Institut für Toxikologie und Genetik

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1 Forschungszentrum Karlsruhe in der Helmholtz-Gemeinschaft Wissenschaftliche Berichte FZKA 7038 Ergebnisbericht über Forschung und Entwicklung 2003 Institut für Toxikologie und Genetik

2 Als Manuskript vervielfältigt. Für diesen Bericht behalten wir uns alle Rechte vor. Forschungszentrum Karlsruhe GmbH Postfach 3640, Karlsruhe ISSN ISSN

3 Institut für Toxikologie und Genetik Leitung: Prof. Dr. Peter Herrlich und Prof. Dr. Uwe Strähle Institutsbeschreibung Seit vielen Jahren werden am Institut für Toxikologie und Genetik physiologische Prozesse und deren Störung durch genetische Ursachen und toxische Agenzien studiert. Durch die Komplementarität des Forschungsansatzes zwischen genetischer Konstitution des Organismus und Störung durch Umwelteinflüsse trägt das ITG einen wesentlichen Teil zum Gesundheitsforschungsbereich der HGF in den Programmen Umweltbedingte Störungen der Gesundheit, und Vergleichende Genomanalyse bei. Von diesem Ansatz werden wesentliche Erkenntnisse über Mechanismen der Entstehung von Krankheiten erwartet, da Zellen bei der Entstehung von Krankheiten selten grundsätzlich neue Eigenschaften entwickeln, sondern oft fehlerhaft solche Programme ausführen, die in anderen Phasen des Lebens des Organismus, wie der Embryonalentwicklung, korrekt waren. Toxische Stoffe, die sowohl in der Umwelt als auch in der technischen Produktion von Bedeutung sind, können bereits in sehr niedrigen Konzentrationen in die Steuerung genetischer Programme eingreifen und tiefgreifende Störungen verursachen. Programm Umweltbedingte Störungen der Gesundheit : Inter- und intrazelluläre Signaltransduktion als Determinanten von Entwicklung und Homöstase eines Organismus Die Aktivierung von genetischen Programmen setzt voraus, dass Zellen aus der Umgebung Instruktionen erhalten, die über intrazelluläre Signalwege an die Maschinerie weitergeleitet werden, die die Umsetzung der in den Genen definierten Programme zunächst in Botenmoleküle, die sog. messenger-rna, und dann in die ausführenden Moleküle, die Proteine, steuert. Resultate der Aktivierung der genetischen Programme sind Änderungen des zellulären Verhaltens. Ziele der hier zusammengefassten Vorhaben sind die Analyse ausgewählter intrazellulärer Signalwege und des Wechselspiels zwischen ihnen sowie die Analyse der Kommunikation zwischen Zellen während der Embryonalentwicklung und im erwachsenen Organismus. Schwerpunktthemen sind dabei: Klärung der Mechanismen, mit denen Mitglieder der Rel/NF-κB Familie von Transkriptionsfaktoren die Expression von Genen steuern, die in die Entwicklung des lymphatischen Systems und in die Immunantwort involviert sind. Identifikation der molekularen Mechanismen, mit denen Glukokortikoide, vermittelt durch den Glukokortikoid-Rezeptor, aktivierende oder hemmende Einflüsse auf die Expression von Genen ausüben. Untersuchung der Funktionen, mit denen Mitglieder der CD44-Proteinfamilie Proliferation und Kontaktinhibition, metastatisches Verhalten oder Tumorsuppression vermitteln. Erforschung der Regulation des alternativen Spleißens der pre-messenger RNA am Modell von CD44. Entwicklung biologischer Sonden und Effektormoleküle zur Erkennung und Bekämpfung von Metastasen, Charakterisierung neuer, Metastasen-spezifischer Genprodukte, Untersuchung der Vorgänge, die zur Anbindung eines Tumors an das Gefäßsystem des Organismus führen (Angiogenese). Verständnis der Koordination von Zell-Migration und Aktivierung am Beispiel der Lymphozyten. Untersuchung der Mechanismen glukocorticoidabhängiger Suppression allergischer Reaktionen und des Androgen-unabhängigen Wachstums von Prostata-Karzinomen. Klärung der Vorgänge bei der Umsetzung genetischer Programme während der sehr frühen Embryonalentwicklung, in der Zygote im Zebrafisch. Identifikation von Genen, deren Expression sich in Abhängigkeit vom Ernährungszustand ändert, mithilfe von DNA-Mikroarrays. Programm Umweltbedingte Störungen der Gesundheit : Reaktionen auf DNA-Schäden Ziel ist es, zu verstehen, wie DNA-Schäden in der Zelle erkannt und wie diese Erkenntnisse weitergeleitet werden, um dann zur Reparatur des Schadens oder zur Beseitigung der geschädigten Zelle zu führen. Eine zentrale Rolle hierbei spielt das Tumorsuppressorprotein p53, dessen Regulation und Funktionen untersucht werden. Programm Umweltbedingte Störungen der Gesundheit : Redox-Gleichgewicht und inflammatorische Reaktion Ziele in diesem Themenbereich sind zum einen die Klärung des Mechanismus, wie Organometallverbindungen Apoptose in immunkompetenten Zellen auslösen, und zum anderen die Testung synthetischer Lipide auf ihre Eignung als Antitumor-Mittel. 1

4 Programm Umweltbedingte Störungen der Gesundheit : Aerosole Hier wird die Modulation immunologischer Parameter durch Nanopartikel untersucht, wie sie z.b. bei Verbrennungsprozessen frei gesetzt werden. Programm Umweltbedingte Störungen der Gesundheit : Chemikalien Ziel ist die Untersuchung der Wirkmechanismen von (poly)bromierten aromatischen Verbindungen (Flammschutzmittel) auf zelluläre Funktionen und Strukturen. Programm Vergleichende Genomforschung : Funktionelle Proteinnetzwerke Die meisten Prozesse in einer Zelle benötigen eine größere Anzahl von Proteinen, die entweder als Multiproteinkomplexe organisiert sind oder sukzessive miteinander interagieren. Die Aufschlüsselung dieser Proteinnetzwerke ist daher ein wichtiger Schritt, zelluläre Prozesse molekular zu verstehen. Wir benutzen zwei verschiedene genetische Verfahren, um Proteininteraktionen in der Zelle zu charakterisieren. In einem ersten Schwerpunkt werden durch das Two-Hybrid Verfahren die Wechselwirkungen ausgesuchter Domänen in der Zelle kartiert. In einem zweiten Schwerpunkt wird die Split-Ubiquitin Methode ( split-ub ) benutzt, um die Interaktionen von Membranproteinen detailliert zu untersuchen. 2

5 FORSCHUNGSERGEBNISSE IM JAHR 2003 Programm BIOMED: Biomedizinische Forschung Umweltbedingte Störungen der Gesundheit: Inter- und intrazelluläre Signaltransduktion Regulation der Entwicklung lymphoider Organe und von T-Lymphozyten durch die Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren Während sekundäre lymphoide Organe wie z.b. Milz, Lymphknoten und die Peyerschen Plaques für die Vermittlung adaptiver Immunantworten gegen Pathogene benötigt werden, sind primäre lymphoide Organe wie z.b. Thymus und Knochenmark vor allem für die Reifung von Lymphozyten zuständig. Die Rel/NF-κB Familie von Transkriptionsfaktoren spielt eine bedeutende Rolle bei der Expression von Genen, die in Immunantworten und Entzündungsreaktionen sowie im programmierten Zelltod (Apoptose) involviert sind. Durch gezielte Mutagenese haben wir einzelne Mitglieder dieser Familie in der Maus zerstört. Weiterhin wurde die Aktivierung des NF-κB Signalübertragungsweges durch die Überexpression eines spezifischen Inhibitors (miκbα) in T-Lymphozyten transgener Mäuse blockiert. Im vergangenen Jahr haben wir uns hauptsächlich mit der Rolle der NF-κB Transkriptionsfaktoren im Thymus und insbesondere bei der Entwicklung von Natürlichen Killer-T-Zellen (NKT-Zellen) beschäftigt. NKT-Zellen repräsentieren eine kleine aber wichtige Population (ca. 0.5%) der T-Zellen im Thymus. Sie sind in verschiedenen Immunreaktionen relevant, die von der Unterdrückung von Autoimmunerkrankungen bis hin zur Abstoßung von Tumoren reichen. Sie zeichnen sich vor allem durch die schnelle Produktion von immunstimulatorischen Zytokinen wie Interferon-γ und Interleukin-4 aus. Thymusabhängige NKT- Vorläuferzellen werden durch das Oberflächenmolekül CD1d, welches mit dem Haupthistokompatibilitäts- Komplex (MHC) der Klasse I verwandt ist, zur weiteren Reifung angeregt (positive Selektion). Der genaue Mechanismus und die weiteren molekularen Ereignisse waren allerdings bislang weitgehend unbekannt. Wir konnten zeigen, dass unterschiedliche Rel/NF-κB Familienmitglieder zum einen in hämatopoetischen, zum andern aber auch in nicht-hämatopoetischen (stromalen) Zellen des Thymus für die normale Reifung von NKT-Zellen benötigt werden. Durch reziproke Transferexperimente von Knochenmarkszellen aus verschiedenen transgenen und knockout Mauslinien konnten wir nachweisen, dass der klassische, von IκBα regulierte, NF-κB Signalübertragungsweg zellautonom den Übergang von NK1.1-negativen Vorläuferzellen zu reifen NK1.1-positiven NKT-Zellen steuert. Das Rel/NF-κB Familienmitglied RelB hingegen spielt eine wichtige Rolle in strahlungsresistenten stromalen Zellen des Thymus. Nach Aktivierung durch die NF-κB-induzierende Kinase (NIK) reguliert RelB über den kürzlich von uns beschriebenen alternativen NF-κB Signalübertragungsweg die Generierung von frühen NK1.1-negativen NKT-Vorläuferzellen (siehe Abbildung). In den untersuchten Mäusen ist die Entwicklung und Differenzierung normaler T-Lymphozyten nicht gestört, was eine exquisite Abhängigkeit der NKT- Zellentwicklung von NF-κB nahe legt. Weitere Untersuchungen beschäftigen sich mit den Zielmolekülen, die von den beiden NF-κB Aktivierungswegen reguliert werden und die Reifung der NKT-Zellen so nachhaltig beeinflussen. Positive Selektion Expansion n HSA hi CD4 + CD8 + HSA lo CD4 + /DN CD44 lo NK HSA lo CD4 + /DN CD44 hi NK HSA lo CD4 + /DN CD44 hi NK relb -/- miκbα tg Stromaler Defekt Defekt) Zellautonomer Defekt Defekt Abbildung: Modell der NF-κB-regulierten NKT-Zellentwicklung im Thymus. Der Verlust von RelB (relb -/- ) in stromalen Zellen führt zur verminderten Generierung von CD44 lo NK NKT-Vorläuferzellen. Die Blockierung von NF-κB in Vorläuferzellen (miκbα tg ) führt zur verminderten Expansion von NKT-Zellen (vorwiegend am Übergang vom NK zum NK Differenzierungsstadium). Mechanismen der Repression von Transkription durch Glukokortikoide: 3

6 Glukokortikoide finden aufgrund ihrer entzündungshemmenden Wirkung eine breite therapeutische Anwendung. Allerdings sind sie nicht frei von unerwünschten Nebenwirkungen. Die Wirkung von Glukokortikoiden wird in der Zelle durch den Glukokortikoidrezeptor (GR) vermittelt, der die Expression von Genen in verschiedenster Weise beeinflussen kann. Einer dieser Mechanismen beruht auf der Repression der Aktivität anderer Transkriptionsfaktoren wie AP-1 und NF-κB, welche für die Synthese immunregulatorischer Proteine zuständig sind. Wir isolierten Trip6 als ein neues GR-bindendes Protein, das an der Transrepression beteiligt ist. Trip6 enthält Lim-Domänen, Oberflächenmodule, die Protein- Protein-Wechselwirkungen vermitteln. Es gehört zu einer Protein-Familie, die am Aufbau von Kontaktstellen mit der extrazellulären Matrix und/oder anderen Zellen beteiligt ist und vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist. Wir konnten zeigen, dass verschiedene Trip6 Isoformen existieren, von denen eine ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist. Unsere Experimente zeigen, dass im Zellkern lokalisiertes Trip6 sowohl mit dem GR, als auch mit AP-1 und NF-κB interagiert und für die Transrepression benötigt wird. Ein interessanter Aspekt ergab sich aus dem Nachweis, dass Trip6 auch für die Aktivierung von AP-1 und NF-κB benötigt wird. Wir nehmen an, dass Trip6 am Promotor von Zielgenen als molekulare Plattform funktioniert, die das Zusammenspiel von aktivierenden und reprimierenden Signalen ermöglicht, indem es entweder Koaktivatoren oder potentielle Repressoren an den GR rekrutiert. Abbildung: Der Einfluss von Trip6 in die Aktivierung und Repression von Zielgenen Nach einem entzündungsauslösenden Impuls erreichen intrazelluläre Signale den Zellkern und aktivieren die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-κB. Diese Faktoren rekrutieren Trip6, welches die Transkription von Genen aktiviert, deren Proteine in die Enzündungsreaktion involviert sind. In Anwesenheit von Glukokortikoiden (rechtes Schaubild) wird der Glukokortikoidrezeptor (GR) aktiviert, bindet an Trip6 und blockiert die Aktivierung der Transkription. Analyse der transaktivierenden Funktion des Androgenrezeptors: Unsere Arbeit des letzten Jahres hat sich hauptsächlich mit der transaktivierenden Funktion des menschlichen Androgenrezeptors (AR) beschäftigt, einem Protein, das die Wirkung der männlichen Geschlechtshormone, der sog. Androgene, vermittelt. Androgene wie z.b. Testosteron spielen eine bedeutende Rolle im Verlauf des Prostata-Karzinoms. Im fortgeschrittenen Stadium wird dieses mit Medikamenten behandelt, die entweder die Serumkonzentration von Testosteron reduzieren oder die Wirkung des AR hemmen. Diese Behandlung ist zunächst sehr effektiv, führt aber nach längerer Anwendung zu Medikamenten-Resistenz. Dabei spielt immer die veränderte oder gestörte Signaltransduktion durch den AR eine Rolle. In einer kürzlich veröffentlichten Studie über die Analyse der Genexpression wurde der Anstieg der AR-Menge während des Verlaufs eines Prostata-Karzinoms gezeigt. Bereits ein Anstieg um das 3-5 fache genügt, um die Wirkung des AR unter Bedingungen des Androgenentzugs zu verstärken. Daraus wird deutlich, wie wichtig das Verständnis der Mechanismen der AR-Aktivität für therapeutische Strategien ist. Der AR ist ein Transkriptionsfaktor mit einer zentralen DNA-bindenden Domäne, einer C-terminalen Liganden-bindenden Domäne sowie einer aminoterminalen transaktivierenden Domäne. In Abwesenheit des Liganden befindet sich der Rezeptor im Komplex mit weiteren Proteinen im Zytoplasma. Nach Bindung des Androgens wird er in den Kern transportiert und bindet dort an definierte Bereiche der Promotorregion spezifischer Gene, welche daraufhin vermehrt transkribiert werden. Diese Funktion des AR wird durch weitere regulierende Proteine modifiziert, die an die C- oder N-terminalen Domänen des Rezeptors binden. Ein Anstieg in der Rezeptormenge ermöglicht somit die Aktivierung von AR-regulierten Genen auch bei niedrigen Konzentrationen des Liganden oder zusätzlicher regulierender Proteine. In unseren Studien zur Aktivität des AR haben wir ein Protein namens BAG-1L identifiziert, welches die transaktivierende Funktion des Rezeptors verstärkt. Diese unterstützende Wirkung von BAG-1L wird durch Antiandrogene nicht aufgehoben und ist deshalb ein bedeutender Faktor in der Entstehung und dem Verlauf des Androgen-unabhängigen Prostata-Karzinoms. Detaillierte Analyse der AR-Aktivierung durch BAG-1L zeigte, dass es sowohl die N- als auch die C-terminale Region des AR bindet und damit ein überbrückendes Molekül darstellt, welches die intramolekulare Faltung des AR unterstützt und damit die durch ihn vermittelte Transaktivierung ermöglicht (siehe Abbildung). BAG-1L benötigt hierfür ein weiteres Protein, Hsp70. 4

7 Um herauszufinden, wie diese Proteine bei der Modulation der AR-Aktivität zusammenwirken, haben wir die Expression von BAG-1L und Hsp70 in benignem Prostatagewebe und Biopsien von Prostata- Karzinomen untersucht. Dabei stellten wir fest, dass sich zwar die Menge von BAG-1L und Hsp70 in in der Entwicklung zu immer aggressiveren (fortschreitenden) Tumoren nicht veränderte, die beiden Proteine jedoch in benignem Gewebe in den basalen Zellen exprimiert werden, im Tumorgewebe dagegen im sekretorischen Epithel, ebenso wie der AR. Die Frage nach der Ursache für die Veränderung dieses Expressionsmusters während der Tumorprogression, ist die Schlüsselfrage, deren Beantwortung es uns ermöglichen wird, die verstärkende Wirkung von BAG-1L in der transaktivierenden Funktion des AR zu verhindern. Abbildung: Schematische Darstellung der mit Hsp70 bzw. dem Androgenrezeptor interagierenden Domänen von Bag-1L. Die Rolle von CD44-Proteinen in der Wachstumssteuerung von Zellen Oberflächenproteine der CD44-Familie spielen für die Wachstumssteuerung von Zellen eine zentrale Rolle. Sie wirken einerseits als Ko-Rezeptoren von Wachstumsfaktorrezeptoren wie Met oder Rezeptoren der EGFR-Familie, andererseits binden sie Komponenten des Bindegewebes, bevorzugt Hyaluronsäure (HA) und führen dadurch zur Kontaktinhibierung, also einem Proliferationsstopp von Zellen. Für beide Aktionsmechanismen sind Mitglieder der MERM -Familie essentiell. MERM ist die Abkürzung für Merlin, Ezrin, Radixin, Moesin, die gleichzeitg vier der wichtigsten Vertreter darstellen. Die Ko-Rezeptorfunktion wird insbesondere durch Ezrin (und auch Moesin und Radixin) vermittelt; für die Kontaktinhibition ist Merlin das entscheidende Protein. Die Aktivität der MERM-Proteine wird über deren Phosphorylierungszustand reguliert. Ezrin ist aktiv, wenn es phosphoryliert ist, Merlin dagegen ist als dephosphoryliertes Protein aktiv. Da der Phosphorylierungszustand der MERM-Proteine konzertant durch Kinasen und Phosphatasen reguliert wird, bedeutet dies, dass entweder ERM-Proteine aktiv sind oder Merlin aktiv ist, nicht aber beide gleichzeitig. Bestimmt wird der Aktivitätszustand durch die Umgebung der Zelle: Sind Wachstumsfaktoren im Übergewicht, wirkt CD44 als Korezeptor und ERM-Proteine werden aktiv, ist HA im Übergewicht, werden die MERM-Proteine dephosphoryliert und Merlin ist aktiv. Die MERM-Proteine erfüllen ihre Funktion durch Bindung an den zytoplasmatischen Teil des CD44- Proteins. Da diese Bindung und damit die Aktivität der Zelle sehr präzise reguliert werden muss, haben wir vermutet, dass Komplexe aus CD44- und MERM-Proteinen noch weitere Komponenten enthalten sollten. Durch Immunopräzipitation von CD44 haben wir versucht, solche Komponenten zu identifizieren. Wir haben uns zunächst auf den kontaktinhibierten Zustand von Zellen konzentriert, also den Zustand bei dem HA an den extrazellulären Teil von CD44 bindet und Merlin am zytoplasmatischen Teil lokalisiert ist. Zur Spezifitätskontrolle haben wir Zellen verwendet, die kein CD44 exprimieren und haben diese Zellen mit Wildtyp-CD44 (CD44wt) oder einer CD44-Mutante, an die Merlin nicht binden kann (CD44m), transfiziert. Alle transfizierten Zellen binden HA, aber nur CD44wt Zellen aktivieren Merlin und enthalten Merlin gebunden an CD44. Nach Immunpräzipitation von CD44 in Lysaten HA-behandelter Zellen finden wir in CD44wt-Zellen vier zusätzliche Proteine, die in Immunpräzipitaten von CD44 in Zellen nicht nachweisbar sind. Zwei dieser Proteine wurden als Importine identifiziert. Dies war ein sehr überraschender Befund, denn die Funktion der Importine ist der Transport von Proteinen aus dem Zytoplasma in den Zellkern, gilt also für Proteine, die im Zellkern ihre Funktion ausüben CD44 ist aber ein Transmembranprotein, das noch nie im Zellkern nachgewiesen wurde. Wie viele Transmembranproteine werden auch CD44-Proteine proteolytisch gespalten, wodurch sowohl die extrazelluläre Domäne als auch die zytoplasmatische Domäne (ICD) freigesetzt werden. Die CD44 ICD (intracellular domain) kann von Importinen in den Zellkern transportiert werden, nicht aber wenn CD44 mutiert wurde (CD44m). Die mutierte Stelle im Protein stört also gleichzeitig die Bindung von Merlin wie auch von Importin. Die Mutation in CD44 bewirkt auch, dass nur wenig CD44 ICDm produziert wird. 5

8 Was ist nun die Funktion der CD44 ICDs im Zellkern? Die naheliegendste Annahme ist, dass sie direkt oder indirekt die Expression von Genen beeinflussen. Um dies zu messen, wurden Expressionsprofile von Zellen, die ICDs im Kern tragen, mit Expressionsprofilen von Zellen mit mutierten ICDs verglichen. Eine Reihe von überexprimierten und reprimierten Genen wurde identifiziert, ein Befund, der CD44 ICDs als genregulatorische Proteine definiert. Interessanterweise sind einige überexprimierte Gene an der Repression der Zellteilung beteiligt. Alle unsere Ergebnisse zeigen, dass die Importine, die an zytoplasmatische Sequenzen der Transmembranproteine CD44 binden, am Kerntransport der nach proteolytischer Spaltung entstandenen CD44 ICDs beteiligt sein können. Im Kern aktivieren und reprimieren CD44 ICDs Gene, unter denen sich auch solche finden, die die Zellvermehrung unterdrücken. Auf diese Art können die Importine einen Beitrag zur Kontaktinhibition von Zellen leisten. Zelluläre Wachstumskontrolle durch Merlin, Ezrin und CD44 Das Neurofibromatose-2 (NF2) Gen kodiert für Merlin, ein mit Ezrin verwandtes Protein, welches als Tumorsuppressor fungiert. Der Aminoterminus von Merlin und Ezrin kann mit verschiedenen Transmembranproteinen wie dem ubiquitär vorhandenen Glykoprotein CD44 interagieren. Im Gegensatz dazu besitzt nur der C-Terminus des Ezrin-Proteins die Eigenschaft, an F-Aktin binden zu können, wodurch Transmembranproteine mit dem kortikalen Aktinzytoskelett verbunden werden. In vorangegangenen Studien konnten wir zeigen, daß CD44, Merlin und Ezrin Teil eines molekularen Schalters sind, der das Wachstum von Zellen reguliert. Ezrin interagiert bei geringer Zelldichte mit CD44 und fördert das Wachstum, wogegen Merlin durch erhöhte Zelldichte aktiviert wird, daraufhin an CD44 bindet und das Wachstum inhibiert. Wir haben nun untersucht, welcher molekulare Schritt durch den Ezrin-Merlin-Schalter beeinflusst wird. Aktiviertes Merlin interferiert mit verschiedenen Wachstumsfaktor-induzierten Signaltransduktionswegen, indem die Aktivierung und Funktion des Ras-Proteins blockiert wird. Die Funktion von Merlin zeigt Spezifität, derart, dass zum Beispiel der JAK-STAT Signalweg oder Phorbolester-induzierte Signaltransduktion nicht unterbunden werden. Ezrin ist dagegen bei geringer Zelldichte für den Signaltransfer vom Wachstumsfaktor nach Ras notwendig. Wir konnten zeigen, dass für die Ras-Aktivierung eine intakte Ezrin-F-Aktin-Verbindung essentiell ist, wodurch der Ras-Aktivator Sos in räumliche Nähe zu Ras gebracht wird. Dominant-negative Ezrin- Mutanten scheinen die Merlin-Funktion zu imitieren. Eine dieser Mutanten enthält einen Aminosäure- Austausch, der zum Verlust der Interaktion von Ezrin mit F-Aktin führt. Merlin, welches ebenfalls keine Verbindung zum F-Aktin herstellen kann, stört gleichermaßen den Aufbau der Mikroumgebung, die für die Aktivierung von Ras durch Sos notwendig ist. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen Aspekt der durch Wachstumsfaktoren aktivierten Signaltransduktion auf, der dem kortikalen Aktinzytoskelett eine essentielle Rolle in der Aktivierung von Ras zuweisen. Abbildung: Zelluläre Wachstumskontrolle durch Merlin, Ezrin und CD44 Niedermolekulare Hyaluronsäure induziert MMPs. Wird ein Tumor chirurgisch entfernt, werden immer die lokalen Lymphknoten mituntersucht und eventuell entfernt. Fast alle menschlichen Krebsarten starten den Prozess der Metastasierung (der Bildung von Absiedlungen) über die Lymphbahnen. Die Krebszellen bilden in den Lymphknoten die ersten Absiedlungen, sie vermehren sich dort. Sie müssen deshalb zumindest teilweise Ähnlichkeit mit den Zellen aufweisen, die normalerweise über die Lymphgefässe transportiert werden: Lymphozyten, Macrophagen, dendritische Zellen. Die extrazelluläre Substanz Hyaluronsäure, eine für das Leben entscheidende Komponente, wird wie alles im Körper auch wieder abgebaut. Der Abbau von Hyaluronsäure ist während entzündlicher Reaktionen und in Tumoren erhöht. Die Abbaufragmente werden über die Lymphflüssigkeit 6

9 abtransportiert. Deren Konzentration ist deshalb in den Lymphbahnen besonders hoch. Abbaufragmente von Hyaluronsäure stimulieren dendritische Zellen, so dass diese durch die Gewebe bis in die Lymphbahnen wandern und dann zu den Lymphknoten transportiert werden. Eine ähnliche Reaktion in Krebszellen wurde am ITG entdeckt. Wir fanden unter anderem, dass die Abbaufragmente, nicht aber die hochmolekulare Hyaluronsäure, durch die Aktivierung eines speziellen Transkriptionfaktors, NF-κB, Programme der Genexpression beeinflussen. Beispielsweise werden unter dem Einfluß der Hyaluronsäure-Fragmente Metalloproteasen synthetisiert. Der Rolle der Abbauprodukte für die Krebszellen könnte zum einen darin bestehen, dass Metalloproteasen Barrieren entfernen, die einer Wanderung der Zellen entgegenstehen, andererseits könnten die Metalloproteasen Faktoren von Zellen abspalten, welche für Wachstum und Wanderung wichtig sind. Regulation von prä-mrna-spleißen durch physiologische und pathologische Signale Die Entwicklung der hohen biologischen Komplexität des Menschen basierend auf einer relativ kleinen Zahl von Genen nur circa doppelt so viele wie bei einem einfachen Fadenwurm wird hauptsächlich durch zelluläre Mechanismen erklärt, über die aus einem einzigen Gen verschiedene Proteine hergestellt werden können. Der weitaus häufigste dieser Mechanismen ist alternatives prä-mrna-spleißen. Während der Reifung eines Vorläufer-Botenmoleküls (prä-mrna) zum funktionellen Botenmolekül (mrna) müssen nicht-kodierende Bereiche (Introns) herausgeschnitten werden und kodierende Abschnitte (Exons) zusammengefügt werden. Man bezeichnet dies als Spleißen. Exons können dabei in unterschiedlicher Weise miteinander kombiniert werden (alternatives Spleißen), so dass aus einem Gen bzw. Vorläufer- Botenmolekül unterschiedliche mrnas und Proteine hergestellt werden können. Damit Spleißvarianten in den richtigen Zellen zur richtigen Zeit hergestellt werden können, müssen Zellen Signale (z.b. Wachstumsfaktoren oder entwicklungssteuernde Substanzen) aus ihrer Umgebung detektieren und über zelluläre Signalwege die Spleißmaschinerie entsprechend instruieren. Die Fehlregulation von alternativem Spleißen kann zur Entstehung menschlicher Krankheiten, wie neurodegenerativen Erkrankungen oder Krebs führen. Nachdem es uns gelang, ein erstes Spleißregulatorprotein (Sam68) zu identifizieren, das über einen onkogenen zellulären Signalübertragungsweg - die Ras-MAP-Kinase-Kaskade phopsphoryliert wird, haben wir damit begonnen, den Mechanismus zu untersuchen über den die signal-induzierte Phosphorylierung des Sam68-Proteins die Spleißmaschinerie (Spleißosom) steuern kann. Dabei entdeckten wir, dass Sam68 mit einer Komponente des Spleißosoms, dem U2AF-Protein, interagiert. U2AF ist ein essentielles zelluläres Eiweiss, das gebraucht wird, um den Zusammenbau des Spleißosoms an Intron-Exon-Grenzen zu initiieren. Erste Befunde deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen beiden Proteinen durch die Phosphorylierung von Sam68 beeinflußt wird. Ausserdem fanden wir, dass U2AF selbst in signal-abhängiger Weise modifiziert wird. Es stellt damit eine erste Spleißosom- Komponente dar, die an extrazelluläre Signalwege gekoppelt ist. Die Modifikation eines essentiellen Spleißosombestandteils durch onkogene Signale könnte dessen Interaktion mit bestimmten Introns/Exons regulieren und so zur Produktion von Spleißvarianten führe, die an Tumorentstehung oder -progression beteiligt sind. Regulation von Aktivierungsschwellen in T-Lymphozyten durch Chemokine: Zellmigration ist ein essentieller Vorgang in allen vielzelligen Organismen, der sowohl in normalen, z.b. bei der Immunüberwachung, als auch in pathologischen Situationen, wie bei der Tumormetastasierung, eine Rolle spielt. Migrierende Lymphozyten und metastasierende Tumorzellen nutzen häufig dieselben Proteinsysteme, um zu ihrem Bestimmungsort zu finden, z.b. den Chemokin-Rezeptor CXCR4, der Gradienten des Lockstoffs SDF-1α wahrnimmt. Doch während die Proliferation von Lymphozyten räumlich und örtlich strikt kontrolliert ist, proliferieren maligne Zellen ungehindert. Unser Ziel ist es, Gemeinsamkeiten, aber insbesondere die Unterschiede zwischen Lymphozyten und Tumorzellen bezüglich der Koordination von Migration und Aktivierung zu untersuchen. Unsere Daten belegen, dass Lymphozyten während der Migration Schwellenwerte für die Aktivierung heraufsetzen. SDF-1α, ein Chemokin, das sowohl in T-Zellen, als auch in Tumorzellen Migration und Gewebsinvasion induziert, hemmt in T-Zellen nach Bindung an seinen Rezeptor CXCR4 die Aktivierung eines zentralen onkogenen Signaltransduktionswegs, der Ras-Erk MAP Kinase Kaskade. In Funktionsgewinnexperimenten konnten wir zeigen, dass dies durch die kleine GTPase RhoA vermittelt wird, einen Schlüssel-Regulator des Zytoskeletts, der Motilität in Abhängigkeit von extrazellulären Stimuli vermittelt. Unsere Befunde sprechen in hohem Maße dafür, dass in T-Zellen die Aktivierungsschwelle eines hochkonservierten Signalwegs, des Ras-Erk-Signalwegs, über den Aktivitätszustand der kleinen GTPase RhoA reguliert wird, eng gekoppelt an das Signal- und Effektorsystem für Motilität/Migration. Charakterisierung des Hyperforin-Derivats Aristoforin, eines potentiellen Anti-Krebs Medikaments: Hyperforin ist ein natürliches Antibiotikum aus Johanniskraut (Hypericum perforatum). Wir haben gezeigt, dass Hyperforin neben seiner antibiotischen und antidepressiven Wirksamkeit auch die Eigenschaft besitzt, 7

10 bei verschiedenen Tumorzelllinien in vitro Apoptose zu induzieren. Zudem hemmt Hyperforin das Wachstum des MT-450 Mammakarzinoms in immunkompetenten Wistar-Ratten in vivo. Die Wirksamkeit von Hyperforin in vivo ist der von Paclitaxel (Taxol) vergleichbar, ohne dabei jegliche Anzeichen von akuter Toxizität zu zeigen. Hyperforin und semisynthetische Derivate des Naturstoffs sind somit vielversprechende Kandidaten für die Therapie neoplastischer Krankheiten. O O O O Abbildung: Strukturformel von Hyperforin Die schlechte Löslichkeit von Hyperforin in wässrigem Medium bedeutet aber, dass die Anwendung und Bioverfügbarkeit von Hyperforin als Therapeutikum begrenzt ist. Zudem ist der Reinstoff Hyperforin sehr empfindlich gegenüber Licht und Sauerstoff. Ohne Zugabe geeigneter Stabilisatoren verliert Hyperforin schnell an Aktivität. Durch die Überführung in geeignete Salze kann die Verbindung gegenüber diesen Einflüssen stabilisiert werden, obwohl damit zu rechnen ist, dass diese Salze im Körper nicht stabil sind. Um die Probleme, die mit der Anwendung von Hyperforin als Therapeutikum verbunden sind zu lösen, haben wir neue Hyperforin-Derivate hergestellt, die eine verbesserte Löslichkeit, Stabilität und Bioaktivität haben. In Zusammenarbeit mit Professor Athanassios Giannis (Universität Leipzig) haben wir ein Hyperforin-Derivat hergestellt, das Aristoforin genannt wird. Gegenüber Hyperforin hat Aristoforin eine verbesserte Stabilität. Es gibt sogar fast keine Veränderung dieses Derivats nach längerer Exposition mit Sauerstoff und Licht. Gegenüber Hyperforin hat Aristoforin eine verbesserte Bioaktivität. Im Vergleich mit Hyperforin hemmt das Derivat die Proliferation und induziert die Apoptose von MT-450 Mammakarzinom- Zellen in niedrigeren Konzentrationen. Wichtiger, Aristoforin ist auch im Tierversuch sehr effektiv in der Hemmung des Tumor-Wachstums. Momentan erforschen wir, ob Aristoforin für Anti-Krebs-Studien beim Menschen geeignet ist. Rolle von basalen Transkriptionsfaktoren in der frühen Embryonalentwicklung: Das TATA bindende Protein (TBP) spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der Transkription aller RNA Polymerasen. TBP bindet oft als Bestandteil großer Multi-Protein Komplexe an den Core Promotor und es wurde bisher angenommen, dass es der einzige Faktor sei, der die Initiation der Transkription durch die RNA Polymerase II (Pol II) einleiten kann. Ein weiterer dem TBP ähnlicher Faktor (TLF/TRF2/TRP/TLP), der möglicherweise eine Rolle in der Regulation der Transkription während der Entwicklung spielt, wurde vor kurzem in Wirbeltieren beschrieben. Unlängst haben wir ein neues, für Wirbeltiere spezifisches Mitglied der TBP Proteinfamilie, das wir TBP2 nannten, aus Zebrafisch und anderen Wirbeltieren isoliert. Die N- terminalen Domänen von TBP2 unterscheiden sich untereinander und sind auch von denen des TBP verschieden. Dennoch sind die Zentraldomänen der TBP2 Proteine nahezu identisch (~90%) mit denen des TBP. In Übereinstimmung damit bindet TBP2 an die TATA Box, interagiert mit TFIIA und TFIIB und kann ebenso wie TBP die Initiation der PolII Transkription vermitteln. TBP2 mrna und Protein zeigen aber entgegengesetzte Expressionsmuster in den Gonaden während der Embryonalentwicklung im Vergleich zu TBP, was auf unterschiedliche Funktionen während der Entwicklung der Gonaden hindeutet. Knock down Experimente von TBP2 durch die Morpholino-Antisense Technik führen zu einer spezifischen Verminderung der Proteinmenge und verursachen einen embryonalen Phänotyp, der auf eine Aufgabe des zygotischen TBP2 während der Ausbildung der Körperachse hindeutet. Entwicklungsgeschichtlich konservierte Homologe des TBP2 wurden auch im Menschen, in der Maus, im Frosch und im Pufferfisch gefunden, wobei die mrna Expression in Maus- und Froschgeweben bestätigt wurde. Die Anwesenheit drei verschiedener Mitglieder der TBP Familie in Wirbeltieren deutet auf die Existenz stadien- und gewebespezifischer Prä-Initiationskomplexe während der Entwicklung hin, die speziellen Bedarf an verschiedenen Mitgliedern der TBP-Familie haben. Untersuchung ernährungsbedingter Genexpression mit Mikroarrays: Die Leber ist das zentrale biochemische Stoffwechselorgan bei Säugetieren und Menschen. Die meisten nahrungsabhängigen Stoffwechselvorgänge, wie beispielsweise das Einlagern von Zuckerreserven, die Steuerung des Blutzuckerspiegels und die Verwertung von Aminosäuren geschehen dort. Die bisher erzielten Erkenntnisse wurden fast ausnahmslos durch Untersuchung einzelner zellulärer Komponenten 8

11 gewonnen. Ebenso standen bis dato noch keine umfangreichen Daten über die Veränderung der Genexpression in der Leber durch den Einfluss des Ernährungszustandes zur Verfügung. Die Etablierung der Mikroarray-Technologie gab uns die benötigte Technologie in die Hand, um diese Lücke zu schließen. Wir konnten mit Hilfe der in unserer Arbeitsgruppe hergestellten hochdichten Mikroarrays die Genexpression in der Mausleber unter Hunger und ausschließlicher Fütterung von Zucker in einem globalen Ansatz analysieren. Von den etwa untersuchten Genen wurden diejenigen Gene spezifischen Signalkaskaden und metabolischen Stoffwechselwegen zugeordnet, die eine signifikante Expressionsänderung aufwiesen. Dabei konnten wir markante Änderungen feststellen, die unter anderem folgende Stoffwechselwege betrafen: die Lipid-abhängige Signaltransduktion, den hormonellen Insulin- und DHEA- (Dehydroepiandrosteron) Stoffwechsel, den Harnstoffzyklus, das S-Adenosylmethion-abhängige Methyltransfersystem und zelluläre Mechanismen des programmierten Zelltods (Apoptose). In früheren Studien wurde diesen Prozessen Bedeutung beim biologischen Alterungsvorgang zugemessen. In diesem Zusammenhang wurde ebenfalls beobachtet, dass kalorische Restriktion der Nahrungszufuhr zu einer höheren Lebenserwartung führt. Dieser Zusammenhang konnte bei allen bisher verwendeten Modellorganismen bestätigt werden. Beim Vergleich der Gene, die wir im durchgeführten globalen Ansatz unter Hunger reguliert identifizieren konnten, mit zuvor gefundenen Genen, die durch kalorische Restriktion beeinflusst werden, konnten wir eine hohe Übereinstimmung finden. Dies legt die Vermutung nahe, dass in der Leber unter Hunger die gleiche molekulargenetische Stressantwort hervorgerufen wird, wie dies auch unter energetisch verminderter Nahrungszufuhr der Fall ist. Daraus abgeleitet scheinen viele der unter Hunger beeinflussten biochemischen Komponenten des Stoffwechsels und der damit verbundenen Signalwege mit jenen überein zu stimmen, die für die Verlängerung der Lebenserwartung durch kalorische Restriktion verantwortlich sind. Es konnte somit erstmals eine umfassende Analyse eines Großteils der im Genom der Maus enthaltenen Gene durchgeführt werden, die diese Prozesse in einem molekularbiologischen Modell verbindet. Der Zebrafisch (Danio rerio) nahm in den zurückliegenden Jahren eine bedeutende Rolle als genetischer Modellorganismus in der Entwicklungsbiologie ein. Daneben kann er als Bindeglied zwischen Vertebraten und Nicht-Vertebraten eine hohe Bedeutung in der Aufklärung physiologischer Einflüsse auf die Genexpression erlangen. Neben toxikologischen Studien, die in dieser Hinsicht von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Strähle am ITG durchgeführt werden, wurden experimentelle Ansätze verfolgt, die die an der Maus und der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) bereits gewonnenen Erkenntnisse erweitern und miteinander vernetzen sollen. Aus technologischer Sicht wurden auch hier die Mikroarrays als Mittel der Wahl herangezogen, um auch für den Zebrafisch die Vorteile einer umfassenden genetischen Analyse zu erschließen. Mit der bereits gewonnenen Expertise konnten in relativ kurzer Zeit Zebrafisch-Mikroarrays von hoher Qualität und weltweit führendem Umfang ( Gene, 2-fach redundant je Mikroarray) hergestellt und verwendet werden. Programm BIOMED: Biomedizinische Forschung Environmental Health: DNA-Schaden Signaltransduktion nach Strahlungs-bedingtem DNA-Schaden, Regulation des Tumorsuppressorproteins p53 Das p53-protein ist eines der bedeutendsten Tumorsuppressor-Proteine, und ist in etwa 50% der menschlichen Tumore inaktiviert. Eine der Hauptaufgaben von p53 ist die Überwachung der Integrität des Genoms. Nach Exposition gegenüber genotoxischen Noxen nimmt die Menge und Aktivität von p53 zu, das als Transkriptionsfaktor die Expression von Proteinen reguliert, die den Zellzyklus kontrollieren oder Apoptose auslösen. Die anti-proliferativen Eigenschaften von p53 machen eine strenge Kontrolle der p53-aktivität in proliferierenden Zellen notwendig. Diese Kontrolle vermittelt das Onkoprotein Mdm2. Das Mdm2-Protein bindet an die Transaktivierungsdomäne von p53 und verhindert so die transkriptionelle Aktivierung von p53-zielgenen. Daneben vermittelt Mdm2 den Abbau von p53 im Proteasom. Voraussetzung für die proteasomale Degradation ist eine kovalente Anknüpfung einer größeren Anzahl von Ubiquitin-Monomeren an ein carboxyterminales Lysin des Zielproteins (Polyubiquitylierung). Innerhalb der Polyubiquitinkette kann die Verknüpfung der Ubiquitin-Monomere sowohl über Lysin 48 als auch über Lysin 63 des Ubiquitin- Proteins erfolgen. Dabei führt jedoch nur die Verknüpfung über Lysin 48 zur Degradation des Zielproteins. Die Polyubiquitylierung eines Zielproteins verläuft über mehrere Zwischenschritte, an denen mindestens drei Proteine (E1, E2, E3) des Ubiquitinsystems beteiligt sind. Mdm2 fungiert dabei als E3 Enzym. Neben der Polyubiquitylierung ist für die Degradation von p53 auch der Phosphorylierungsstatus des zentralen Bereichs von Mdm2 entscheidend. Hypophosphorylierung dieses Bereichs, z.b. nach ionisierender Strahlung, erlaubt zwar die Polyubiquitylierung von p53, nicht jedoch den Abbau. Dies weist auf die Beteiligung weiterer Faktoren an der Degradation des p53 Proteins hin, die z.b. am Transport von ubiquityliertem p53 Protein zum Proteasom beteiligt sein oder die Assoziation von ubiquityliertem p53, Mdm2 und der regulatorischen Untereinheit des Proteasoms stabilisieren könnten. 9

12 Hypophosphorylierung von Mdm2 führt zur Zunahme der Menge an p53. Um den Mechanismus dieser Mengenzunahme zu verstehen, suchten wir nach Faktoren, die an der Degradation von ubiquityliertem p53 beteiligt sind. Unter anderem haben wir das menschliche Homolog des Hefeproteins Rad23, hhr23 untersucht. Das Rad23-Gen wurde aufgrund der Sensitivität von Hefezellen gegenüber ultravioletter Strahlung nach Verlust oder Mutation isoliert. Ursache dieser Sensitivität ist vermutlich eine Beteiligung des Rad23-Proteins an der Nukleotid-Exzisionsreparatur. Eine Reihe von Beobachtungen weisen jedoch darauf hin, dass hhr23 auch eine Rolle bei der Proteindegradation spielt. Rad23 assoziiert mit S5, einem der Proteine der regulatorischen Untereinheit des Proteasoms über eine Wechselwirkung der ubl (ubiquitinlike) Domäne von hhr23 mit der Ubiquitinbindedomäne des S5. Neben der ubl Domäne besitzt jedes Mitglied der Rad23 Proteinfamilie zwei uba (ubiquitin associating) Domänen, die mit Polyubiquitinketten assoziieren. Im Hefemodell wurde eine hhr23-abhängige Interferenz mit der Polyubiquitylierung von Proteinen beschrieben. In unseren Experimenten beobachteten wir gleichfalls eine Reduktion der p53- Ubiquitylierung in Gegenwart von hhr23. Interessanterweise blockierte hhr23 jedoch nur die Ubiquitylierung, wenn die Ubiquitin-Monomere über Lysin 63 verbunden waren, nicht aber wenn die Monomere über das zur proteasomalen Degradation führende Lysin 48 verknüpft waren. Daneben hemmte hhr23 die Deubiquitylierung von ubiquityliertem p53 durch UBP1, einer Ubiquitin-Protease. Diese Experimente lassen auf eine zentrale Bedeutung der hhr23-proteine für die Degradation von p53 schließen. Hierfür spricht auch die Mengenzunahme von p53 in Abwesenheit von hhr23. Interessanterweise beobachteten wir auch eine Mengenzunahme von p53 nach Überexpression von hhr23 Proteinen. Dabei akkumulierte ubiquityliertes p53 Protein. Dies impliziert, dass die p53-degradation ein bestimmtes Mengenverhältnis von hhr23 zu p53 voraussetzt. Die Mengenzunahme erforderte darüber hinaus das Vorhandensein der ubl-, der uba- oder beider Domänen. Diese Beobachtungen führten zu einem Modell (siehe Abbildung), bei dem die uba Domäne des hhr23 Proteins mit der Polyubiquitinkette des p53 Proteins und die ubl Domäne des hhr23 Proteins mit der Ubiquitinbindefunktion des S5 Proteins der regulatorischen Untereinheit des Proteasoms eine Verbindung eingeht. Auf diese Weise bildet das hhr23 Protein eine Brücke zwischen ubiquityliertem p53 Protein und Proteasom, die vermutlich für die Degradation des p53 Proteins essentiell ist. Unsere Ergebnisse weisen auf mehrere Funktionen von hhr23 bei der Degradation von p53 hin. Über die Unterdrückung einer für die Degradation wenig geeigneten Polyubiquitylierung über Lysin 63 fördert hhr23 indirekt die Ubiquitylierung über das für die Degradation geeignete Lysin 48. Blockierung der Deubiquitylierung durch Ubiquitin-Proteasen stabilisiert die Ubiquitylierung des p53 Proteins und durch die Brückenfunktion zwischen ubiquityliertem p53 und der regulatorischen Untereinheit des p53 Proteins vermittelt hhr23 den Transport von ubiquityliertem p53 zum Proteasom. Abbildung: Modell für die Funktion der hhr23 Proteine bei der p53 Degradation. Die hhr23 Proteine assoziieren über die N- terminalen Ubl Domänen mit dem Proteasom und mit p53 über die C-terminale Uba Domäne. Bei bestimmten Mengenverhältnissen können die hhr23 Proteine so gleichzeitig mit dem p53 Protein und mit dem Proteasom assoziieren und so die Degradation des p53 Proteins unterstützen. Programm BIOMED: Biomedizinische Forschung Umweltbedingte Störungen der Gesundheit: Redox-Gleichgewicht und inflammatorische Antwort Entdeckung einer neuen Wirkweise des Sonnenlicht-UV: Spaltung von Protein-Tyrosin- Phosphatasen durch induzierte Calpain-Aktivität Wer kennt nicht die dramatischen Folgen auf der Haut nach intensiver Sonnenbestrahlung? Die Haut wird zerstört. Bei geringerer Dosis entsteht eine entzündliche Verdickung der Haut, die schmerzt. Entzündungszellen wandern ein und die Hautzellen beginnen, sich zu vermehren. Für diesen Prozess wurde am ITG kürzlich ein Mechanismus entdeckt. UVA (über 380 nm, aber auch UVB) lassen oxidative lipophile Zwischenprodukte entstehen, welche einerseits über Calzium-Freisetzung das Enzym Calpain aktivieren, andererseits ein höchst-sensitives Substrat für Calpain angreifbar machen: Protein-Tyrosin- 10

13 Phosphatasen. Die hohe Sensitivität dieser Enzyme kommt durch deren aktives Enzymzentrum zustande, welches, bei allen Tyrosin-Phosphatasen gleich, ein Cystein in charakteristischer Umgebung besitzt. Oxidation dieses Cysteins führt nicht nur zu Inaktivität des Enzyms, sondern auch zu Calpain-abhängigem Abbau. Die meisten dieser Tyrosin-Phosphatasen wirken als Bremsen in der Zelle. Ohne sie haben Gegenspieler die Oberhand, sogenannte Proteinkinasen, welche die Proliferation steigern. Mit Hilfe eines Calpain-Inhibitors konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass der beschriebene Mechanismus tatsächlich für die gesteigerte Proteinkinase-Aktivität verantwortlich ist. Es kann allerdings nicht empfohlen werden, vor einem Sonnenbad einen Calpain-Inhibitor auf die Haut aufzubringen. Das Resultat wäre zwar ein geringerer Sonnenbrand, aber auch erhöhte Schädigung der Haut. Der programmierte Zelltod: Ziel von organischen Metallverbindungen und synthetischen Lipiden Untersuchungen auf molekularer Ebene zur Wirkung von organischen Zinnverbindungen haben mittlerweile ergeben, dass es zwei wichtige Komponenten in der Zelle gibt, die am Geschehen der Apoptose (programmierter Zelltod) beteiligt sind, also direkt induziert werden. Zum einen existiert eine Rezeptorkomponente, d.h. die lipophile Zinnverbindung wirkt auf der Ebene der Plasmamembran und aktiviert den Todesrezeptorkomplex, wobei hier eine Arbeitshypothese, aber noch kein Beweis für das Targetmolekül vorliegt. Zum anderen wirken mit einer stärkeren Verzögerung diese Metallverbindungen auch direkt auf die Mitochondrien und sorgen damit für eine Aktivierung der intrinsischen Signalwege zur Apoptose. Das konnte mit der Untersuchung des mitochondrialen Membranpotenzials und mittels genetisch veränderter Zellen demonstriert werden. Abbildung: Die Abbildung verdeutlicht das Absinken des mitochondrialen Membranpotenzials unter dem Einfluss von 1µM TBT über die Zeit. Zum Vergleich ist der Effekt eines Entkopplers (FCCP) dargestellt. Ähnlich wie die organischen Metallverbindungen, aber über einen anderen Mechanismus, wirken die synthetischen Lipide, die zur Anti-Tumorbehandlung eingesetzt werden sollen. Diese Gruppe von Alkylphosphocholinen bewirkt ebenfalls die Induktion der Apoptose, eines genetischen Programmes also, das in Tumorzellen normalerweise abgeschaltet ist. Damit sind die Voraussetzungen geschaffen, diese Substanzen einsetzen zu können, allerdings ist der genaue Mechanismus, über den sie die Apoptose auslösen, noch unbekannt. Die experimentellen Hinweise deuten auf eine Aggregation der Rezeptormoleküle in der Plasmamembran und eine nachfolgende Aktivierung von Proteasen, wobei eine Caspase-unabhängige Komponente ebenfalls von Bedeutung zu sein scheint. Dieser alternative Weg zur Auslösung des Zelltodes in Tumorzellen wird im kommenden Jahr Gegenstand intensiver Untersuchungen sein. Programm BIOMED: Biomedizinische Forschung Umweltbedingte Störungen der Gesundheit: Aerosole Kokultursysteme als sensitives Target für Partikelexpositionen Zur in vitro Untersuchung der biologischen Wirkungen von feinen und ultrafeinen Partikeln werden Zellsysteme benötigt, die bereits auf niedrige Partikelkonzentrationen reagieren. Diese sollen für einen Einsatz in einem mobilen Expositionssystem geeignet sein. Als realitätsnahes Modellsystem für inhalierte Partikel wurden Kokulturen bestehend aus Epithelzellen und Makrophagen aus Mensch oder Ratte gewählt, da diese Zelltypen in vivo bei der Antwort auf inhalierte Partikel interagieren. Das humane System bestand aus den Lungenepithelzellen BEAS-2B oder A549, auf denen differenzierte THP-1-Zellen ausgesät wurden. Differenzierte THP-1-Zellen weisen einige biologische und morphologische Charakteristika von humanen alveolären Makrophagen auf. Für das Rattensystem wurden NR8383- Alveolarmakrophagen auf konfluente RLE-6TN Epithelzellen ausgesät. 11

14 Als Modell für eine entzündliche Veränderung wurden die Kokulturen zusätzlich mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) exponiert. LPS bildet mit dem Plasmaprotein LBP (LPS binding protein) und dem Membranrezeptor CD14 einen Komplex, der an das Transmembranprotein TLR4 (Toll-like Rezeptor 4) bindet, was zur Induktion einer intrazellulären Signalkaskade führt. Dabei werden die Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1 aktiviert und verschiedene Gene u.a. für die Zytokine TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 sowie für Enzyme wie inos transkribiert. Abbildung: IL-8-Freisetzung aus BEAS-2B-Epithelzellen und THP-1-Makrophagen in Mono- und Kokultur nach Exposition mit MAF02- Flugstaub ohne/mit LPS. Die hier gezeigte Kokultur bestehend aus Lungenepithelzellen und Makrophagen des Menschen reagierten deutlich empfindlicher mit einer Freisetzung der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8 als die jeweiligen Monokulturen nach Stimulation mit LPS. Die Zytokinfreisetzung wird weiter verstärkt, wenn die Kokulturen zusätzlich mit niedrigen Dosen an Flugstaubpartikeln exponiert wurden. Der Flugstaub aus Verbrennungsprozessen enthält feine und ultrafeine Partikel und dient bei unseren Untersuchungen als Modell für Umweltstäube. Die Hochregulation der Zytokinfreisetzung in den Kokulturen wird wahrscheinlich durch einen Synergismus der beiden Zelltypen verursacht. Es wird vermutet, dass dieser Synergismus zum einen durch Austausch von Mediatormolekülen (z.b. TNF-α) und zum anderen durch direkten Zell-Zell-Kontakt verursacht wird. Da Makrophagen mit Epithelzellen auch in der Lunge in engem Kontakt stehen, stellt die Kokultur ein realistischeres Zellsystem dar als die jeweiligen Monokulturen. Diese Zellsysteme wären somit auch als Testsystem für Experimente mit Aerosol geeignet, bei denen mit niedrigen Partikeldosen zu rechnen ist. Programm BIOMED: Biomedizinische Forschung Umweltbedingte Störungen der Gesundheit: Chemikalien Toxische Wirkungsmechanismen von (poly)bromierten Flammschutzmitteln Die molekular-toxikologischen in-vitro Untersuchungen mit Zellkulturen verschiedener humaner und tierischer Zelllinien (Schilddrüsen-, Nieren-, Lungen-, T-Zellen) wurden mit weiteren polybromierten Substanzen (Phenole als Abbauprodukte und Diphenylether) und dem Tetrabrombisphenol A (TBBPA) fortgeführt und vertieft. Dabei bestätigte sich, dass die NRK-Zellen (epitheliale Nierenzellen der Ratte) von allen eingesetzten Zelllinien am empfindlichsten auf die Substanzen reagieren. Für TBBPA konnten mit dem MTT-Assay folgende EC50 Konzentrationen (Reduktion der Vitalität) ermittelt werden: Zelllinie TBBPA EC 50 NRK 52 µm A µm Cal µm Im Vergleich der ERK 1/2 MAP-Kinasen und deren Aktivierungsstatus ist in den verschiedenen Zelllinien zu erkennen, dass dieser Signalweg, der in Verbindung mit der Regulierung von Proliferation und Überleben bzw. Differenzierung steht, in zellspezifischer Weise durch TBBPA unterschiedlich moduliert wird. Während die Aktivierung bei den Schilddrüsenzellen mit der TBBPA-Konzentration zunimmt (bis 100 µm), so nimmt sie in allen anderen Zellen mit steigender Konzentration ab. Die Lungenepithel-Zellen A549 hatten sich im Cytotoxizitäts-Assay als recht robust gegenüber einer TBBPA-Exposition erwiesen. Andererseits zeigten diese Zellen bei Konzentrationen ab 100 µm eine Induktion der Apoptose, was nach Annexin/FITC Färbung der Zellen erkennbar war. 12