung über eine Spin-Säule Einfache Anwendung: Binden, Waschen, Eluieren Sicherheit und komfortable Anwendung sind garantiert, keine Verwendung organischer Lösungsmittel Flexibel durch unterschiedliche Formate, für Bakterienkulturen von 1 ml bis 800 ml erhältlich Beschreibung Die Perfectprep-Kits für Plasmidisolierung verwenden einen verbesserten alkalischen Lyseschritt in Verbindung mit einer extrem effektiven DNA-Bindungsmatrix, um die Plasmid-DNA von unerwünschter chromosomaler DNA und RNA zu trennen. Die Nukleinsäuren adsorbieren bei hoher Salzkonzentration an die Matrix. Polysaccharide und Proteine werden nicht an die Matrix gebunden und dadurch entfernt. Die gebundene DNA wird gewaschen und anschließend durch Erniedrigen der Salzkonzentration von der Glasmatrix eluiert. Der Perfectprep-Kit garantiert Plasmid-DNA mit einem Reinheitsgrad, entsprechend der mittels CsCi gereinigten DNA, ohne Verwendung organischer Lösungsmittel. Für den Perfectprep-Kit wird keine spezielle Ausrüstung benötigt. Perfectprep-Kits können für die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen mit einem Volumen von 1 ml bis hin zu 800 ml verwendet werden. Mit Hilfe des Perfectprep Maxi Kits wurden aus 300 ml Kultur bis zu 6 mg DNA gewonnen. In untenstehender Tabelle ist sowohl für Plasmide, die in hoher, als auch solche, die in niedriger Kopienzahl vorliegen, die für jeden Kit typische Ausbeute angegeben. Plasmid-DNA, die mit Hilfe der Perfectprep- Kits gereinigt wurde, kann direkt für molekularbiologische Verfahren, wie den Verdau mit Restriktionsendonukleasen, der automatisierten Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Transfektion von Zellen in Kultur, dsdna-mutagenese und PCR eingesetzt werden. Qualitätssicherung Jede Charge wird, wie im Anwenderprotokoll beschrieben, auf ihre Leistungsfähigkeit bei der Plasmidisolierung geprüft. Anschließend wird die isolierte Plasmid-DNA durch Spektrophotometrie, erfolgreichen Verdau mit einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen, automatisierte Fluoreszenz- DNA-Cycle-Sequenzierung und Transfektion kultivierter Zellen auf Quantität und Qualität untersucht. Tabelle 1: Ausbeuten mit Perfectprep Plasmid- Plasmidausbeute Aufreinigungs- Kit- Volumen Aufarbei- Hohe Niedrige system größe der Kultur tungsdauer Kopienzahl Kopienzahl Perfectprep Mini 1 3 ml 25 min 5 30 µg 1 10 µg Perfectprep Midi ml 120 min µg µg Perfectprep Maxi ml 150 min 250 µg 2,5 mg µg Perfectprep XL ml 150 min 2 6 mg 200 µg 1 mg 102

2 Verfahren für Perfectprep Mini 1 3 ml Bakterienkultur Zellen pellettieren, Überstände dekantieren Lösung I zugeben, mischen Lösung II zugeben, mischen Lösung III zugeben, mischen 30 sec bei x g zentrifugieren Überstand in eine Spin-Säule transferieren Perfectprep DNA Binding Matrix hinzugeben, mischen 30 sec bei x g zentrifugieren Dekantieren, verdünnte Reinigungslösung zugeben, mischen 60 sec bei x g zentrifugieren Dekantieren, Zentrifugieren wiederholen 60 sec bei x g zentrifugieren, RT Spin-Säule in ein frisches Gefäß einsetzen, TE zugeben und Plasmid eluieren Gereinigte Plasmid DNA Perfectprep Plasmid Mini Ausbeute: Spuren: 1: λ Hind-III Marker 2 14: Plasmid pch110 isoliert mit dem Perfectprep Plasmid Mini. Es wurde je 1,5 ml Kulturlösung (2x YT mit Amp.) eingesetzt. 250 ng Plasmid DNA pro Spur (5 µl des Gesamtelutionsvolumen von 50 µl) 15: λ Hind-III Marker Isolierung von Nukleinsäuren Reagenzien Vertrieb Deutschland D Köln Tel. (0180) Fax (02203) eppendorf home page: 103

3 Leistungsfähigkeit ABI Modell 377, automatisierte Fluoreszenz-DNA-Cycle- Sequenzierung von pnota/t7 TM -Plasmid-DNA, die mithilfe der Perfectprep- Methode präpariert wurde. Zu beachten ist das Ausbleiben von nicht identifizierbaren Basen no-calls (N) bis weit hinter einer abgelesenen Länge von 650 bp. Ausbeute mit Perfectprep Kits Midi und Maxi Anwendung Ausbeute in µg Midi-Prep 1 Midi-Prep 2 Maxi-Prep 1 Maxi-Prep 2 Eppendorf Kit Ionen-Austausch Wettbewerbs Kit Abb. 1: Vergleich der Plasmid-DNA-Ausbeuten zwischen den Eppendorf Perfectprep Kits und marktüblichen Kits (Midi- und Maximaßstab). Die Konzentration wurde jeweils spektrophotometrisch bestimmt. Midi-Prep 1 (25 ml Ansatz), Vector pegfp-n1, Länge 4,7 kb, Bakterienstamm HB 101; Midi-Prep 2 (75 ml Ansatz), Vector pch110, Länge 7,1 kb, Bakterienstamm JM 109; Maxi-Prep 1 (100 ml Ansatz), Vector pgemgapdh, Länge 2,7 kb, Bakterienstamm HB 101. Maxi-Prep 2 (100 ml Ansatz), Vector pch110, Bakterienstamm JM 109; Jeder Versuch wurde 2 mal durchgeführt. Die Transfektion von Säugerzellen stellt eine sehr anspruchsvolle Nachfolge-Applikation dar. Zahlreiche Zell-Linien können mit Perfectprep aufgereinigter DNA transfiziert werden. Dabei werden sogar z.t. höhere Transfektionsraten erzielt, als mit DNA, die mit einem Endotoxin-freien Kit aufgereinigt wurde. Abb. 2: Transfektion von Cos 1 Zellen mittels Calciumphosphat Präzipitation. Vector pegfp (Clontech) in E. coli JM 109. Plasmid Kits: Eppendorf Plasmid Maxi Kit, Wettbewerber Endotoxin freier Kit. Die Transfektionsraten wurden durch FACS Analysen ermittelt. Eppendorf Perfect Plasmid Maxi Endotoxin-freier Wettbwerbs-Kit Transfektionsrate [%] Transfektionsrate 27,5% 21,25% 104

4 Verfahren Perfectprep Maxi Bakterienkultur, ml Zellen pellettieren, Überstände dekantieren, Lösung I zugeben, Zellen resuspendieren, Lösung II zugeben, mischen, Lösung III zugeben, mischen 10 Minuten bei x g zentrifugieren Überstand in eine frische Flasche transferieren, Perfectprep DNA Binding Matrix zugeben, mischen, auf Eis 5 min inkubieren, mischen Spin- Säule Zentrifugengefäß 20 Minuten bei x g zentrifugieren, Überstand dekantieren Verdünnte Reinigungslösung zugeben, mischen In Spin-Säule dekantieren Wiederholen 5 Minuten bei x g zentrifugieren Filtrat dekantieren, verdünnte Reinigungslösung zugeben 5 Minuten bei x g zentrifugieren Spin-Säule in ein frisches Gefäß einsetzen, TE zugeben und Plasmid durch Zentrifugieren (5 Minuten bei x g) eluieren Perfectprep Plasmid Mini, 50 Ansätze Perfectprep Plasmid Mini, 250 Ansätze Perfectprep Plasmid Midi, 20 Ansätze Perfectprep Plasmid Midi, 50 Ansätze Perfectprep Plasmid Maxi, 10 Ansätze Perfectprep Plasmid Maxi, 25 Ansätze Perfectprep Plasmid XL, 5 Ansätze Perfectprep Plasmid XL, 20 Ansätze Isolierung von Nukleinsäuren Reagenzien Gereinigte Plasmid-DNA 1) Optional: Ethanol Fällung 2) 1) Plasmid-DNA ist geeignet für PCR, Restriktions-Analysen, Lipofektion und Transformation. 2) Plasmid-DNA ist geeignet für manuelle und automatische Floureszenz-Sequenzierung, Cloning und dsdna-mutagenese Vertrieb Deutschland D Köln Tel. (0180) Fax (02203) eppendorf home page: 105

5 Plasmid Aufreinigung im 96 Well Format Welcher 96 Well Kit wird empfohlen? Niedriger Durchsatz Auswahl des Perfectprep 96 Well Format Hoher Durchsatz Spin Vakuum Verschiedene Downstream Applikationen Verschiedene Downstream Applikationen Perfectprep 96 Spin Direct Bind Perfectprep 96 Vac Direct Bind Zubehör Zentrifugen und Rotore Das Sandwich, bestehend aus Anzuchtplatte und Auffangplatte, wurde in den Spezialrotor der Centrifuge 5810 eingesetzt Centrifuge 5810, ohne Rotor, 230 V/50 60 Hz Centrifuge 5810 R, ohne Rotor, 230 V/50 60 Hz Deepwell-Platten-Rotor, inkl. 2 Gehängen; max. Höhe der Beladung: 85 mm Perfectprep 96 Vac Manifolds Für den Einsatz mit dem Perfectprep 96 Vac Kit sind mehrere Vakuumkammern erhältlich. Mit dem Single Manifold können 96 Plasmidproben einer Platte in etwa 45 Minuten isoliert werden. Im Quad Manifold mit 4 Absaugvorrichtungen können 4 x 96er Platten in weniger als 2 Stunden gleichzeitig bearbeitet werden. Informationen über die verschiedenen Vakuumkammern auf Anfrage. Perfect Vac Manifold, single 1) Perfect Vac Manifold, single basic 2) Perfect Vac Manifold, quad 1) ) Inkl. Manifold, Ein-/Ausschalter, Kontrollventil und Druckmesser. 2) Inkl. Manifold. 106

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