Pflanzenbiotechnologie

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1 Pflanzenbiotechnologie

2 1. Nicht molekular basierte Methoden = klassische Züchtungsforschung - beruft sich auf Spontanmutationen und Kreuzung von Eigenschaften = Austausch des gesamten Allels (= Genoms) Problem - sehr langsamer Prozess (Iteration von Vegatationszyklen, Selektion, Kreuzung) - begrenzt auf kreuzbare Arten (tw. erweitert durch Zwangskreuzung)

3 2. Molekulare Methoden = eigentliche Gentechnik Transfer von Genen - rekombinante DNA (aus beliebigen Quellen) - Transformation von Pflanzen - Regeneration von Pflanzen in vitro (dies kommt auch ohne molekulare Methoden aus -> Pflanzenproduktion -> Zellkulturen

4 (Prinzipielle) Produkte der Pflanzen-Biotechnologie 1. input traits zielt auf Eigenschaften der landwirtschaftlichen Produktion (quantitative traits) z.b. Resistenzen gegen Herbizide, Pilze, Insekten Toleranz gegen Trockenheit, Kälte, Nährstoffmangel etc. 2003: 90% der gentechnisch bebauten Abbaufläche mit diesen Eigenschaften ausgestattet (Soja, Mais, Baumwolle, Raps)

5 2. Output traits Verbesserung des pfl. Produkts (qualitative traits) - Nährstoffgehalt - Zusammensetzung (essentielle Fettsäuren, Aminosäuren,...) -> Ernährungszwecke (funktionelle Nahrungsmittel) - spezifische Pflanzeninhaltstoffe, Stärke, Proteine, Wirkstoffe -> industrielle Anwendung/Aufarbeitung (phytofarming) - Produktqualität (Haltbarkeit, Aussehen: Gentomate )

6 Sicherheitsbegleitforschung -> als Nahrungsmittel (potentielle Risiken nach Verzehr?) -> im Anbau (Freisetzungsproblematik einschließlich Resistenzmarker )

7 A. Herstellung transgener Pflanzen Transformation von Pflanzen ist die Inkorporation und Expression von fremden Genen (findet auf der Ebene von Einzelzellen statt) Voraussetzung sind geeignete -Transformationssysteme (Transfer der Fremd-DNA) -Selektionssysteme (Finden des positiven Ergebnisses) - Regenerierungssysteme (Erzeugung intakter Pflanzen)

8 Transformationssysteme stabile Transformation Integration der DNA in autonome genetische Strkturen (Chromosome bzw. Plasiden- oder Mitochondrie- DNA) -> wird bei der Vererbung weitergegeben -> transgene Nutzpflanzen transiente Transformation -> keine dauerhaften Strukturen (allmählicher Abbau durch Zelle) -> Forschungsmodelle

9 1. Agrobacterium als Transformationssystem pflanzenpathogene Spezies (A. tumefaciens, A. rhizogenes) -> vorwiegend dikodyledone Pflanzen Vektor ist hier ein Plasmid (ca. 200 kb), 25 Gene Ti (A. t.) Ri (A. r.) -> tumor inducing -> root inducing ca. 20k hb in Wirtsgenom integriert -> Tumorbildung kann als shuttle genutzt werden, um fremde DNA mit einzuschleusen (onc-gene ausgetauscht gegen bis zu 150 kb Fremd-DNA )

10 Moderne Transformationssysteme beinhalten 2 Plasmide 1. Binärer Vektor (mit LB und RB Elementen zur Integration des genes of interest, besteht aus einem in Escherichia coli und Agrobacterium vermehrbarem Plasmid) 2. Entwaffnetes Ti Plasmid (ohne onc Gene), fungiert als Helferplasmid für Transformation des binären Vektors

11 - Plasmid-DNA aus E. coli, Zuschnitt durch Restriktasen 2. Bionistische Methode (gene gun) partikelgebundener Gentransfer (Beschießen von Blättern) Vorteil: - alle Pflanzen möglich - Überwindung der Zellwand als generelle Barriere - alle Genome des Wirts können erreicht werden Methode: - Luftdruck (Optmierungsmöglichkeit, Effizienz derzeit 1-5 %) - Gold-/Wolframpartikel (1-2 µm)

12 3. Techniken mit Protoplasten - Zellen werden durch Zellulasen von der Zellwand befreit - oft Probleme mit der Regenerierung lebensfähiger Zellen Methoden - nackte DNA (Inkubation) - Liposomen (Überwindung der Membran -> Bilayer) - Elektroporation (Permeabilisierung durch hochenerget. Feld)

13 4. Plastidentransformation besonders geeignet für homologe Rekombination (= gezielte Insertion von Genkassetten) Vorteil: - Kontrolle über Plastid-Promotor (z.b. Photosynthesegene) - Selektion über Antibiotika-Marker - maternale Vererbung (keine Auskreuzung durch Pollen) - hohe Kopienzahl (= bessere Effizienz) Kopien pro Zelle - offensichtlich korrekte Faltung der Proteine (= Funktionalität) Nachteil: - geringe Effizienz (biolistische Methode) - aufwändige Phase, um homoplastomer Zellen zu kultivieren

14 5. Virale Systeme Pflanzenviren meist als RNA-Viren - Vermehrung in Pflanzenzellen, bis zu 2 g pro kg Wirtszelle - Integration von genes of interest (GOI) - geeignete Expressionssysteme führen zur Über-Produktion des gewünschten Proteins - proteinchemische Methoden der Aufreinigung Nachteil: Anwendung nur in Gewächshäusern

15 B. Selektionssysteme Effizienz der Transformation ist prinzipiell gering, deshalb sind wenige positive Ergebnisse vor dem Hintergrund sehr vieler unveränderter Zellen zu suchen durch negative Selektion: ermöglicht die Detoxifikation des selektiven Agens (Herbizid-[Hygromycin], Antibiotikaresistenz [Glyphosat]) positive Selektion: gibt einen physiolog. Vorteil, ohne den z.b. Regenerierung nicht möglich ist (Kompensation von Auxotrophien) Counter-Selektion (z.b. Eliminierung von Falsch-Negativen): Anschalten eines Schrittes zur Bildung von Phytotoxika

16 C. Regenerierung transgener Pflanzen -> Optimierungsaufgabe mit unterschiedlichen Variablen -> Speziespezifische Parameter [sollen im Detail hier nicht dargestellt werden]

17 D. Analyse des Transformationsergebnisses - Nachweis des Integrates (DNA) durch -> Sequenzierung (einfach, erforderlicher Nachweis) -> Kartierung (komplex, kompliziert; selten erforderlich wiederum einfach für bereits komplett sequenzierete Spezies-> Arabidopsis thaliana) -Transkriptionsprodukt (Messenger RNA) -> Transkriptom - Translationsprodukt (Protein) -> Proteom

18 Perspektiven Genomik Ansätze erlauben - schnellere Sortenentwicklung (Beschleunigung des Züchtungsprozesses) - neue Ansätze für Resistenzen (neue Wirkmechanismen) Neue Produkte - funktionelle Lebensmittel (maßgeschneidert) - Nutraceuticals (Lebensmittel mit medizinischer Wirkung) Phytopharming - monoklonale Antikörper - Polyhydroxybuttersäure (Bioplastic)

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