Grundlegende Methoden der Molekularen Biologie, AD II. Prof. Dr. Albert Duschl

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1 Grundlegende Methoden der Molekularen Biologie, AD II Prof. Dr. Albert Duschl

2 Molekulare Mechanismen Themen für die erste Vorlesung: Signalwege, am Beispiel von Jak/STAT Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz Western Blot, incl. phospho-spezifischer Antikörper, knock-down Reportergene, transient vs. stabil Reporterproteine, LUC, GFP, RFP HTS, single cell analysis, drug development, wie kommt man zu Geld? Unser Beispiel: Schwangerschaftstest Themen für die zweite Vorlesung: Signalwege, am Beispiel von ras/raf/erk Expression, Überexpression Tests für Proliferation, Vitalität, Nekrose, Apoptose Toxizität und Immuntoxizität, wie kommt man zu Geld? Unser Beispiel: Nanotoxikologie Bei wem kommt man zu Geld? Unser Beispiel: FWF

3 ras/raf Signalübertragung ist komplex, aber viele Signalketten sind konserviert, auch in der Funktion. Der ras/raf Weg führt in Vertebraten gewöhnlich zur Proliferation. Viele beteiligte Gene sind mit Tumorentstehung assoziiert, am prominentesten ras, oder exakter gesagt p21 ras. Das Gen wäre ras. Da dieser Signalweg hoch konserviert ist, können Sie Informationen aus vielen Organismen verwenden. Der Gesamtweg findet sich bis zu Caenorhabditis und sogar Hefe hat Teile davon. Cell Signaling Technology

4 Aktivierung Zahlreiche Rezeptoren aktivieren ras, oft über ein Adaptermolekül wie Grb2 und einen ras-aktivator wie SOS. Ras ist selber ein Enzymaktivator, vor allem für die Kinase Raf-1 (= c-raf). Damit wird eine Kette von Kinasen angestoßen. Raf phophoryliert MEK und dieses phosphoryliert MAP Kinasen. ERK1 und ERK2 sind zwei Mitglieder der umfangreichen MAP Kinase Familie. Auch MEK gibt es eine ganze Reihe und sogar von Raf haben wir drei Varianten. Nur ras ist einmalig. Cell Signaling Technology

5 The real thing Ras ist ein untypische G-Protein. Die normalen G-Proteine sind Heterotrimere, hier im Komplex mit einem konkreten Rezeptor. Man sieht wie der Rezeptor (blau) hauptsächlich die a-untereinheit (rot) kontaktiert. Die Untereinheiten ß und g ( gelb bzw. grün) dissoziieren bei Aktivierung; Ga wirkt dann als Enzymregulator. Ras entspricht einem Teil der a- Untereinheit. Es fehlt der aktivierende Teil aus Ga, so dass ein spezieller Aktivator benötigt wird, so wie SOS. Nature 29. September 2011

6 MAP Kinasen ERK (Extracellular signal regulated kinase) werden von MEK aktiviert, indem MEK regulatorische Tyrosinreste in ERK phosphoryliert. Es gibt zwei ERK Isoformen, ERK-1 und ERK-2. ERK gehören zur Gruppe der MAP Kinasen (MAPK = Mitogen activated protein kinase). Wichtige Mitglieder der selben Familie sind p38 und JNK (Jun-Nterminal kinase). Beide sind assoziiert mit zellulärem Stress, Entzündung und Apoptose. From: W. Kolch, Biochem. J. 351: (2000)

7 Zellulärer Stress Ein Notprogramm, das helfen soll die zelluläre Homeostase wieder zu erlangen. Reagiert auf zahlreiche Stimuli! Beispiel: Ein kommerzielles Protein enthält nachweisbare Mengen an LPS. Macht das Zellen etwas aus? Wenn ja, müssen wir die ganze Versuchsserie wiederholen! Antwort: Zurück zum Start, denn NF-kB, ein Stress-Marker, wird schon von geringen Mengen des LPS-freien Agens aktiviert. Test: Die LPS-Rezeptor Komponenten TLR4, CD14 und MD-2 wurden in HEK293 Zellen transient exprimiert, die NF-kB Aktivität erfolgte über einen LUC-Reporter. Schwarz et al. PLoS One DOI: /journal.pone (2014)

8 Entzündung Ein Notprogramm, das Pathogene und andere schädliche Entitäten beseitigen und Wundheilung bewirken soll. Reagiert auch auf zahlreiche Stimuli! Der vorhin gezeigte Zell-Stress reicht aus um proentzündliche Cytokine zu induzieren. Zellen von links nach rechts: THP-1, primäre menschliche Monozyten, primäre menschliche DCs, modcs. Schlussfolgerungen: Umsteigen auf Produkt eines anderen Herstellers. Alle Agenzien vor Verwendung auf LPS testen. Paper über die extreme Sensitivität von DC auf LPS veröffentlichen. Schwarz et al. PLoS One DOI: /journal.pone (2014)

9 ROS Reaktive Oxygen Species (ROS) entstehen bei Entzündung, lösen diese aber auch aus. Sie sind ebenfalls ein guter Test für Zell-Stress / Entzündung, je nach erzeugter Dosis. In diesem Versuch werden Silber- und Gold-Nanopartikel mit verschiedenen Oberflächenladungen getestet. Wir haben am Anfang keine Ahnung ob Toxizität vorliegt, müssen also sehr allgemeine Endpunkte messen (so muss man jedenfalls vorgehen good scientific practice). Methode: Carboxy-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-dcfh-da) Assay, bei dem ROS einen fluoreszierenen Farbstoff erzeugt. Messung durch FACS. Schlinkert et al. J Nanobiotechnology Jan 16;13(1):1. [Epub ahead of print]

10 Zelltod Apoptose ist geplanter, aktiv durchgeführter Zelltod. Sie gehört u.a. zum Programm einer Entzündung, etwa um virusbefallene Zellen zu töten. Nekrose ist ein ungeplanter, traumatischer Tod, der jedenfalls Entzündung auslöst. Was misst man dazu? Viability, cell death, apoptosis, proliferation that is not all the same. Sounds trivial, but I reject papers that fail to distinguish it.

11 Viability Dieser Test misst die Freisetzung von Laktat Dehydrogenase (LDH) aus Zellen. Er ist damit ein Test für die Integrität der Membran. LDH wird über eine Redox- Reaktion quantifiziert, die einen Farbtest erlaubt. Achtung: Wir berücksichtigen hier weder Proliferation noch Apoptose! In beiden Fällen würde kein LDH freigesetzt. Wir erfahren auch nichts darüber ob die Zellen in gutem Zustand sind, nur die intakte Membran ist entscheidend. Ein Wert von 100% bedeutet volle Viabilität, also keine LDH-Freisetzung. Je niedriger die Werte um so mehr nekrotische Zellen. Bei 0% ist alles LDH freigesetzt und die Membranintegrität ist ebenfalls 0%. Schlinkert et al. J Nanobiotechnology Jan 16;13(1):1. [Epub ahead of print]

12 More Viability Hier die gleichen Versuche mit dem CellTiter Blue Assay. Resazurin wird in fluoreszierendes Resorufin überführt, was ein Maß für die Stoffwechselaktivität der Zellen ist. Nur lebende Zellen machen die Umsetzung. Messung über Plate Reader. Apoptotische oder nekrotische Zellen fallen gleichermaßen aus, dafür würde Zellproliferation höhere Werte ergeben. Direkte Messung von Proliferation ginge über FACS (Zell-Zählung) oder [³H]-Thymidin-Einbau in DNA. Warum mindestens zwei Assays für den Zellzustand? Weil Nanopartikel Interferenz mit Assays zeigen können. Schlinkert et al. J Nanobiotechnology Jan 16;13(1):1. [Epub ahead of print]

13 COMET DNA-Brüche, etwa durch Apoptose, misst man mit dem COMET Assay. DNA Fragmente treten aus Zellen aus, wandern in einem elektrischen Feld und bilden einen Kometenschweif. Dessen Länge ist ein Maß für die DNA-Fragmentierung. Huk et al. Particle and Fibre Toxicology 2014, 11:65 amsbio.com

14 Partikel Partikel, wie Harnsäurekristalle, können etwa über mechanische Zerstörung von lysoendosomalen Vesikeln das System aktivieren. Auch andere Stimuli können eingreifen, wie ROS, die u.a. im Rahmen von apoptotischen Prozessen aus Mitochondrien freigesetzt werden. Nanopartikel können sogar direkt das Inflammasom aktivieren. Nachweis: Caspase-1 Inhibition und Messung der Cytokine oder anderer Marker. Schroder et al., Science 327: (2010)

15 Beobachtung Es gibt keinen Ersatz dafür Zellen wirklich anzusehen. Wenn Sie auch noch Nanopartikel sehen möchten benötigen Sie entweder fluoreszierende Partikel oder solche die elektronenmikroskopisch sichtbar sind. Hier rechts sind das Gold- Nanopartikel. Erkenntnis: Die Partikel gehen über endosomalen Transport in die Zellen und verlassen sie wieder über exosomalen Transport. Ohne direkte Beobachtung ist das nicht festzustellen, es gibt keinen dafür keinen Ersatz. Halten Sie also die Augen offen. Boyles el al, submitted.

16 Metal/Metal Oxide Au (3-50 nm), Au Rods, F 3 O 4 (7 nm), Ag (20 nm), Co (4-16 nm), CeO 2 (6 nm) Materials and figures courtesy of Victor Puntes, U. Barcelona

17 Particles Particles NP ändern sich mit der Zeit, und jedenfalls im Kontakt mit biologischen Systemen. Beispiele rechts: Au 48 h in RPMI bei 37 C, CoO 24 h in Wasser bei RT. Partikel aggregieren, agglomerieren, aber jedenfalls binden sie Proteine. Would that be interesting for transporting therapeutic proteins? Oostingh et al., Particle Fibre Tox, 8:8,1-21 (2011)

18 Viability Erinnern Sie sich an den Cytotox Test mit den geladenen NPs? Beachten Sie dass hier (und in allen anderen Versuchen) Goldpartikel mit einer Chitosan-Hülle am stärksten toxisch waren? Nanogold ist harmlos und für medizinische Verwendung zugelassen. Chitosan ist als GRAS klassifiziert: Generally recognized as safe. Wir haben hier also aus zwei unproblematischen Substanzen ein starkes Gift gemacht. Das ist doch ein schönes Ergebnis. Schlinkert et al. J Nanobiotechnology Jan 16;13(1):1. [Epub ahead of print]

19 Toxizität Tatsächlich, unsere Au-Chitosan töten Bakterien. Sogar wir können einen einfachen Plattierungstest brauchen. P. Schlinkert, Dissertation, Salzburg, 2014

20 Paradigmen der Nanotoxizität 1) Dissociation of toxic metal ions from metal and metal oxide particles. 2) Fiber toxicity for long, stiff carbon nanotubes and similar entities. 3) ROS production directly at NP surfaces and indirectly by immune cells. 4) Inflammatory cytokines. 5) Cell death. Schlussfolgerung: Immunologen sollten Nanotoxizität einschätzen, sowohl in Bezug auf molekulare Mechanismen als auch für Screening. Bulk alum. Wikimedia Commons

21 Quoting ourselves Allergy-Cancer-BioNano Research Centre The Allergy-Cancer-BioNano Research Centre of the University of Salzburg comprises eleven research groups focusing on the topics allergy, immunology, cancer research, nanotoxicity and structural biology. Investigation of the molecular and cellular basis of different diseases serves as the common denominator. Performance of excellent basic science and translational research with high international visibility and recognition are the declared aims of the priority programme. University of Salzburg, Homepage

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