Isolierung von Plasmid-DNA aus einem Bakterienlysat mittels Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Säule

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1 Versuch 2 Isolierung von Plasmid-DNA aus einem Bakterienlysat mittels Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Säule Versuchsbeschreibung Die Isolierung hochreiner Nucleinsäuren ist eine der grundlegenden Voraussetzungen molekularbiologischer Techniken. Zur Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien wird heute vielfach das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie angewandt. In diesem Praktikumsversuch soll ausgehend von einem Bakterienlysat hochreine Plasmid-DNA gewonnen und diese Plasmid-DNA durch Restriktionsverdau und nachfolgende Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert werden. Theoretische Grundlagen Ionenaustauschchromatographie Die Ionenaustauschchromatographie ist eines der wichtigsten flüssigkeitschromatographischen Trennverfahren für die präparative Biochemie. Grundlegend basiert ihr Prinzip auf der Interaktion von gelösten positiv oder negativ geladen Teilchen mit einer entgegengesetzt geladen festen Trägermatrix. Bei einer Anionenaustauschchromatographie besteht die Trägermatrix aus positiv geladenen Gruppen (z.b. Diethylaminoethan, DEAE). Diese Gruppen liegen über einen weiten ph-bereich protoniert und damit positiv geladen vor. Das negativ geladenene Gegenion ist häufig Chlorid ( ). Unter Austausch dieses Gegenions kann ein negativ geladenes Molekül an die Matrix gebunden werden. Nach analogem Prinzip funktioniert auch die Kationenaustauschchromatographie. Dabei werden aufzureinigende, positiv geladene Moleküle an eine Trägermatrix gebunden, die negativ geladene Gruppen enthält (z. B. Carboxymethylgruppen). Als Gegenionen dienen i.d.r. Natriumionen, die gegen die positiv geladenen Probenmoleküle ausgetauscht werden. Da Biomoleküle, insbesondere Proteine und Nucleinsäuren, (in Abhängigkeit vom ph-wert) eine Ladung aufweisen, eignet sich die Ionenaustauschchromatographie sehr gut für die Reindarstellung biologischer Makromoleküle bzw. ist zumindest ein wesentlicher Bestandteil von Aufreinigungsverfahren. Beladung der Säule und Elution Das Beladen der Säule mit den Probenmolekülen ist der erste Ionenaustauschvorgang, bei dem die Gegenionen der Säulenmatrix gegen die Probenmoleküle ersetzt werden. Während dieses Beladungsvorgangs kommt es bereits zu einer ersten Fraktionierung des zu trennenden Substanzgemisches. Während ein Teil der verschiedenen Probenmoleküle auf Grund ihrer Ladung an die Matrix binden kann, passieren entgegengesetzt oder schwach geladene Moleküle die Säule und werden dadurch von den übrigen Komponenten abgetrennt. Dem Beladen der Säule folgt häufig ein oder mehrere Waschschritte, bei dem Moleküle, die nur sehr schwach mit der Matrix interagieren, von der Säule gespült werden. Für das Ablösen der gebundenen Moleküle muß die elektrostatische Bindung an die Säulenmatrix durch Zugabe von Inertsalz (mit dem ursprünglichen Gegenion) geschwächt werden. Üblicherweise wird dazu ein Ionenstärkegradient verwendet, d.h. die Konzentration an zugegebenem NaCl (z.b.) wird kontinuierlich erhöht. Durch dieses Verfahren wird der Hauptfraktionierungsschritt des Chromatographieverfahrens realisiert. Nacheinander werden zuerst Moleküle von der Säule eluiert, die schwächer an die Matrix binden, danach werden die stärker an die Säule gebundenen Moleküle von der Matrix gelöst. Bei entsprechender Wahl eines geeigneten Fraktionsvolumens ist es prinzipiell möglich, daß in einer Fraktion eine homogene Substanz vorliegt.

2 Neben der Elution mit einem linearen Ionenstärke-Gradienten ist auch eine stufenweise Erhöhung der Ionenstärke des Puffers möglich. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht u.a. in einem geringeren apparativen Aufwand. Neben der Elution durch eine veränderte Ionenstärke ist auch eine Elution durch veränderte ph-bedingungen möglich. Die Wirkung einer ph-änderung beruht auf der Protonierung oder Deprotonierung der für die Bindung verantwortlichen Gruppen und der damit einhergehenden Schwächung der Wechselwirkung zwischen der Trägermatrix und den zu trennenden Molekülen. Bei einer Anionenaustauschchromatographie würde man dementsprechend mit Gradienten mit abnehmendem ph eluieren, für die Kationenelution einen ansteigenden ph-gradienten einsetzen. Auch dabei ist sowohl der Einsatz eines linearen Gradienten, als auch ein Stufengradient möglich. Es muß allerdings hier erwähnt werden, daß ph-gradienten nur bedingt verwendbar sind, da viele biologische Makromoleküle sehr empfindlich gegenüber extremen ph-änderungen sind. Abbildung 1 Subst. 1 (--) Subst. 2 (-) Subst. 3 (+) niedrige Konz. NaCl hohe Konz. NaCl Subst. 1 (--) Subst. 2 (-) Subst. 1 (--) Subst. 2 (-) Subst. 1 (--) Subst. 1 (--) Subst. 3 (+) Subst. 2 (-) Subst. 1 (--) Wahl des Ionenaustauschers Die Auswahl des Ionenaustauschers richtet sich primär nach der Ladung der zu trennenden Moleküle. Dabei ist zu berücksichtigen, daß für die Ladung insbesondere von Proteinen der ph-wert eine entscheidende Größe ist. Ein Protein mit einem Isoelektrischen Punkt (pi: der ph-wert, bei dem das Protein netto ungeladen ist, also gleich viel positive wie negative Ladungen hat) von z.b. pi=7 wird bei einem ph-wert von ph 6 positiv geladen sein und demzufolge an einen Kationenaustauscher binden. Andererseits bewirkt die ph-änderung auf ph 8, daß das Protein nun eine negative Nettoladung aufweist und demzufolge nun an einen Anionenaustauscher bindet. Der Zusammenhang von ph-wert, Nettoladung und Bindung ist in Abbildung 2 noch einmal schematisch dargestellt. H OH Abbildung 2 Molekül Molekül Molekül Nettoladung des Proteins bindet an Anionenaustauscher ph bindet an Kationenaustauscher

3 Meist ist es erforderlich, daß man das geeignete Säulenmaterial in einem Vorversuch experimentell bestimmt. Dazu kann in einer Serie mit 1,5 ml -Reaktionsgefäßen eine kleine Menge Trägermaterial vorlegen, das man dann mit Puffern unterschiedlichen ph-wertes äquilibriert. Zu diesen Ansätzen gibt man dann eine kleine Menge des zu analysierenden Makromoleküls und bestimmt dann, bei welchem ph-wert die Substanz nicht im Überstand nachzuweisen ist und demzufolge an den Ionenaustauscher gebunden hat. Dieses Verfahren kann für mehrere Chromatographiematerialien angewandt werden, aus denen man dann i.d.r. das mit der höchsten Bindungskapazität verwendet. Ionenaustauschchromatographie zur Reindarstellung von Plasmid-DNA Plasmide Zusätzlich zu ihrem Hauptchromosom ( 4 Millionen Bp) besitzen viele Bakterienstämme relativ kleine ringförmige DNA-Moleküle, die vielfach nur groß sind. Diese Minichromosomen werden Plasmide genannt. Vielfach tragen diese ringförmigen Moleküle Gene, die eine Resistenz gegen verschiedene Antibiotika (Ampicillin, Tetracyclin u.ä.) vermitteln. Die Plasmide liegen in einer Bakterienzelle im Gegensatz zum Hauptchromosom in einer hohen Kopienzahl vor ( pro Zelle). Während die Ausbildung von Antibiotikaresistenzen speziell pathogener Keime aus klinischer Sicht problematisch ist, war der Einsatz von Plasmiden in der Molekularbiologie und Gentechnologie ein bahnbrechender Schritt und ist auch heute nahezu in jede gentechnologische Arbeit integriert. An dieser Stelle soll nicht ausführlich auf die universellen Einsatzmöglichkeiten und Arbeitstechniken mit Plasmid-DNA eingegangen werden, in diesem Zusammenhang sei auf das Praktikum Mikrobiologie im Folgesemester verwiesen. Zum Verständnis der Bedeutung der Gewinnung von Plasmid-DNA muß hier jedoch erwähnt werden, daß sich in die Basenabfolge eines bakteriellen Plasmids auch Nukleinsäureabschnitte einer anderen Spezies gentechnologisch integrieren lassen. Da auch solche rekombinanten Plasmide in hoher Kopienzahl in Bakterien synthetisiert werden, wird es u.a. möglich, eukaryontische Genabschnitte mit relativ großer Quantität in einem bakteriellen System zu amplifizieren. Im Rahmen des Praktikums sollen Sie erste praktische Fertigkeiten zur Präparation dieser rekombinanten Plasmid-DNA aus Bakterien erlangen. Gentechnologische Arbeiten Mit dem künstlichen Einbringen von rekombinanten Plasmiden in Bakterien werden Organismen geschaffen, die nicht auf natürlichem Weg entstehen können. Jede Arbeit mit einem solchen gentechnologisch veränderten Organismus (GVO) unterliegt einer Reihe von Sicherheitsmaßnahmen, die im Gentechnikgesetz (GenTG) zusammengefaßt sind. Über grundlegende Bestimmungen werden Sie vor Beginn der praktischen Arbeiten durch einen Vortrag des Beauftragten für Biologische Sicherheit der Universität informiert. Es wird hier ergänzend darauf hingewiesen, daß die Arbeiten im Praktikum die geringste Sicherheitsstufe (S1) erfordern und sich lediglich auf die Lyse der Bakterien beschränken. Plasmidreinigung an der Anionenaustauscher-Säule Abbildung 3 Ribose Base O-CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 N: CH 2 CH 3 DEAE H + O-CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 + N CH 2 CH 3 O H O P O O Ribose Base DNA

4 Während noch vor einigen Jahren die Plasmidreinigung mittels Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation in der Ultrazentrifuge die Methode der Wahl war, ist in der letzten Zeit die Ionenaustauschchromatographie als weniger apparativ aufwendige Methode zunehmend populärer geworden. Nach der Lyse der Bakterien durch SDS (Natriumdodecylsulfat) unter stark alkalischen Bedingungungen (100 mm NaOH) werden die bakteriellen Proteine und die genomische Bakterien-DNA durch Zugabe einer hochmolaren Kaliumacetatlösung denaturiert und präzipitiert. Die relativ kleine Plasmid-DNA bleibt unter diesen Bedingungen in Lösung und wird zur weiteren Aufreinigung der Säulenchromatogrphie unterzogen. dntps 10mer linker 30mer Oligo trna rrna M13ssDNA dsdna(plasmide) Die Plasmid-Reinigung an einer Anionenaustauscher-Matrix basiert auf der Interaktion zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA-Grundstruktur und den positiv geladenen DEAE- (Diethylaminoethan) Gruppen auf der Oberfläche der Trägermatrix (Abbildung 3). Die Bindung an die Trägermatrix erfolgt unter relativ niedriger KCl-Konzentration (850 mm, ph 6,3). Verunreinigungen, die nicht durch den vorangegangenen Präzipitationsschritt abgetrennt wurden, werden durch Waschen mit einem Puffer mittlerer KCl-Konzentration (1,15 M) von der Säule entfernt, während die Plasmid-DNA an der Säule gebunden bleibt. Sie wird nachfolgend durch einen Puffer mit einem 1 M KCl-Gehalt und gleichzeitiger Erhöhung des ph-wertes (auf ph 8,5) von der Säule eluiert. Abbildung 4 A 260 ph 7,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 M NaCl An die Elution schließt sich ein Konzentrierungsschritt an. Dazu wird die gelöste Plasmid-DNA durch Isopropanol präzipiert, zentrifugiert und nachfolgend in einem geeigneten Volumen aufgenommen. Die Bindungskapazität der im Praktikum verwendeten Säulen beträgt maximal 100 µg Plasmid-DNA/Säule. Abhängig von der Art des aufzureinigenden Plasmids können aber auch nur Ausbeuten von ca. 20 µg erhalten werden. Analyse der Plasmid-DNA durch Restriktionsendonucleasen Enzymatische Wirkung und Spezifität von Restriktionsendonucleasen Restriktionsendonucleasen sind bakterielle Enzyme, die doppelsträngige DNA-Moleküle sequenzspezifisch spalten. Sie gelten als DIE universellen Werkzeuge der Molekularbiologie/Gentechnologie. Die Sequenzspezifität wird dadurch gewährleistet, daß dise Enzyme sogenannte palindromische Sequenzen in der DNA erkennen und spalten. Unter einem Palindrom wird eine Buchstabenfolge verstanden, die sowohl von rechts oder von links gelesen den gleichen Sinn ergibt ( z.b. RELIEFPFEILER). Bei Nucleinsäuren bezieht sich der Begriff Palindrom auf Basensequenzen, die in komplementären Strängen jeweils von 5 nach 3 gelesen dieselben Sequenzen ergeben.

5 + Strang 5 P GTAGCGAATTCTGCCG OH 3 - Strang 3 OH CATCGCTTAAGACGGC P 5 5 P GTAGCG- OH 3 5 P AATTCTGCCG OH 3 3 OH CATCGCTTAA - P 5 3 OH GACGGC P 5 Oben ist ein schematisch ein Beispiel für die Spaltung eines DNA-Abschnittes durch die Restriktionsendonuclease (E.coli Restriktionsnuclease I) dargestellt. Die spezifische Erkennungssequenz besteht aus 6 palindromischen Basenpaaren, innerhalb der eine hydrolytische Spaltung (bei zwischen G und A) erfolgt. Es sind heute mehrere hundert Restriktionsendonucleasen unterschiedlichster Sequenzspezifität bekannt. Mit Hilfe dieser Endonucleasen lassen sich zum einen große DNA-Abschnitte für nachfolgende Klonierungsstrategien und u.ä. in definierte, kleinere Fragmente spalten, zum anderen wird die Sequenzspezifität der Restriktionsendonucleasen zur Analyse von DNA-Molekülen genutzt. So ergibt sich aus der unterschiedlichen Sequenz von verschiedenen DNA-Bereichen mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auch eine unterschiedliche Frequenz im Auftreten spezifischer Erkennungsstellen für ein Restriktionsenzym. Statistisch wiederholt sich die gleiche Abfolge von z.b. 6 Bp jeweils im Abstand von 4096 Bp, praktisch tritt dieses jedoch kaum auf. Aus dem zuvor Angeführten ergibt sich, das zwei verschiedene DNA-Bereiche nach Inkubation mit einer (oder mehreren) Restriktionsendonuclease(n) in unterschiedlich große Fragmente gespalten werden (Abbildung 5). Das durch die Spaltung entstandene spezifische Restriktionsmuster kann durch Fragmentgrößenanalyse mittels Agarosegelelektrophorese nachgewiesen werden. HindIII Plasmid 1 Plasmid 2 HindIII Restriktionsschritt mit /HindIII Abbildung 5 HindIII HindIII HindIII HindIII Agarosegelelektrophorese Agarose, ein Polysaccharid aus roten Meeresalgen, ist ein lineares Polymer aus alternierend 1,3-verknüpften - D-Galactopyranose- und 1,4-verknüpften 3,6-Anhydro--L-Galactopyranose-Resten. Agarose löst sich beim Erhitzen in Wasser und bildet beim Abkühlen ein Gel mit einer netzwerkartigen, dreidimensionalen Struktur (mittlerer Porendurchmesser 150 nm). Je nach Größe der zu trennenden DNA-Moleküle werden Gele mit einer Agarosekonzentration von 0,3-2 % verwendet.

6 Die üblicherweise verwendeten Elektrophoresekammern sind nach oben offen, sie werden mit einer heißen Agaroselösung gefüllt. Für die Ausbildung der Probenauftragstaschen wird auf der Kathodenseite ein Gelkamm in die Lösung getaucht und fixiert. Nach dem Erstarren des Gels und Entfernen des Kamms wird in die Kammer Elektrophoresepuffer gefüllt, so daß das Gel vollständig mit Puffer überschichtet ist (submarine Elektrophorese). Die zu trennenden DNA-Proben werden in die Geltaschen eingefüllt und danach eine Spannung angelegt (ca V/cm Elektrodenabstand). Bei einem leicht alkalischen ph-wert liegen die Phosphatreste der Nukleinsäure negativ geladen vor. Da bei Nucleinsäuren das relative Verhältnis zwischen Phosphatresten und Molekulargwicht und damit die relative Molekülladung konstant bleibt, ist die elektrophoretische Beweglichkeit von DNA-Molekülen durch ein Gelnetzwerk proportional zum Molekulargewicht (bzw. zur Anzahl der Basenpaare des Molekuls). Ähnlich der SDS-PAGE-Elektrophorese von Proteinen (vergleiche Versuch 1) ergibt sich eine logarithmische Abhängigkeit der Wanderungsstrecke im Gel und der Molekülgröße. Durch Vergleich der Wanderungsstrecke einzelner DNA-Fragmente unbekannter Größe mit Fragmenten bekannter Basenpaaranzahl läßt sich die Größe der unbekannten DNA bestimmen. Der Nachweis von DNA (oder RNA) in einem Agarosegel erfolgt am einfachsten durch Ethidiumbromid, einem roten Farbstoff, der zwischen die Basenpaare des DNA intercaliert und in diesem Zustand sehr stark fluoresziert, während der in der Lösung befindliche Farbstoff nur sehr schwach fluoresziert. Die Fluoreszenzanregung erfolgt durch nahes UV (z.b. 302 nm), die Fluoreszenzemission ist im orange-roten Bereich des sichtbaren Lichts (509 nm) wahrnehmbar. Mit Ethidiumbromid lassen sich DNA-Banden von weniger als 20 ng nachweisen. Versuchsdurchführung Lösungen und Materialien Kleingeräte: Glaspipetten 10 ml, 5 ml, 1 ml 10 ml Einwegpipette Pipettierhilfe Variable Pipetten µl; 0,5 10 µl Becherglas 200 ml Stativ mit Querklemme Quarzküvette Erlenmeyerkolben 250 ml Corex-Zentrifugenröhrchen Zentrifugenadapter 1,5 ml Reaktionsgefäße Glastrichter Geräte: DEAE-Anionenaustauschersäule Photometer Standzentrifuge Horizontalelektrophoresekammer mit Netzgerät UV-Leuchttisch Lösungen: (alle Puffer werden Ihnen als fertige Lösungen zur Verfügung gestellt!)

7 Präparation der Plasmid-DNA: Puffer S1: 50 mm Tris/HCl, 10 mm EDTA, 100 µg RNase A/ml, ph 8,0 Puffer S2: 200 mm NaOH, 1 % SDS Puffer S3: 2,8 M Kaliumacetat, ph 5,1 Puffer N2: 100 mm Tris/HCl, 15 % EtOH, 900 mm NaCl, ph 6,3 Puffer N3: 100 mm Tris, 15 % EtOH, 1150 mm NaCl, ph 6,3 Puffer N5: 100 mm Tris, 15 % EtOH, 900 mm NaCl, ph 8,5 Restriktionsverdau 2 Restriktionsenzymlösungen mit 10x Reaktionspuffer Agarosegelelekktrophorese Agarose (Electrophoresis Grade) TBE-Puffer (90 mm Tris/HCl, 90 mm Borsäure, 2,5 mm EDTA, ph 8,3 Probenauftragspuffer mit Bromphenolblau (100 mm EDTA, 70 % Saccharose, 0,01 % Bromphenolblau) Färbelösung mit Ethidiumbromid (3 µg/ml) Versuchsablauf Am Vorabend des Experiments werden von den Praktikumsassistenten Bakterienkulturen (Escherichia coli K12) in einer Schüttelkultur angeimpft. Diese Bakterien wurden mit Plasmid-DNA transformiert. Die Aufgabe der Praktikumsteilnehmer soll darin bestehen, diese Plasmid-DNA in reiner Form aus den Bakterien zu isolieren. Das Bakterienpellet wird Ihnen am Praktikumstag übergeben. Alle Bakterien eines Pellets sind aus einem Klon hervorgegangen. Im einem Pellet ist nur jeweils ein Plasmidtyp zu erwarten. Um welches Plasmid es sich dabei handelt, sollen Sie nach der Präparation durch Restriktionsverdau bestimmen. Bakterienlyse und Chromatographie - Geben zu dem Bakterienpelett 4 ml des Puffers S1 und resuspendieren Sie das Pellet gründlich durch mehrfaches Aufziehen in der Pipette. (10 ml Einwegpipette verwenden und diese in den Autoklavierabfall geben). Vermeiden Sie unbedingt das Verspritzen von Bakteriensuspension!. Durch die im Puffer vorhandene RNase wird die bakterielle RNA abgebaut. - Zu der Bakteriensuspension werden danach 4 ml Puffer S2 gegeben, das Röhrchen zugeschraubt, und die Lösungen vorsichtig (!) durch mehrfaches Wenden (ca. 5 mal) gemischt. Danach wird die Mischung exakt für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Durch das im Puffer vorhandene SDS und die Natronlauge werden die Bakterien lysiert (sichtbar am Klarwerden der Lösung). Starke mechanische Belastung ist zu vermeiden, da dadurch die chromosomale DNA zu kleine Fragmenten geschert wird, die nicht von der Plasmid-DNA zu trennen sind. Zu lange Inkubationszeit muß vermieden werden, da dadurch die Plasmid-DNA irreversibel denaturiert wird.

8 - Danach werden 4 ml des Puffers S3 (befindet sich auf Eis) zum Ansatz gegeben, die Lösungen gründlich vermischt und für 10 min auf Eis inkubiert. Durch die Kaliumacetatlösung wird das SDS des Puffers S2, die genomische DNA und die bakteriellen Proteine denaturiert und präzipitiert. - Während der Ansatz auf Eis inkubiert, kann die Säule äquilibriert werden. Spannen Sie diese dazu in das Stativ, stellen darunter ein Becherglas und geben 2,5 ml Puffer N2 auf die Säule. - Kurz vor Ende der Inkubation auf Eis setzen sie den Faltenfilter in den Trichter und setzen den Trichter auf das 50 ml-einmalröhrchen (blauer Deckel). - Filtrieren Sie den Ansatz durch den Faltenfilter, das Filtrat muß danach völlig klar sein. Die Filtration ist essentiell, da SDS-Spuren die Interaktion der DNA mit der Trägermatrix stark inhibieren - Geben Sie das Filtrat nun vorsichtig auf die Säule. - Nachdem das Lysat die Säule vollständig passiert hat, geben Sie zum Waschen der Säule 10 ml Puffer N3 auf die Säule. - Nachdem der Waschpuffer die Säule vollständig passiert hat, stellen Sie das Corex-Zentrifugenröhrchen unter die Säule. Zur Elution der gebundenen Plasmid-DNA werden nun 5 ml Puffer N5 auf die Säule gegeben und das Eluat im Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Durch den hohen Salzgehalt des Elutionspuffers werden die Plasmidmoleküle von der Trägermatrix gelöst. - Zur Präzipitation der DNA setzen Sie dem Eluat 3,5 ml Isopropanol zu und mischen gründlich. - Setzen Sie das Zentrifugenröhrchen in den Adaptergummi und tarieren Sie das Röhrchen mit Adapter gegen das Röhrchen einer benachbarten Praktikumsgruppe. Nutzen Sie dazu eine Waage, auf der sich ein schmales Becherglas befindet. Verwenden Sie eine Isopropanol/Puffer N5-Mischung zum Austarieren. - Setzen Sie Ihr Röhrchen in den Zentrifugenrotor, wobei zu beachten ist, dass sich das Röhrchen, gegen das Sie austariert haben, genau gegenüber im Rotor befindet. - Es wird bei rpm für 25 min bei 4 C zentrifugiert (die Zentrifugen werden grundsätzlich vom Assistenten bedient!). - Nach der Zentrifugation gießen Sie vorsichtig (!) den Überstand ab. Das Pellet ist häufig sehr diffus über den Boden des Röhrchens verteilt. - Um restliche Salzreste zu entfernen, werden sehr vorsichtig (!) 2 ml eiskaltes 70 %-iges Ethanol zum DNA-Pellet gegeben. Dabei ist zum Einfüllen des Ethanols das Röhrchen schräg zu halten und der Ethanol sehr langsam zuzugeben. Es muss unbedingt vermieden werden, dass sich das Pellet von der Wandung des Röhrchen löst. - Gießen Sie danach das Ethanol ab (vollständig) und trocknen sie das Pellet für 15 min an der Luft. (Alternativ kann die Trocknung im Vakuum erfolgen). Restliches Ethanol verhindert, das die DNA anschließend wieder gelöst werden kann! - Nehmen Sie das DNA-Pellet in 100 µl TE-Puffer (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 8,0) auf (Lösen durch kräftiges Schütteln) und überführen sie die Lösung in ein 1,5 ml-reaktionsgefäß

9 Konzentrationsbestimmung der Nucleinsäure Nucleinsäuren besitzen ein Absorptionsmaximum von 259 nm. Durch Messung der Extinktion bei dieser Wellenlänge kann die Konzentration einer Nucleinsäurelösung bestimmt werden. Um festzustellen, ob die Nucleinsäurepräparation mit Proteinen verunreinigt ist, kann zusätzlich die Extinktion bei 280 nm (ein Absorptionsmaximum von Proteinen) gemessen werden. Der Quotient der Extinktionen E 260nm /E 280nm beträgt für reine Nucleinsäuren 1,8. Ein Wert unter 1,7 weist auf eine Proteinverunreinigung hin. - Geben Sie in eine die Quarzküvette 1,98 ml dest. H 2 O und geben dazu 20 µl Ihrer Plasmid-DNA- Präparation - Als Referenz füllen Sie in eine zweite Küvette 2 ml dest. H 2 O - Messen Sie die Absorption der DNA-Lösung bei 260 nm (als Abgleich wird die H 2 O-Küvette verwendet) - Danach wird die Absorption bei 280 nm gemessen (dabei ist erneut ein Abgleich gegen H 2 O erforderlich) Auswertung Geben Sie die Konzentration Ihrer DNA-Präparation in µg/µl an Dabei ist folgende vereinfachte Formel heranzuziehen: C DNA = E 260 nm * 50 µg/ml * OD = 50 µg/ ml Verdünnungsfaktor in der Küvette (20 µl in 2 ml) Geben Sie Quotient E 260 /E 280 an und diskutieren Sie das Ergebnis in Bezug auf die Reinheit Ihrer DNA- Präparation Plasmid-Analyse mit Restriktionsenzymen Da Ihnen bisher unbekannt ist, welches Plasmid Sie durch Säulenchromatographie aufgereinigt haben, sollen Sie im abschließenden Teilexperiment bestimmen um welches Plasmid es sich dabei handelt. Dazu werden Ihnen zwei verschiedenen Restriktionsendonucleasen zur Verfügung gestellt. Durch Agarosegelelektrophorese werden die aus dem Restriktionsverdau resultierenden Fragmentgrößen festgestellt und durch Vergleich mit den nachfolgend angeführten Restriktionskarten die Identität des aufgereinigt Plasmids festgestellt. Im Praktikum wurden Ihnen Bakterien übergeben, die eines von den drei folgenden Plasmide enthielten:

10 Plasmid bp (pbi-luc) Plasmid bp (pbi-cl) Plasmid bp (ptm201) Plasmid bp (ptm 201) Xba I Restriktionsenzym Fragmentgrößen bp bp 277 bp Restriktionsenzym Fragmentgrößen bp bp 277 bp 27 bp Restriktionsenzym Restriktionsenzym Fragmentgrößen Fragmentgrößen bp bp bp bp bp bp bp 788 bp Zur Analyse erhalten Sie zwei Restriktionsendonucleasen : a) aus Xanthomonas badrii Erkennungssequenz: TCTAGA b) aus Haemophilus influenzae Erkennungssequenz: AAGCTT Versuchsablauf - Geben Sie mit der Mikroliterpipette jeweils 1 µg ihrer Plasmid-DNA in 2 1,5 ml-reaktionsgefäße (Beschriften Sie diese mit Ihrer Gruppennummer und mit dem entsprechenden Restriktionsenzym [ bzw. ]) Das 1 µg DNA entsprechende Volumen ergibt sich aus der vorangegangenen DNA- Konzentrationsbestimmung. - Ergänzen Sie mit dest. H 2 O das Volumen in den Reaktionsgefäßen auf 15 µl (µl H2O =15 µl x µl DNA) - Geben Sie nun 5 µl des entsprechenden Restriktionsenzyms zum jeweiligen Reaktionsansatz (nur jeweils ein Enzym in einen Ansatz) - Die Ansätze werden nun in einen Thermoheizblock gestellt und dort für 1 h bei 37 C inkubiert. - - Am Ende der Inkubationszeit werden die Ansätze aus dem Thermoblock entnommen und in jeden Ansatz 5 µl des Bromphenolblau-Puffers gegeben DAS ABSTOPPEN DER REAKTION UND ZUGABE DES PUFFERS WIRD DURCH EINEN ASSISTENTEN DURCHGEFÜHRT. DER VERSUCH WIRD AM NÄCHSTEN TAG FORTGESETZT!

11 Agarosegelelektrophorese Während der Inkubationszeit der Restriktionsansätze wird das Agarosegel gegossen, welches für die nachfolgende Elektrophorese eingesetzt wird. Das Gel hat eine Agarosekonzentration von 1%. Versuchsablauf Gießen des Agarosegels - Stellen Sie 40 ml eines 1 x TBE-Puffers her! Dazu wird Ihnen ein 10-fach konzentrierter Puffer gegeben (10 x TBE). ml 10 x TBE + ml a. dest - Es sollen insgesamt 40 ml Gellösung hergestellt werden: Dazu wiegen Sie g Agarose in einen 200 ml- Erlenmeyerkolben ein. - Geben Sie den Sie den 1 x TBE Puffer zur Agarose und vermischen Sie den Ansatz durch Umschwenken. - Die Suspension wird jetzt in der Mikrowelle so lange erhitzt (bis zum Siedepunkt), bis die Agarose vollständig gelöst/geschmolzen ist. Danach wird die Agarose auf ca. 45 C abgekühlt und in den Gel- Träger der Elektrophoresekammer gefüllt (Blasenbildung vermeiden). Die Höhe der Flüssigkeitsschicht soll 0,6 0,8 cm betragen. - Nach dem vollständigen Erstarren (ca. 15 min bei Raumtemperatur) wird das Gel in der Elektrophoresekammer mit 1 x TBE-Puffer vollständig überschichtet. Probenauftrag und - lauf DIE ELEKTROPHORESE FINDET AM FOLGETAG STATT! - Geben Sie vorsichtig mit der Mikroliterpipette jeweils die 23 µl eines Restriktionsansatzes in eine Geltasche - Vom Assistenten wird zusätzlich ein Molekulargewichtsmarker aufgetragen - Durch Anlegen einer Spannung (100 V) wird die Elektrophorese gestartet und beendet, wenn die Elektrophoresefront (sichtbar am Bromphenolblau) ca. 10 cm im Gel passiert hat (Das Netzgerät wird vom Assistenten bedient) - Nach der Elektrophorese wird das Gel in ein Ethidiumbromidbad eingelegt und dort für 30 min inkubiert (Ethidiumbromid ist eine hochmutagene Substanz, alle Arbeiten mit Ethidiumbromid werden vom Assistenten durchgeführt!) - Zum Abschluß wird das Gel auf einen UV-Leuchtschirm (302 nm) aufgelegt und mit einem digitalen Videoimaging-System dokumentiert Auswertung Stellen Sie näherungsweise anhand der Gelphotographie die aus den Restriktionsverdauen resultierenden Fragmentgrößen ihres Plasmides fest, indem Sie die Wanderungsstrecke der erhaltenen Fragmente mit den Markerfragmenten vergleichen.

12 Dazu wurde parallel ein DNA-Größenmarker auf das Gel aufgetragen, der die folgenden Fragmente bekannter Größe enthält: (siehe auch Abbildung Lamda-DNA unten) bp bp bp bp bp 947 bp bp bp 831 bp bp bp 564 bp Lambda DNA + bp Geben Sie an, welches der drei Plasmide Sie aufgereinigt haben. Nutzen Sie dabei die oben aufgeführten Restriktionskkarten und die Abbildung des Markers unten! Die DNA des E. coli Bakteriophagen Lambda hat eine Größe von bp. Nach einem Verdau mit den Restriktionsenzymen und ergibt sich das nachfolgende elektrophoretische Bild (identisch mit dem Praktikumsversuch eingesetzten Größenmarker). Für den Verdau wurden insgesamt 1 µg Lambda-DNA eingesetzt. Geben Sie die jeweilige Einzelmasse der aus diesem Verdau erhaltenen 12 Fragmente (in Nanogramm) an. Schätzen Sie durch den Vergleich der Fluoreszenz-Intensitäten der Markerbanden und der Banden Ihrer Plasmidpräparation die Masse Ihrer Plasmid-DNA auf dem Gel ab.

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