Untersuchung von Kombinationswirkungen von (Tri)azol-Fungiziden in vitro und in vivo am Beispiel der Nebenniere

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik Untersuchung von Kombinationswirkungen von (Tri)azol-Fungiziden in vitro und in vivo am Beispiel der Nebenniere INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Svenja Rieke Hannover Hannover 2015

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Pablo Steinberg Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik Tierärztliche Hochschule Hannover 1.Gutachten: Prof. Dr. Pablo Steinberg Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. Manfred Kietzmann Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover PD Dr. Karen-Idilco Hirsch-Ernst Abteilung Lebensmittelsicherheit Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin 2.Gutachten: Prof. Dr. med. Ralf Stahlmann Institut für klinische Pharmakologie und Toxikologie Charité Universitätsmedizin Berlin Tag der mündlichen Prüfung: Diese Arbeit wurde vom Bundesinstitut für Risikobewertung finanziert und dort in der Fachgruppe Toxikologie der Wirkstoffe und ihrer Metabolite durchgeführt.

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Einleitung Welche Pflanzenschutzmittelrückstände treten auf, warum sind sie potenziell gesundheitsgefährdend und wie werden sie reguliert? Warum treten Mehrfachrückstände auf? Wie geht die Gesetzgebung mit Mehrfachrückständen von Pestiziden um? Was sind potenzielle Risiken von Mehrfachrückständen? Was versteht man unter Niedrigdosiswirkungen? Warum wird die Nebenniere als Zielorgan zum Studium der toxischen Wirkung von Pestizidgemischen verwendet? Beispielsubstanzen: (Tri)azol-Fungizide Was sind bekannte nebenierenrelevante adverse Effekte von (Tri)azolfungiziden? In vitro Modell für Kombinationseffekte auf die Nebenniere Frage- und Aufgabenstellung Material und Methoden Material Geräte Verbrauchsmaterialien Chemikalien Testsubstanzen PCR, ELISA und Reporterassay Zellkultur Puffer Zellkulturmedien Primer Methoden Tierexperimentelle Arbeiten Versuchstiere und Tierhaltung Durchführung der in vivo Studien Analyse von Serumproben auf Steroide, weitere Zielverbindungen und generelle Metabolitprofile Vermessung der Zona fasciculata des Nebennierencortex Zellbiologische Arbeiten Zelllinie H295R Auftauen der Zellen Kultivierung und Passage der Zellen Behandlungen der Zellen mit verschiedenen (Tri)azolen und (Tri)azolkombinationen WST-Zytotoxizitäts-Assay ELISA ACTH-ELISA Cortisol-ELISA Progesteron-ELISA Estradiol-ELISA Aldosteron-ELISA DHEA-ELISA IL1α-ELISA...42

4 Inhaltsverzeichnis Reporter-Assay: VDR, FXR und LXR Molekularbiologische Arbeiten RNA-Isolierung mittels TRIzol RNA Aufreinigung mittels RNeasy MinElute Cleanup Kit Bioanalyzer cdna-synthese mittels Reverser Transkriptase Sybr-Green Real-Time RT-PCR RT 2 Profiler PCR Arrays Whole Genom Analyse Mathematische Modellierung und Statistische Auswertung Ergebnisse In vivo Untersuchung In vivo - Klinische Chemie In vivo Nebennierengewicht und Histopathologie In vivo Nebennierentoxizität von Epoxiconazol In vivo Untersuchung Steroidbiosynthese In vivo - Genexpressionsveränderungen relevanter Gene der Steroidbiosynthese In vivo Genexpressionsveränderung nukleärer Rezeptoren In vivo Weitere Differenzielle Genexpression durch Wirkstoffkombinationen In vivo - Untersuchung des Mechanismus der Nebennierentoxizität Abschätzung der in vitro Konzentrationen aus den in vivo Konzentrationen in Zielgeweben der Ratte In vitro Untersuchungen In vitro - Zytotoxizität der (Tri)azole In vitro Steroidbiosynthese In vitro - Genexpressionsuntersuchungen zur Ermittlung des Inkubationszeitraums In vitro Genexpressionsveränderungen relevanter Gene der Steroidbiosynthese In vitro - Expressionsveränderungen apoptoserelevanter Gene In vitro Weitere differenzielle Genexpression durch Wirkstoffkombinationen In vitro Interaktion von (Tri)azolen mit nukleären Rezeptoren Vorhersage von Kombinationseffekten mittels CA- und IA-Modellierung Diskussion Kombinationswirkungen von (Tri)azolen Klassische und molekulare Parameter Korrelation der in vivo - in vitro Untersuchungen Niedrigdosiswirkungen von (Tri)azolfungiziden in der Nebenniere Toxizitätsmechanismus von (Tri)azolen: Interaktion mit nukleären Rezeptoren Zusammenfassung Summary Anhang Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis

5 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer µm Mikromolar Abb. Abbildung ACTH Adrenocortiotropin ADI (engl.) Acceptable Daily Intake ADME Absorption, Distribution, Metabolismus, Elimination AhR Arylhydrocarbonrezeptor AOEL (engl.) Adverse Operator Effect Level AOP (engl.) Adverse Outcome Pathway AR Androgenrezeptor ARfD akute Referenzdosis BfR Bundesinstitut für Risikobewertung CA (engl.) Concentrationaddition (Dosisadditivität) CAG (engl.) Cumulative Assessment Group CAR (engl.) Constitutive Androstane Receptor cdna komplementäre Desoxyribonucleinsäure CYP Cytochrom P450 Enzym DAR (engl.) Draft Assessment Report DHEA Dehydroepiandrosteron DMEM (engl.) Dulbecco s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid EC (engl.) European Commission EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EFSA (engl.) European Food Safety Agency ELISA (engl.) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EPA (engl.) Environmental Protection Agency ERα Estrogenrezeptor α ERβ Estrogenrezeptor β EU Europäische Union FXR Farnesoid X Rezeptor g Gramm GC-MS Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung GLP (engl.) Good Laboratory Practice γ-gt γ-glutamyltransferase HE Hematoxilin-Eosin HRE (engl.) Hormone Responsive Element HSD Hydroxysteroiddehydrogenasen HV Hauptversuch IA (engl.) Independent Action (Effektadditivität) ILSI (engl.) International Life Science Institute Europe kg Kilogramm

6 Abkürzungsverzeichnis KG LOAEL LXR m M Mg ml mm MOA MRL mrna nm NOAEL NOEC OD OECD PBS ph ppm PPR Panel PR ROS Rt RT-PCR SBI StAR Tab. US V VA VB VDR WST ZF ZG ZR Körpergewicht (engl.) Lowest Observed Adverse Effect Level Liver X Rezeptor Männlich Molar Milligramm Mililiter Millimolar (engl.) Mode of Action (engl.) Maximal Residue Level messenger Ribunukleinsäure Nanometer (engl.) Non Observed Adverse Effect Level (engl.) Non Observed Effect Level Optische Dichte Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (engl.) Phosphate Buffered Saline (lat.) Potential Hydrogenii (engl.) Parts per Million (engl.) Scientific Panel on Plant Protection and other Residues Progesteronrezeptor (engl.) Reactive Oxigen Species Raumtemperatur Real Time - Polimerasekettenreaktion Sterolbiosynthese-Inhibitor (engl.) Steridogenic Acute Regulatory Protein Tabelle United States Volumen Vorversuch A Vorversuch B Vitamin-D Rezeptor Wasserlösliches Tetrazoliumsalz (lat.) Zona Fasciculata (lat.) Zona Glomerulosa (lat.) Zona reticularis

7 1. Einleitung 1. Einleitung In der konventionellen Landwirtschaft sind Pflanzenschutzmittel allgegenwärtig. Sie werden eingesetzt zum Schutz von Kulturpflanzen vor Schädlingen, Pflanzenkrankheiten und Unkrautkonkurrenz. Sie dienen der Verringerung von Ernteausfällen und zum Erhalt der Qualität von pflanzlichen Produkten zum Schutz des Menschen gegenüber mit gesundheitsschädlichen Schädlingsbestandteilen belasteten Lebensmitteln (Arnold 1992; Ware G.W. 2000). In der deutschen Öffentlichkeit wird der Einsatz von Pflanzenschutzmitteln jedoch als sehr kritisch betrachtet. Tatsächlich zeigte eine vom BfR durchgeführte Studie, dass 70 % der Befragten davon ausgehen, dass das Vorhandensein von Pflanzenschutzmittelrückständen auf Lebensmitteln einen Rechtsverstoß darstellt (Epp A et al. 2010). Zudem werden diese mit einem hohen oder sehr hohen Risiko für die Gesundheit verbunden. Gleichzeitig fühlen sich Verbraucher zu wenig über Pflanzenschutzmittel und deren Rückstände informiert. 1.1 Welche Pflanzenschutzmittelrückstände treten auf, warum sind sie potenziell gesundheitsgefährdend und wie werden sie reguliert? Die Verbreitung von Pestizidrückständen wird von der EFSA in europaweiten Überwachungsprogrammen regelmäßig analysiert und veröffentlicht. Der derzeit aktuelle Bericht der EFSA betrachtet Daten aus dem Jahre 2010 (EFSA 2013b). Untersucht wurden dabei EU-interne sowie importierte Produkte % der getesteten internen europäischen Stichproben wiesen keine Pestizidrückstände auf % enthielten messbare Rückstände unterhalb der gesetzlich festgelegten Höchstmengen, 1.6 % oberhalb dieser % der Proben mit messbaren Rückständen aus Ländern innerhalb der EU sowie von importierten Produkten (Stichprobengröße insgesamt 70771) enthielten dabei mehr als einen Wirkstoff (EFSA 2013b). Innerhalb dieser Probengruppe wiesen 97.2 % Rückstände unterhalb der gesetzlich festgelegten Höchstmengen auf. 2.8 % dieser Proben überschritten die gesetzlich festgelegten Höchstmengen. Das Wirkprinzip von Pestiziden beruht grundsätzlich auf der möglichst breiten Bekämpfung von schädlichen Organismen, ohne die Kulturpflanzen, den landwirtschaftlichen Anwender oder die Verbraucher zu gefährden. Angriffspunkte sind spezifische biochemische Strukturen und Funktionen von Schadorganismen, wie beispielsweise spezifische Pilzenzyme, die am Aufbau der Zellwand beteiligt sind. Oft sind diese Strukturen oder die biochemischen 1

8 1. Einleitung Prozesse dieser Strukturen jedoch entwicklungsgeschichtlich konserviert, so dass eine adverse Wirkung gegenüber den Anwendern oder den Verbrauchern nicht prinzipiell ausgeschlossen werden kann (Dunkelberg 2006). Aus diesem Grund müssen einzelne Pflanzenschutzmittel vor ihrer ersten Anwendung grundsätzlich ein Zulassungsverfahren durchlaufen. Dabei erfolgt eine Risikoabschätzung auf der Grundlage einer Einzelstoffbewertung nach international anerkannten und abgestimmten Methoden. Die einzelnen Pestizide werden vor ihrer Zulassung toxikologisch charakterisiert und anschließend wird eine Risikobewertung durchgeführt (EG 2009). Basis der toxikologischen Bewertung ist der experimentell ermittelte No Observed Adverse Effect Level (NOAEL), die höchste Dosis im Tierversuch, bei der kein adverser Effekt in geeigneten Studien nachgewiesen werden kann. Auf der Grundlage dieses Wertes werden für jedes einzelne Pestizid unter anderem Grenzwerte für den Acceptable Daily Intake (ADI), die Akute Referenzdosis (ARfD) und den Acceptable Operator Exposture Level (AOEL) berechnet. Der ADI beschreibt die Dosis, die ein Mensch sein Leben lang täglich aufnehmen kann, ohne dass gesundheitsschädigende Effekte auftreten. Die ARfD hingegen bezieht sich auf die akute und kurzzeitige Aufnahme von Pestiziden, während der AOEL die Sicherheit von Anwendern gewährleisten soll. In der Risikobewertung werden ADI und ARfD in Bezug zu der tatsächlichen oralen Exposition des Menschen gesetzt. Diese lässt sich anhand von Rückstandswerten, die in überwachten Feldversuchen ermittelt wurden sowie durchschnittlichen Verzehrsmengen abschätzen. Liegt die mögliche Exposition eines Wirkstoffes unter den relevanten toxikologischen Referenzwerten (ADI, ARfD), stellt sie kein gesundheitliches Risiko für den Verbraucher dar (Boobis et al. 2008). Bedeuten zu erwartende Einzelrückstände in Agrarerzeugnissen und Lebensmitteln keine Gefahr für die Gesundheit von Mensch und Tier, kann eine Zulassung erteilt werden. Grundsätzlich sollten Rückstände jedoch so gering wie möglich gehalten werden. Aus diesem Grund werden sogenannte Maximum Residue Levels (MRL) ermittelt (EG 2005). Diese beschreiben die maximalen Rückstandsmengen von Pestiziden im Feldversuch, wenn sie nach dem Prinzip der Guten Landwirtschaftlichen Praxis eingesetzt werden. Sie dienen als Grenzwerte für Pestizidrückstände in der europäischen Gesetzgebung. Die Daten der Lebensmittelüberwachung zeigen, dass lediglich ein sehr geringer Anteil (1,6 %) der Proben die MRL, also die gesetzlich festgelegten Höchstwerte, 2

9 1. Einleitung überschreitet. Liegt der Rückstand einer Probe oberhalb der MRL, wird von der zuständigen Behörde geprüft, ob dies mit einem Gesundheitsrisiko für den Verbraucher behaftet ist. In der Risikobewertung tritt allerdings eine weitere Variable auf, die durch die derzeitige Anwendung der gesetzlichen Verordnung bezüglich des Inverkehrbringens von Pflanzenschutzmitteln nur eingeschrängt abgedeckt ist. Wie bereits angemerkt, basieren ADI und ARfD, unterhalb denen gesamte oral Aufnahme liegen muss, auf den NOAEL für ein einzelnes Pestizid. In der Lebensmittelüberwachung wurden Proben entdeckt, die mehr als einen messbaren Rückstand aufwiesen (26.6 %) (EFSA 2013b). Die derzeit geltende gesetzliche Verordnung sieht zwar die Berücksichtigung dieser Mehrfachrückstände in der Risikobewertung vor, strittig ist jedoch die Umsetzung (EFSA 2013a). Es ergibt sich folglich die Frage, ob die gesetzlich geforderten, entsprechend festgelegten und nach allen bisherigen Erfahrungen auch belastbaren toxikologische Grenzwerte wie der ADI für die Einzelsubstanzen auch unter den Bedingungen einer kumulativen Exposition sicher sind. Dies soll innerhalb dieser Arbeit am Beispiel der Nebenniere untersucht werden. 1.2 Warum treten Mehrfachrückstände auf? Mehrfachrückstände treten auf, wenn in der Landwirtschaft nicht ein einzelnes Pestizid eingesetzt, sondern Pflanzenkulturen mit mehreren Pflanzenschutzmittelwirkstoffen behandelt werden, die teilweise bereits in einem fertigen Produkt zusammengemischt sind. Begründet wird dies durch die unterschiedlichen Anforderungen an Pestizide aufgrund der Entwicklungsfolge der Kulturpflanzen. Auch erfordert die Bekämpfung verschiedener Schädlinge, z.b. Insekten, Pilze oder Schnecken, unterschiedliche Wirkstoffe. Weiterhin kann die Wirksamkeit eines Pestizids erhöht werden, wenn mehrere Wirkstoffe gleichzeitig eingesetzt werden. Dadurch kann die Konzentration der Einzelstoffe des Gemisches reduziert werden. Schließlich kann der Einsatz von verschiedenen Pestiziden auch die Bildung von Resistenzen vermindern. Man bezeichnet diese Art von Rückständen als Primary Cocktail. Zudem können Mehrfachrückstände auftreten, wenn verschiedene Erzeugnisse vermischt werden, die jeweils mit unterschiedlichen Pflanzenschutzmitteln belastet sind, beispielsweise Salatmischungen (Reynolds S and Hill A 2002). Dies bezeichnet man als Secondary Cocktail. 3

10 1. Einleitung 1.3 Wie geht die Gesetzgebung mit Mehrfachrückständen von Pestiziden um? Eine umfassende experimentelle toxikologische Testung und Risikobewertung von Mehrfachrückständen analog zur Einzelsubstanzbewertung von Pestiziden sind innerhalb der Europäischen Union gesetzlich nicht vorgesehen und aufgrund der hohen Zahl an möglichen Kombinationen und daraus resultierenden Tierversuchen wenig praktikabel. Vereinzelt werden derzeit Pestizidklassen kumulativ bewertet. Die US EPA implementierte kumulative Bewertungsgruppen für Substanzen, die einen identischen Wirkmechanismus aufweisen. So werden z.b. für Organophosphate, n-methyl-carbamate, Chloracetanilide und Triazine kumulative Risikobewertungen durchgeführt (EPA 2006a; EPA 2006b; EPA 2007). Analog dazu nehmen einzelne Staaten der Europäischen Union, wie Dänemark oder Deutschland, eine kritische Wertung von wenigen Substanzklassen, z.b. von Organophosphaten oder Carbamaten, vor (EFSA 2008). Die Europäische Union implementierte im Jahr 2005 die Verordnung 396/2005, die die Etablierung eines MRL-Höchstwertes unter der Berücksichtigung des möglichen Vorhandenseins von Pestizidrückständen aus anderen Quellen als der üblichen Anwendung [ ] vorsieht (EG 2005). Die Verordnung (EG) 1107/2009 sieht zudem als Voraussetzung für die Zulassung von neuen Pflanzenschutzmitteln die Berücksichtigung möglicher kumulativer oder synergistischer Effekte von Bestandteilen von Pflanzenschutzprodukten für die Gesundheit des Menschen (EG 2009). Beiden Verordnungen ist gemein, dass eine wissenschaftlich anerkannte Methode zur Bestimmung der kumulativen oder synergistischen Effekte eine Voraussetzung für die Anwendung der kumulativen Risikobewertung darstellt. International anerkannte wissenschaftliche Methoden zur Vorhersage von synergistischen und kumulativen Effekten sind derzeit nicht vorhanden. Verbreitet werden jedoch zur Vorhersage kumulativer Effekte mathematische Modelle eingesetzt (EFSA 2013a). Auf eine Entwicklung international anerkannter Methoden wurde bereits in der Verordnung (EG) 396/2005 bezüglich gesetzlich festgelegter Rückstandshöchstmengen (MRLs) hingewiesen, und auch das Europäische Parlament hat die Entwicklung entsprechender Methoden angefordert (EFSA 2008). In der 2009 von der EFSA vorgeschlagenen Strategie zur Risikobewertung werden Substanzen, die gemeinsam bewertet werden sollen, in Cumulative Assessment Groups (CAGs) zusammengefasst. Nach Ermittlung der Exposition können für die anschließende Risikobewertung der Hazard-Index, der Referenzpunktindex, der relative Potenzfaktor oder etablierte Referenzwerte herangezogen werden (EFSA 2009). Sowohl die Expositionsab- 4

11 Effekt 1. Einleitung schätzung als auch die Bildung der Hazard basierten CAGs werden dabei als kritische Schritte angesehen. Die Abschätzung der Exposition gegenüber Mehrfachrückständen von Pestiziden gestaltet sich für die Gruppe der Verbraucher als schwierig, da sie unterschiedlichsten Expositionsszenarien gegenübersteht. Da das von den europäischen Behörden ins Leben gerufene Scientific Panel on Plant Protection and their other Residues (EFSA 2009) aufgrund der vorliegenden wissenschaftlichen Untersuchungen davon ausgeht, dass die Möglichkeit einer Dosis-Additivität von Pestiziden das höchste potenzielle Risiko für den Verbraucher darstellt, will die EFSA bei der Bildung von CAGs einen entsprechenden Weg einschlagen: Wenn ungenügende oder keine Informationen bezüglich des Mechanismus der Toxizität einer Substanz bekannt sind, sollte für Substanzen mit dem gleichen Effekt die Dosisadditivität als Defaultmethode angewendet werden (EFSA 2013). Substanzen mit gleichem Effekt auf ein Organ sollten somit als kumulative Bewertungsgruppe gruppiert werden. Exemplarisch wurde dieser Ansatz bereits für Rückstände neurotoxischer und schilddrüsentoxischer Wirkstoffe durchgeführt. Derzeit wird die Bildung weiterer CAGs für spezifische Organe und Organsysteme vorbereitet. 1.4 Was sind potenzielle Risiken von Mehrfachrückständen? In Abbildung 1 sind mögliche Kombinationeffekte von zwei Chemikalien A und B mit den Einzeleffekten A und B dargestellt. Substanz A Substanz B Substanzen A+B Substanzen A+B Substanzen A+B Substanzen A+B unabhängige Wirkung Additive Wirkung Synergistische Wirkung Antagonistische Wirkung Abbildung 1: Mögliche Kombinationeffekte von Substanzen A und B. Die Wirkstoffe A und B können als Mehrfachrückstände kumulativ wirken. Dargestellt sind die Effektstärken der Einzelsubstanzen und mögliche kumulative Wirkungen (Effektadditivität unabhängige Wirkung an verschiedenen Organen; Dosisadditivität additive Wirkung und chemische Wechselwirkungen synergistische und antagonistische Wirkungen) bei Substanzkombination. 5

12 1. Einleitung Interagieren die Substanzen A und B mit unabhängigen Zielstrukturen in verschiedenen Organen, beispielsweise mit einem Rezeptor im Gehirn und einem Enzym in der Niere, so liegen weiterhin die Effekte A und B vor. Wirken die Substanzen hingegen an derselben Zielstruktur, so können sich die einzelnen Konzentrationen bzw. die einzelnen Effekte zu einem Kombinationseffekt aufaddieren. Synergistische oder antagonistische Wirkungen können auftreten, wenn beispielsweise beide Substanzen mit unterschiedlichen Bestandteilen der Reizweiterleitung interagieren oder wenn eine Substanz den Abbau der anderen verstärkt und diese dadurch detoxifiziert. Entsprechend werden drei Formen von Kombinationseffekten angenommen, die von Bliss (1939) erstmalig beschrieben wurden: Dosis-Additivität, Effekt- Additivität und Wechselwirkungen (Interaktionen) (COT 2002). Das Konzept der Dosis-Additivität kann angewendet werden, wenn Wirkstoffe eines Gemisches nicht unabhängig voneinander auf eine Zielstruktur wirken und einen gemeinsamen Effekt auslösen, jedoch nicht miteinander interagieren. Die Wirkstoffe unterscheiden sich damit lediglich in der Potenz ihrer Wirkung, wodurch sich die toxikologische Gesamtwirkung aus der Summe der Einzelpotenzen ergibt. In in vitro Versuchen wird in diesem Zusammenhang oft von Konzentrationsadditivität gesprochen. Ein Begriff, der sich auch in der Ökotoxikologie durchgesetzt hat. Grundsätzlich können zwei verschiedene biologische Konzepte für die Bestimmung und Identifizierung von identischen mechanistischen Wirkungen herangezogen werden. Der Mechanism of Action bezieht sich auf alle molekularen Schritte, beginnend mit der Absorption bis zu einer spezifischen biologischen Reaktion im Zielorgan. Aufgrund fehlender wissenschaftlicher Daten und zu komplexer theoretischer Überlegungen wird das Mechanism of Action-Konzept bei der Risikobewertung nicht eingesetzt (Borgert et al. 2004). Hingegen kann der Mode of Action (MOA) einen singulären kritischen Schritt zur Entstehung eines adversen Effektes oder eine Reihe von Mechanismen, die eine spezifische biologische Reaktion auslösen oder sogar die Wirkung auf ein einzelnes Organ beschreibt. Dabei handelt es sich im engeren Verständnis des Begriffes um toxikodynamische Ereignisse (Guyton et al. 2008). Weitergefasst werden in einigen Definitionen, beispielsweise durch den US EPA Framework for Children s Health Risk Assessment (US EPA 2006), auch toxikokinetische Effekte eingeschlossen. 6

13 1. Einleitung Dosis-Additivität beschreibt derzeit die Mehrzahl der experimentell ermittelten Effekte (Kortenkamp 2009). So führen Kombinationen mit verschiedenen Xenoestrogenen und Antiandrogenen, die in vitro unterhalb Ihrer Non Observed Effect Concentration (NOEC) eingesetzt werden, zu starken estrogenmodulativen bzw. antiandrogenen Effekten, während mit den Einzelsubstanzen keine Wirkungen beobachtet werden konnten (Kjeldsen et al. 2013; Orton et al. 2014; Rajapakse et al. 2002; Silva et al. 2002). Der Kombinationseffekt war dabei konzentrationsadditiv. Ähnliche Ergebnisse konnten bereits in vivo nachgewiesen werden (Tinwell and Ashby 2004). Der chronische Einsatz eines Gemisches aus Androgenrezeptor- Antagonisten in Konzentrationen um ihren NOEC führen in der Nachkommenschaft zu Veränderungen, die auf die Bedeutung von Kombinationseffekten in der embryonalen Entwicklung hinweisen (Christiansen et al. 2009; Christiansen et al. 2012; Hass et al. 2007; Metzdorff et al. 2007). Auch Pestizide mit anderen adversen Endpunkten zeigen dosisadditive Effekte (Hass et al. 2012). Eine Kombination verschiedener Endokriner Disruptoren mit Konzentrationen im Bereich ihrer individuellen ADIs führen hingegen in vivo zu keinen sichtbaren adversen Effekten (Wade et al. 2002). Weisen die Einzelwirkstoffe eines Gemisches voneinander unabhängige Wirkungen auf eine Zielstruktur auf und kommt es zudem zu keiner Interaktion, könnte eine mögliche Mischungstoxizität durch das Modell der Effekt-Additivität abgeschätzt werden. Unabhängige Wirkungen sind dabei nicht grundsätzlich gleichzusetzen mit unterschiedlichen Mode of Action. So können beispielsweise gleichzeitige toxische Wirkungen von Fremdstoffen auf die Steroidbiosynthese (erster Mode of Action) und ein Antagonismus von Fremdstoffen an Androgenrezeptoren (zweiter Mode of Action) (Picard 2003) gemeinsam die männliche Sexualentwicklung beeinflussen; sie wirken folglich abhängig voneinander. Eine Belastung durch Mehrfachrückstände unterhalb der gesetzlich zugelassenen Grenzwerte der Einzelstoffe wurde für die Effekt-Additivität lange als per Definition nicht toxisch wirkend angesehen und Substanzen bei deren ordnungsgemäßem Einsatz keine Relevanz (EFSA 2008) zugeschrieben, da das Gesamtrisiko von Substanzen, die effektadditiv wirken, durch die Dosis des Einzelwirkstoffes bestimmt wird, dessen Differenz zu dem NOAEL am geringsten ist (COT 2002; Dybing et al. 2002). Vor allem der Bereich des NOAEL ist jedoch per Definition nur frei von einem messbaren adversen Effekt und nicht frei von einem Effekt per se. Mathematisch kön- 7

14 1. Einleitung nen 100 Chemikalien, die zu einem 1 % Effekt führen, nach der Berechnung der Effekt- Additivität einen Effekt von 63 % hervorrufen (EFSA 2013a). Biologisch völlig unabhängige Wirkungen von Substanzen treten in der Praxis selten auf. Eine Vorhersage des Kombinationseffektes auf Basis der Effekt-Additivität konnte für Bakterien und einzellige Algen dargestellt werden (Faust et al, 2003). In einer Reihe von Veröffentlichungen zeigt sich, dass die mathematischen Vorhersagemodelle für Dosis-Additivität und Effekt-Additivität ähnliche Kurven abbilden können, eine Unterscheidung folglich nicht immer möglich ist (Hadrup et al. 2013). Der Begriff Wechselwirkung beschreibt jede Art von Interaktion zwischen verschiedenen Wirkstoffen eines Gemisches. Dabei kann ein Wirkstoff die Absorption, Verteilung, den Metabolismus oder die Elimination eines weiteren Wirkstoffes beeinflussen. Kommt es zu einer veränderten toxikologischen Gesamtwirkung, ohne dass sich die Gewebekonzentration der Einzelstoffe ändert, handelt es sich um toxikodynamische Effekte (Cassee et al. 1998). Verstärkt dabei eine Substanz den Effekt der anderen durch Veränderungen der Toxikokinetik oder ist der erwartete Effekt größer als ein erwarteter additiver Effekt ohne dass toxikokinetische Ursachen herangezogen werden können, spricht man von Synergismus. Stört eine Substanz den Effekt der anderen, beispielsweise durch die Stimulation des Metabolismus der anderen Substanz, spricht man von Antagonismus (Hernandez et al. 2013). Toxische Wechselwirkungen zwischen Pestizidrückständen können zwar nicht ausgeschlossen werden, doch liegt derzeit keine empirische Evidenz vor, die ein Risiko des Verbrauchers durch Wechselwirkungen von Pestiziden unterstützen würde. Synergistische Interaktionen sind in der Regel bedingt durch toxikodynamische oder toxikokinetische Wirkungen und treten somit vorwiegend in hohen Konzentrationen auf (Cassee et al. 1998; Christen et al. 2014; EPA 2000; Feron et al. 1995; Wang et al. 2013). Tatsächlich konnten Crofton et al (2005) in vivo zeigen, dass Schilddrüsenhormon beeinflussende Chemikalien in geringeren Dosierungen dem Modell der Dosisadditivität folgen, in höheren Dosierungen hingegen Synergismus angenommen werden kann. Das PPR Panel hat eine PUB-MED-Suche von 1980 bis 2007 durchgeführt (EFSA 2008) und nur sehr wenige wissenschaftliche Belege für eine toxische Interaktion zwischen Chemikalien finden können (Hass et al. 2007; Nesnow et al. 2009; Rajapakse et al. 2004). Toxische Interaktionen synergistischer oder antagonistischer Art 8

15 1. Einleitung konnten dabei nur in Dosen oberhalb des NOAEL gefunden werden. Pestizidrückstände treten in diesen Konzentrationen gewöhnlich nicht auf. Das Risiko wird entsprechend als gering erachtet, kann aber aufgrund fehlender wissenschaftlicher Daten nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Den genannten Veröffentlichungen zu Dosis-Additivität und Effekt-Additivität von Pestiziden ist gemein, dass die darin beschriebenen Versuche gewöhnlich in einem Dosisbereich um den NOAEL durchgeführt werden. Pestizidrückstände treten jedoch für gewöhnlich in sehr geringen Konzentrationen auf, unterhalb der MRL, der gesetzlich festgelegten Grenzwerte für die Einzelsubstanzen. Nach Umrechnung auf tägliche Verzehrsmengen liegen die Expositionen der Verbraucher in der Regel unterhalb der gesundheitsbezogenen Grenzwerte ADI oder ARfD. Da diese, unter Einbeziehung relevanter Sicherheitsfaktoren (in der Regel Faktor 100), weit unterhalb von NOAEL der spezifischen Substanzen liegen, sollte eigentlich davon ausgegangen werden, dass Gemische als nicht gesundheitsschädlich zu betrachten sind, wenn die Summe der Einzelsubstanzen unterhalb der spezifischen ADIs liegt. Die Hypothese zu Niedrigdosiswirkungen von endokrinen Disruptoren (Hirabayashi and Inoue 2011; Kortenkamp et al. 2007; Kortenkamp 2008; Vandenberg et al. 2012; Vandenberg 2014), die von einigen Wissenschaftlern vertreten wird, stellt dies infrage. 1.5 Was versteht man unter Niedrigdosiswirkungen? Der Begriff Niedrigdosiswirkungen ist nicht abschließend definiert. Er umfasst in der Regel mehrere Größenordnungen und wird oft für jede Dosis unterhalb des LOAELs, von manchen Autoren jedoch auch unterhalb des NOAELs verwendet. Oft wird auch die realistische Exposition des Menschen gegenüber Substanzen als Definition herangezogen. Innerhalb dieser Arbeit wird eine Niedrigdosis als jede Dosis unterhalb des etablierten NOAEL definiert. Niedrigdosiswirkungen werden häufig bei synthetischen Chemikalien mit möglichen endokrinen disruptiven Eigenschaften diskutiert (Kamrin 2007). Die EPA definiert alle exogenen Substanzen, die mit der Synthese, der Sekretion, dem Transport, dem Metabolismus, der Bindung oder der Elimination von natürlich im Blut vorkommenden Hormonen interferieren, als Endokrine Disruptoren (Kavlock 1996). In der Europäischen Union wird zur Beschreibung Endokriner Disruptoren vor allem die Definition der WHO herangezogen. Danach ist ein Endokriner Disruptor eine exogene Substanz oder ein Gemisch, die bzw. das 9

16 1. Einleitung Funktionen des endokrinen Systems verändern kann und als Folge adverse Effekte in einem intakten Organismus, dessen Nachkommenschaft oder einer Subpopulation verursacht (EC 1997). Grundidee für mögliche Niedrigdosiswirkungen ist die Annahme, dass bestimmte Stoffe, beispielsweise Liganden von Hormonrezeptoren, in sehr geringen Konzentrationen wirken und Effekte in höheren Konzentrationen nicht oder anders als in niedrigeren Dosierungen auftreten können. Tatsächlich liegt kein linearer Zusammenhang zwischen Effekt und Rezeptorbindung vor, sondern es kommt zu einem besonders stark veränderten Effekt wenn eine geringe Rezeptorbindung durch Liganden vorliegt (Welshons et al. 2003). Bei der toxikologischen Beurteilung von Pestiziden ist die Bestimmung von NOAEL und LOAEL vorgeschrieben. Niedrigere Dosierungen als es dem NOAEL entspricht werden jedoch nicht zwangsläufig untersucht, da von einem Grenzwert ausgegangen wird, unter dem keine adversen Effekte auftreten. Nicht-monotone-Dosis-Wirkungs-Beziehungen werden in der Regel nicht einbezogen (Vandenberg 2014). Studien zur Untersuchung von Niedrigdosiswirkungen an Mäusen und Ratten führen überwiegend zu schwer quantizifier- und reproduzierbaren morphologischen oder biochemischen Veränderungen, ohne dass es zu einer signifikanten Funktionsveränderung kommt (Kamrin 2007; Vom Saal et al. 2005). Zusätzlich wurde eine Vielzahl von in vitro Studien durchgeführt, die beispielsweise im Niedrigdosisbereich Veränderungen der Genepression und eine Bindung an Estrogen- und Androgenrezeptoren nachweisen können (Takai et al. 2001; Vandenberg et al. 2012; Wozniak et al. 2005). Kritiker der Hypothese zu Niedrigdosiseffekten weisen neben der geringen Reproduzierbarkeit vor allem auf die fehlenden Effekte im Tierversuch hin. Eine signifikante Aussagekraft wird auch den in vitro Versuchen nicht zugeschrieben, da sie aufgrund der fehlenden Absorption, Metabolisierung, Speicherung und Exkretion nicht auf Tier und Mensch übertragen werden können (Ashby 2003; Kamrin 2007). 10

17 1. Einleitung 1.6 Warum wird die Nebenniere als Zielorgan zum Studium der toxischen Wirkung von Pestizidgemischen verwendet? Die Nebenniere wird aufgrund ihrer Funktion stark durchblutet, ist lipidreich und verfügt über eine größe Zahl an funktionell differenzierten Enzymen. Diese Eigenschaften machen die Nebenniere für eine Reihe toxischer Substanzen anfällig (Colby H.D. and Longhurst P.A. 1992; Thomas J.A. 1993). Im Säuger tritt die Nebenniere gepaart auf und sitzt dem oberen Pol der Nieren auf. Sie lässt sich in allen Säugetieren in zwei endokrine Drüsenkompartimente unterteilen: das zentrale Mark und die Nebennierenrinde, die das Mark umschließt. Das Nebennierenmark ist ein sympathisches Ganglion, bestehend aus neuroendokrinen chromaffinen Zellen, die während der Entwicklung aus der Neuralleiste in das Drüsengewebe einwandern und als postgangliäre Zellen keine Axone mehr aufweisen (Lüllmann-Rauch 2003). Es bindet und sekretiert Katecholamine, die direkt in die Blutbahn gelangen und an ihren Zielorganen eine Vielzahl von physiologischen und metabolischen Effekten, wie die Veränderungen der Herzrate, des Blutdrucks oder des Glycogenabbaus bewirken können. Das Nebennierenmark ist als Teil des vegetativen Nervensystems über Nervenreize unter direkter Kontrolle des Sympathikus. Toxische Effekte auf das Nebennierenmark treten im Vergleich zu Effekten auf die Nebennierenrinde nur gelegentlich auf (Harvey 1996). Häufig beeinflusst wird hingegen die Nebennierenrinde, ein komplexes und multifunktionelles Organ, das eine Vielzahl von Steroidhormonen produziert (Harvey 1996). Sie ist Teil der sogenannten Hypothalamus-Hypophyse-Nebennieren-Achse. Diese verbindet zusammen mit dem sympathischen System das Gehirn mit der Körperperipherie. Sie ist somit ein wesentlicher Bestandteil des endokrinen Systems und vermittelt die Reaktion des Körpers auf physischen und emotionalen Stress, der die Homöostase des Körpers stört (Papadimitriou and Priftis 2009). Als Reaktion bildet die Nebenniere verschiedene Steroidhormone, durch die das primäre Signal aus dem Gehirn an die peripheren Organe und Körperteile weitergeleitet wird. Zudem wird hier ein bedeutendes Vorläufermolekül für die Bildung von Testosteron und zu einem geringeren Teil für die Bildung von Estradiol synthetisiert. In geringem Maß werden auch direkt Testosteron und Östradiol gebildet. Entsprechend ist die Nebennierenrinde auch indirekt Teil der Hypothalamus-Hypophyse-Gonaden-Achse (HPG-Achse). Dies wird besonders sichtbar beim adrenogenitalen Syndrom (Deaton et al. 1999). Hier führt ein Enzymdefekt in der Steroidbiosynthese in der Nebenniere nicht nur zu Störungen der Stressantwort und des 11

18 1. Einleitung Elektrolythaushaltes, sondern es kommt auch zu morphologischen Veränderungen der Geschlechtsorgane (Deaton et al. 1999). Dies unterstreicht die zentrale Rolle der Nebennierenrinde auch für die Funktion der HPG-Achse. Die Nebennierenrinde lässt sich morphologisch in drei unterschiedliche Zonen unterteilen (Abbildung 2): die äußere Zona glomerulosa (ZG), die mittlere Zona fasciculata (ZF) und die innere Zona reticularis (ZR). Auch funktionell können die drei Zonen unterschieden werden. Während die äußeren und mittleren Zonen Mineralocorticoide (ZG) und Glucocorticoide (ZF) bilden, werden in der ZR und im geringen Maße auch in der ZF vorwiegend C19-Steroide (Androgene) synthetisiert. Die vorwiegend gebildeten Androgene sind dabei Dehydroepiandrosteron (DHEA) und dessen Sulfokonjugat (Takai et al. 2001; Wilkinson et al. 2000). A B Kapsel Zona glomerulosa (ZG) Nebenniere Zona fasciculata (ZF) Zona reticularis (ZR) Medulla Abbildung 2: Schematische Darstellung der Nebenniere im Querschnitt (A) und als Längsschnitt mit Darstellung der einzelnen Zonen (B) Die Zellen der ZG (grün) sind relativ klein, nestförmig angeordnet und enthalten nur wenige Lipidtröpfchen. In der den größten Teil der Rinde ausmachenden ZF (blau) sind diese dagegen zahlreich und dadurch lichtmikroskopisch gut erkennbar. Hier werden die in radiären Strängen angeordneten Zellen von Sinusoiden getrennt. In der ZR (rosa) werden die Stränge netzförmig, die Zellen kleiner und azidophil. Anstelle von Lipiden enthalten die Zellen im Erwachsenen vorwiegend Lipofusingranula (Lüllmann-Rauch 2003; Rosol et al. 2001). 12

19 1. Einleitung Das bedeutendste Mineralocorticoid ist das Aldosteron, dessen Freisetzung von Angiotensin II, Kalium und ACTH stimuliert wird. Aldosteron bindet an spezifische Rezeptoren der renalen Epithelzellen. Es kommt zu einer Reabsorption von Natrium, einer Exkretion von Kalium und einer dem Natrium folgenden Retention von Wasser durch Aquaporine. Eine fehlende Regulation und eine daraus resultierende Erhöhung der Aldosteronkonzentration im Blut sind mit Bluthochdruck und einer Reihe von kardiovaskulären Erkrankungen verbunden (Struthers and MacDonald 2004). Im Vergleich zur ZF und zur ZR treten toxische Effekte in der ZG eher selten auf (Ribelin 1984). Glucocorticoide, beim Menschen Cortisol und bei der Ratte Cortiosteron, sind die mengenmäßig am meisten gebildeten Steroide der Nebenniere. Sie spielen eine Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, die mit der zellulären Stressantwort assoziiert sind, dem Kohlenhydratmetabolismus, einschließlich der Gluconeogenese und der Erhöhung der Glucose im Blut, sowie im Lipid- und Proteinmetabolismus (Vinson 2009). Toxikologisch ist es häufig schwierig, stressbedingte und chemisch induzierte Veränderungen funktionell und morphologisch zu unterscheiden (Rosol et al. 2001), da auch die Stressantwort mit einer erhöhten Bildung von Glucocorticoiden einhergeht und damit zu einer reversiblen Hyperplasie der Zona fasciculata führen kann. DHEA, das primäre Androgen der humanen Nebennierenrinde, stimuliert und aktiviert die endothelial Nitridoxidsynthase (enos). Dies führt zu einer Gefäßdilatation, Verminderung des PAI-1, Stimulierung der Endothelzellproliferation, Reduzierung der Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen, Produktion von ROS, Wiederherstellung der Insulinsensitivität und Verbesserung der Glucoseverfügbarkeit (Traish et al. 2011). Verminderte DHEA-Konzentrationen werden in Verbindung gebracht mit einer Reihe verschiedener Herzerkrankungen (Traish et al. 2011). DHEA wird in der Ratte nur in sehr geringen Mengen gebildet. Estradiol und Testosteron werden nur in geringem Umfang in der Nebenniere gebildet. Ihr Hauptsyntheseort sind die Granulosa-Zellen des Ovars (Estradiol) bzw. die Leydigzellen des Hodens (Testosteron). Der häufigste beschriebene Mechanismus von toxischen Substanzen auf die Nebennierenrinde umschließt die Interaktion mit einem oder mehreren steroidogenen Enzymen (Harvey 1996). Zentrale Enzyme dieses Prozesses sind Cytochrom P450-Enzyme. Eine schematische Veranschaulichung der Steroidbiosynthese in der Nebenniere ist in Abbildung 3 dargestellt. 13

20 1. Einleitung Alle Steroide werden dabei aus dem gemeinsamen Vorläufer Cholesterol gebildet, das entweder aus Acetyl-CoA neu gebildet oder aus der Nahrung aufgenommen und anschließend aktiv durch das StAR-Protein in die Mitochondrien transportiert wird. Dort kommt es durch die Abspaltung der Cholesterinseitenkette durch das Enzym CYPscc (CYP11A1) zur Bildung von Pregnenolon. Welche Steroidhormone gebildet werden, hängt unter anderem von der Enzymausstattung der Zellen der verschiedenen Zonen ab (Miller and Auchus 2011). Die Zona glomerulosa exprimiert kein CYP17, jedoch erhöhte Mengen an 3β-HSD, wodurch es zu einer Bildung von Progesteron kommt, das anschließend über die 21α-Hydroxylase (CYP21) und die 11β-Hydroxylase/Aldosteronsynthase (CYP11B2) in Aldosteron umgewandelt wird (Rainey et al. 2002). Abbildung 3: Vereinfachte Darstellung der humanen Steroidogenese ausgehend von Cholesterol in der Zona glomerulosa, Zona fasciculata und Zona reticularis mit den entsprechend dort exprimierten Enzymen. In der ZR (grün) wird ausgehend von Cholesterol Aldosteron gebildet. In der ZF wird unter anderem mittels CYP17 vorwiegend Cortisol gebildet, während in der ZR bevorzugt DHEA gebildet wird. 14

21 1. Einleitung CYP11B2 ist spezifisch für die ZG und das einzige CYP11B-Enzym, das eine Aldosteronsynthase-Funktion aufweist. Das Isoenzym CYP11B1 sowie CYP17 und CYP21 werden von der ZF exprimiert. Hier kommt es vor allem zur Bildung von Glucocorticoiden, wobei in der Ratte vorwiegend Corticosteron, im Menschen vorwiegend Cortisol gebildet wird. Pregnenolon und Progesteron werden hier durch die 17α-Hydroxylaseaktivität von CYP17 in 17α-Hydroxypregnenolon und 17α-Hydroxyprogesteron umgesetzt und anschließend mittels der 21α-Hydroxylase und der 11β-Hydroxylase (CYP11B1) in Cortisol umgewandelt. Das CYP17 der ZF weist im Gegensatz zur ZR nur eine sehr geringe Aktivität der 17,20-Lyase-Funktion auf. Entsprechend kommt es nur zu einer sehr geringen Bildung von Androgenen. Dies ist auf die fehlende Expression von CYP5 zurückzuführen. In der ZR interagiert CYP5 mit CYP17, wodurch die Lyase-Aktivität stark erhöht wird und aus 17α- Hydroxypregnenolon und 17α-Hydroxyprogesteron vor allem Androgene, besonders DHEA und über eine Sulfotransferase dessen Sulfokonjugat gebildet werden (Abbott and Bird 2009). Die Beeinflussung der Steroidogenese durch toxische Substanzen erfolgt vorwiegend über eine Aktivierung oder Inaktivierung der beteiligten Enzyme über verschiedenste Mechanismen (Harvey 1996). So kann beispielsweise Spironolacton in vivo die Aktivität von CYP11B2 inhibieren (Yin et al, 2012) und Imazalil die Aromatase in humanen Plazentamikrosomen hemmen (Vinggaard 2000), während Atrazin die Aromataseaktivität in H295R-Zellen stimuliert und Propazin die CYP19 (Aromatase) Genexpression erhöht (Sanderson et al, 2000). Auch die in dieser Arbeit verwendeten (Tri)azol-Fungizide nehmen Einfluss auf die Steroidbiosynthese der Nebennierenrinde. 1.7 Beispielsubstanzen: (Tri)azol-Fungizide Die Azole gehören zu der Gruppe der Sterolbiosynthese-Inhibitoren (SBI), die eine bedeutende Fungizidklasse der letzten Jahrzehnte darstellen (Dunkelberg 2006). Im Jahre 2004 betrug der weltweite SBI-Markt einen Wert von 2.2 Milliarden US Dollar, wovon 1.8 Milliarden auf die Triazole fielen. Pilze bilden spezielle Sterole, die sich von pflanzlichen und tierischen Sterolen unterscheiden. SBIs inhibieren die Bildung dieser Sterole, wobei es sich vorwiegend um die Bildung von Ergosterol mittels der Ergosterol-Synthase handelt, und destabilisieren somit die Zellmembran der Pilze, was letztendlich zu deren Absterben führt (Ghannoum and Rice 1999). Diese Sterole sind Bestandteil der Zellmembran vieler Pilzfamilien. Entsprechend haben die SBIs einschließlich der Triazole ein breites Wirkungsspektrum. Eingesetzt werden 15

22 1. Einleitung sie in der Landwirtschaft vor allem zum Schutz von Getreide, Sojabohnen und Früchten. Sie wirken dabei sowohl kurativ als auch eradikativ. Tabelle 1: Nebenniereneffekte von Cyproconazol, Epoxiconazol und Prochloraz nach 28- und 90-Tages- Studien (OECD 407 bzw. OECD 408) in der Ratte. Daten stammen aus den DAR der Wirkstoffe. Dargestellt sind die nebennierenrelevanten Studien, deren eingesetzte Dosierungen, die ermittelten Effekte auf die Nebenniere sowie die entsprechenden NOAEL und LOAEL der Nebennieren der Ratten. w: weiblich; m: männlich. Substanz Cyproconazol Epoxiconazol Prochloraz Studie /Stamm /Referenz 28-Tage- Studie/Wistar- Ratten/Skinner, Luginbühl, Carpy 90-Tage- Studie/Wistar- Ratten/Skinner, Luginbühl, Carpy 90-Tades- Studie/Wistar- Rats/Gersprach 4-Wochen- Studie (Dosisfindungss tudie)/ Wistar Rat- ten/tox Tage- Studie/Wistarratten/TOX Tages- Studie/Wistar- Ratten/ TOX Tage/Wistar- Ratten/Lancaster, Shaw 90-Tage- Studie/Wistar- Ratten/Lancaster& Spaw Eingesetzte Dosierungen 0,10, 30, 100, 300, 1000 ppm 0, 20, 80, 320 ppm 0, 20, 350, 700, 1400 ppm 0, 250, 1000, 4000 ppm 0,30,90, 270, 800 ppm 0, 500, 1000, 1500, ,25, 100, 400 mg/kg bw/tag (gavage) 0, 6, 25, 100 mg/kg bw/tag (gavage) Effekte auf die Nebenniere keine Effekte auf die Nebenniere, erhöhtes Lebergewicht, erhöhtes Körpergewicht keine Effekte auf die Nebenniere; erhöhtes Lebergewicht nicht signifikante Erhöhung des Nebennierengewichts in f, histopathologische Veränderungen des Cortex der Nebenniere in den zwei höchsten Dosierungen in w und m: Einzelzellnekrosen, Ceroid Ablagerung, Fetttröpfchenbildung Verringerung des absoluten und relativen Gewichts bei m und w bei 4000 ppm; Histopathologisch: Lipidablagerungen in den cortikalen Zellen der m, regressive Transformation der externen cortikalen Zone bei w verringertes Nebennierengewicht; keine histologischen Veränderungen Verringerung des absoluten und relativen Gewichts der Nebenniere; Histopathologische Veränderungen ab 1500 ppm: adaptive diffuse Liptideposition in der Nebennierenrinde und regressive Transformation der Zellen der inneren Rinde in w NOAEL (mg/kg KG pro Tag) Lowest dose with effects - > no NOAEL erhöhtes Nebennierengewicht keine Effekte auf die Nebenniere - - LOAEL (mg/kg KG pro Tag) 35 16

23 1. Einleitung Cyproconazol und Epoxiconazol gehören zu der Gruppe der Triazolfungizide (Drei Stickstoffmoleküle im Azolring), während Prochloraz zu der Gruppe der Imidazole (Zwei Stickstoffmoleküle im Azolring) gezählt wird. Die chemischen Strukturen der Substanzen sind im Anhang dargestellt. In Nicht-Ziel-Organismen (Säugetiere) wirken (Tri)azole primär toxisch auf die Leber und induzieren unter anderem auch eine Reihe von fremdstoffmetabolisierenden Enzymen. Da die in dieser Arbeit nicht untersucht wird, wird von einer detaillierten Darstellung abgesehen. Die klassischen ADME-Daten der in dieser Arbeit eingesetzten (Tri)azole sind im Anhang, ihre Toxizität auf die Nebenniere in der Tabelle 1 dargestellt. Die Nebennierentoxizität kann den Draft Assessment Reports (DARs) der Zulassungsanträge (RMS Germany 2013; RMS Ireland 2010; RMS Ireland 2011) entnommen werden. Draft Assessment Reports sind von den Behörden verfasste öffentlich zugängliche Dokumente, die Zusammenfassungen der von den Wirkstoffherstellern im Zuge des Zulassungsantrags duchgeführten Studien enthalten. 1.8 Was sind bekannte nebenierenrelevante adverse Effekte von (Tri)azolfungiziden? Zwei Wirkmechanismen, über die (Tri)azole toxisch wirken, könnten für die Nebenniere von Bedeutung sein (Abbildung 4). (Tri)azole können nicht nur die Ergosterol-Synthase sondern auch eine Reihe von Cytochrom-P450 Enzymen, darunter solche, die an der Steroidbiosynthese beteiligt sind, inhibieren. Verschiedene (Tri)azole hemmen vor allem die zuvor bereits beschriebenen CYP19 (Aromatase) und CYP17 Enzyme mit verschiedenen Spezifitäten (Sanderson et al. 2002; Vinggaard et al. 2006a). Dies wird in Zusammenhang gebracht mit veränderten Hormonkonzentrationen in in vitro sowie in in vivo Untersuchungen (Goetz et al. 2009). Beispielsweise inhibieren Cyproconazol, Epoxiconazol und Prochloraz CYP19 im Aromatase-Assay mit verschiedenen Spezifitäten (Sanderson et al. 2002; Trosken et al. 2006). In vitro Untersuchungen mit Tebuconazol, Epoxiconazol und Prochloraz in H295R- Zellen, die ein Modellsystem für die Untersuchung der Steroidogenese darstellen, führen zu einer Akkumulation von Progesteron und einer Verringerung von Testosteron und Estradiol im Zellkulturüberstand, was auf eine Inhibierung von CYP17 hinweist (Hadrup et al. 2013; Kjaerstad et al. 2010; Nielsen et al. 2012). Zudem kann Prochloraz die Konzentration von Cortisol, Corticosteron und Aldosteron verringern (Ohlsson et al. 2009; Winther et al. 2013). 17

24 1. Einleitung Mit verschiedenen (Tri)azolen behandelte trächtige Ratten weisen eine verlängerte Gestationszeit auf, die mit einem erhöhten Serumprogesteron- und Testosteronlevel und einer Verringerung der Estradiolkonzentration im Serum einhergeht (Taxvig et al. 2007; Taxvig et al. 2008). Zudem können (Tri)azole mit verschiedenen nukleären Rezeptoren interagieren. Dadurch kann die Wirkung von endogenen Hormonen nachgeahmt (Agonisten) oder gehemmt (Antagonisten) werden. Im Zytoplasma der Zielzelle lokalisierte Hormonrezeptoren, wie z.b. der Estrogenrezeptor (ER) oder der Androgenrezeptor (AR), dimerisieren nach Bindung eines Liganden und regulieren die Genexpression als Antwort auf eine hormonelle Exposition. Hormonabhängige Zielgene interagieren dabei über ihre Hormone Responsive Elements (HRE) entweder direkt mit den dimerisierten Rezeptoren oder über weitere Transkriptionsfaktoren (Shanle and Xu 2011). Verschiedene (Tri)azole interagieren mit unterschiedlichen Spezifitäten mit nukleären Hormonrezeptoren wie dem AR, dem ER oder dem Progesteronrezeptor (PR) (Kjaerstad 2007; Kojima 2004; Mankame et al. 2004; Orton et al. 2011). Abbildung 4: Toxischer Wirkmechanismus von (Tri)azolen. Verschiedene (Tri)azole können die Aktivität (A) unterschiedlicher Enzyme der Steroidbiosynthese hemmen bzw. (B) mit verschiedenen nukleären Rezeptoren interagieren und somit die abhängigen Genexpressionen oder Signaltransduktionen verändern. Beeinflusst wird dabei in vivo vor allem die Entwicklung des Fetus oder Embryos (Christiansen et al. 2012; Hass et al. 2012; Taxvig et al. 2007; Taxvig et al. 2008). Die Funk- 18

25 1. Einleitung tion dieser Rezeptoren ist im Zusammenhang mit der Nebenniere jedoch nicht bekannt. Die Nebenniere exprimiert AR, ERβ, PR und in geringen Mengen auch ERα (de Cremoux P. et al. 2008; Rossi et al. 1998). Veröffentlichungen bezüglich adverse Effekte von Pestiziden oder anderen Fremdstoffen auf die Nebenniere, die durch nukleäre Rezeptoren vermittelt werden, sind bisher nicht veröffentlicht worden. Zudem wurden nur wenige Untersuchungen zum Einfluss von vermutlich rezeptorvermittelten Einflüssen von Steroidhormonen auf die Nebenniere durchgeführt. Eine Inkubation von adrenocorticalen H295R-Zellen mit Estradiol und Progesteron führt zu keiner Veränderung des Cortisolspiegels im Überstand (Jaroenporn et al. 2008). Für Testosteron existieren Veröffentlichungen mit divergierenden Ergebnissen, wobei zumindest in einer Arbeit eine testosteronabhängige Verringerung des Cortisolspiegels im Überstand zu verzeichnen war (Jaroenporn et al. 2008; Kumar et al. 2009). Ob hierbei die entsprechenden Rezeptoren eine vermittelnde Rolle spielen, ist jedoch unklar. Estradiol hat im lebenden Organismus einen Einfluss auf den Cortisolspiegel durch Beeinflussung des Hypophysenvorderlappens und des Hypothalamus (Handa and Weiser 2014). Eine direkte Interaktion mit der Nebenniere ist nicht bekannt. Neben den oben genannten Rezeptoren können einige (Tri)azole auch mit nukleären Rezeptoren interagieren, die primär in dem Fremdstoffmetabolismus involviert sind, wie beispielsweise dem Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AhR) oder Konstitutiv-Androstan-Rezeptor (CAR). Auch hier zeigen sich unterschiedliche Spezifitäten. Während CAR weder in der Nebenniere der Ratte noch in der des Menschen exprimiert wird, kann der AhR in beiden Organismen nachgewiesen werden. Die Nebenniere wird allgemein als wenig aktiv bezüglich des Fremdstoffmetabolismus angesehen. Eine Aktivierung des AhR geht in der Regel mit der erhöhten Expression einer Reihe von fremdstoffmetabolisierenden Enzymen einher, die, in Abhängigkeit des vorhandenen Fremdstoffs, zu einer Detoxifikation oder eine Toxifikation des Fremdstoffs führen und somit Einfluss auf den adversen toxischen Effekt des Fremdstoffs nehmen können. 1.9 In vitro Modell für Kombinationseffekte auf die Nebenniere Die Vielzahl an potenziellen Kombinationen von Pestizidrückständen macht eine Analyse von Pestizidgemischen, so wie sie in regulatorischen Toxizitätstests für die einzelnen Wirkstoffe durchgeführt werden, schwierig. Eine adäquate Methode wäre die Entwicklung einer Batterie von in vitro Tests, die adverse Effekte präzise vorhersagen. Ein primäres Ziel von toxischen Substanzen ist die Steroidogenese der Nebennierenrinde. Ein geeignetes in vitro Modell zur 19