Chromosomendarstellung und -identifizierung

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1 Chromosomendarstellung und -identifizierung Bei den 46 Chromosomen des Menschen unterscheidet man 22 homologe Autosomenpaare und 2 Geschlechtschromosomen, das homologe XX-Paar im weiblichen und das nicht-homologe XY-Paar im männlichen Genotyp. Zellen, die Paare homologer Chromosomen enthalten, werden diploid genannt. Keimzellen, also die Eizelle bei der Frau oder ein Spermium beim Mann, haben dagegen von jedem Chromosom nur eine Kopie und sind haploid. Diese Keimzellen verschmelzen bei der Befruchtung zu einer diploiden Zelle. Von jedem Chromosomenpaar einer diploiden Körperzelle stammt also ein Chromosom von der Mutter und eines vom Vater. Um den Karyotyp zu bestimmen werden Chromosomen nach ihrer Größe, der Lage der Zentromers und ihrem spezifischen Bandenmuster geordnet. Da Abweichungen von der Norm oft zu Krankheiten führen, ist die Analyse der charakteristischen Merkmale eines Chromosoms ein wichtiger Gegenstand der Humangenetik. Für solche Untersuchungen eignen sich Chromosomen der Metaphase der Mitose, da das Chromatin zu diesem Zeitpunkt maximal kondensiert ist und die Chromosomen lichtmikroskopisch sichtbar sind. Die Chromosomenpaare werden durch geeignete Präparationsmethoden und Bänderungstechniken, die die Chromosomen anhand von Helligkeitsunterschieden entlang ihrer Längsachse unterscheiden, dargestellt und geordnet. Präparation von Chromosomen Wegen ihrer starken Kondensierung sind Metaphase-Chromosomen besonders gut für die Bänderungstechniken geeignet. Sie werden aus Zellkulturen gewonnen. Für medizinische Routineuntersuchungen menschlicher Chromosomen werden aus wenigen Millilitern heparinisierten Blutes Lymphozyten isoliert. Die überwiegende Mehrheit dieser Lymphozyten befindet sich jedoch in der mitotischen Ruhephase G0. In Kultur lassen sich diese Zellen mit pflanzlichen Glykokoproteinen, die die Mitose stimulieren, wie das Mitogen Phytohämagglutinin (PHA), zur Teilung anregen. Ungefähr 40 Stunden nach PHA-Stimulierung beginnen die Zellteilungen, die nach 72 Stunden ein Maximum erreichen. Um die maximal kondensierten Chromosomen der Metaphase zu gewinnen, wird der Kultur zu diesem Zeitpunkt das Spindelgift Kolchizin zugegeben, das die Mitose im Metaphasestadium arretiert. Kolchizin löst den Spindelapparat aus Mikrotubuli auf und verhindert so das Auseinanderweichen der Schwesterchromatiden Alle Zellen, die während dieser Inkubation in die Mitose eintreten, bleiben daher in der Metaphase arretiert. In zwei weiteren Schritten wird das Chromatin durch Zugabe von hypotoner Salzlösung gequollen damit sich die Chromosomen ausbreiten und dann mit einem Gemisch aus Essigsäure und Methanol fixiert. Die Suspension wird auf einem Objektträger aufgetropft und kann nun mit verschiedenen Techniken angefärbt werden. Die Chromosomenfeinstruktur wird in der Regel mit einer 1000-fachen Vergrößerung beurteilt. Im mikroskopischen Bild liegen die Chromosomen ungeordnet vor. Um den Karyotyp zu erstellen, werden die Chromosomen über eine Fotografie oder ein Computerbild erfasst und nach Größe, Lage des Zentromers und Bandenmuster geordnet. Entsprechende Software unterstützt die Erstellung der Karyogramme. Diesbezüglich ist anzumerken, dass es bislang kein Computerprogramm gibt, das, basierend auf dem Bandenmuster, ein korrektes Karyogramm erstellt. Deshalb hängt das Ergebnis der Bänderungsanalyse (s. u.) entscheidend von den Kenntnissen des entsprechend geschulten Personals ab. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 1

2 Bänderungstechniken Die fixierten Chromosomen werden angefärbt und anhand der Bänderung, also der Helligkeitsunterschiede entlang ihrer Längsachse, analysiert und geordnet. GTG-Bänderung Das am weitesten verbreitete Bänderungsverfahren, das für die Routinediagnostik eingesetzt wird, ist die so genannte GTG-Bänderung. Es handelt sich hier um so genannte G-Bänder, durch Behandlung mit Trypsin und Färben mit dem Farbstoff Giemsa (GTG). Dieses Verfahren unterscheidet Chromosomen anhand individueller heller und dunkler Bereiche.Die entstehenden dunklen Banden sind in der Regel AT-reich und dichter gepackt als die hellen. Eine Standardpräparation von Metaphase-Chromosomen, wie sie für diagnostische Zwecke durchgeführt wird, sollte, bezogen auf einen haploiden Chromosomensatz, eine Bandenzahl von mindestens 400 auflösen. Andere Analysemethoden wie die GBG- Bänderung (s. u.) erreichen Bandenzahlen von GTG_Bänderung_männlicher_Kary otyp Abb. 2.9 S Auflage GTG-Bänderung. Männlicher Karyotyp (46,XY) mit etwa 460 Banden pro haploidem Chromosomensatz, entspricht einer Auflösung von 5Mb bzw. 5000kB Die maximale Bandenauflösung z.b. bei der Abklärung einer Intelligenzminderung ist bei speziellen Kulturverfahren aus Blutlymphozyten am besten. Es sollte bei solchen Fragestellungen eine Bandenzahl von über 400 angestrebt werden. Die Auflösung einer möglicherweise voraus im Rahmen einer pränatalen Diagnostik durchgeführten Chromosomenanalyse ist hierfür keinesfalls ausreichend.fluoreszenz-in-situ-hybridisierung (FISH) FISH ist eine essenzielle Technik um Chromosomen und Chromosomensegmente mit hoher Auflösung darzustellen. Als Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (fluorescence in situ hybridization, FISH) bezeichnet man eine Methode, die klassische Zytogenetik mit molekularbiologischer Technologie verbindet. Für diagnostische Anwendungen wird sie zunehmend in Ergänzung zu den traditionellen Bänderungstechniken eingesetzt, da das Auflösungsvermögen besser ist und Chromosomen in allen Zellzyklusphasen, also auch während der Interphase, analysiert werden können. Darüber hinaus wird FISH intensiv in der Grundlagenforschung, besonders in der Tumorgenetik eingesetzt. FISH beruht auf der spezifischen Bindung markierter, einzelsträngiger DNA-Sonden an fixierte, chromosomale DNA. Diese Bindung wird durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen und hat im Vergleich zu den Bänderungstechniken eine sehr hohe Auflösung von 100kb bzw. 0,1Mb. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 2

3 FISH basiert auf der Fähigkeit loureszenzmarkierter, einzelsträngiger DNA (Sonde) selektiv an komplementäre Bereiche fixierter Chromosomen zu binden -- d.h. mit ihnen zu hybridisieren. Die fluoreszierenden, spezifisch an eine bestimmte Region der Chromosomen gebundenen DNA-Sonden werden mit Mikroskopen detektiert, die mit speziellen Filtern ausgerüstet sind. Mittlerweile existiert eine ganze Reihe von Fluorochromen, die durch verschiedene Wellenlängen des Lichts angeregt werden und Licht verschiedener Wellenlängen emittieren. Das eröffnet die Möglichkeit, verschieden markierte DNA-Sonden simultan zu verwenden. FISH Abb Seite Auflage Nachweis einer Mikrodeletion auf Chromosom 22q11 Hybridisierungsansatz besteht aus einer Kontrollsonde, die die Bande 22q13 nachweist und der Überprüfung der Versuchsdurchführung dient. Sie ist grün dargestellt. Außerdem ist eine zweite, rot erscheinende Sonde, enthalten. Diese hybridisiert mit der Region 22q11, die auf die Mikrodeletion getestet werden soll. a Unauffälliger Normalbefund. Sowohl die Kontrollsonde (grün) als auch die Sonde für die Mikrodeletion 22q11 (rot) haben mit beiden Chromosomen 22 hybridisiert. b Nachweis einer Mikrodeletion 22q11. Die Kontrollsonde (grün) hat mit beiden Chromosomen 22 hybridisiert. Die Sonde für den Nachweis der Mikrodeletion 22q11 (rot) konnte dagegen nur an die nichtdeletierte Sequenz des gesunden Chromosoms binden. DNA-Untersuchung Diagnostische Anwendung beim Menschen In der Regel wird DNA aus peripherern Blutleukozyten (ca. 5ml EDTA-Blut) als Analysematerial verwendet. Die DNA wird dabei postnatal durch Blutabnahme oder pränatal aus Zellen des Chorionzottengewebes oder Fruchtwassers gewonnen. Das Ziel der molekulargenetischen Diagnostik ist der Nachweis oder der Ausschluss einer konkreten krankheitsverursachenden Sequenzveränderung in der DNA. Da die genetische Ausstattung eines Individuums in allen Körperzellen gleich ist, kann man mit der DNA aus diesen Zellen auch Fragestellungen zu Krankheiten bearbeitenwerden, die von Seiten der Klinik nicht die Blutzellen sondern z.b. den Darm, betreffen. Grundlegende Verfahren zur Analyse genomischer DNA DNA Isolierung Zur Isolierung der DNA aus Blutzellen müssen zunächst die kernhaltigen Zellen einer Blutprobe angereichert werden. Dies erfolgt durch Lyse der Erythrozyten und Abzentrifugation der kernhaltigen weißen Blutzellen. Anschließend geht folgendermaßen vor: Mittels hochmolekularer Seifen (SDS: Sodiumdodecylsulfat) werden die Zellmembranen aufgelöst. Die in der Zelle vorliegenden Proteine sowie die der DNA anhaftenden Proteine (Chromosomengerüst und Histone) werden durch einen proteolytischen Verdau mit Proteinase K zerstört. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 3

4 Durch eine anschließende Ethanolfällung oder Adsorption an eine Trägersubstanz erhält man genomische DNA Die DNA kann in einer gepufferten Lösung viele Jahre aufbewahrt werden und für weitere genetische Analysen verwendet werden. Die Anzahl der kernhaltigen Zellen einer Blutprobe ist limitiert und in jeder dieser Zellen sind nur zwei Kopien (zwei Allele) einer spezifischen Gensequenz enthalten, von der z.b. bei dominanten Erkrankungen nur auf einem Allel eine Mutation liegt. Das bedeutet, dass für die Mehrzahl der Analyseschritte im Wesentlichen zwei Hindernisse überwunden werden müssen. Zum einen muss die zu analysierende Sequenz in ausreichenden Mengen vorhanden sein, zum anderen muss die zu analysierende Sequenz von den Sequenzabschnitten, die in der Analyse nicht von Interesse sind, getrennt vorliegen. Beide Probleme werden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, s.u.) gelöst. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mit Hilfe dieses Verfahrens können spezifische DNA-Abschnitte millionenfach vervielfältigt werden und stehen dann für weitere Analyseverfahren zur Verfügung. Diese Methode kann nur für bekannte DNA-Sequenzen angewendet werden, da sie die synthetische Herstellung von kurzen DNA-Abschnitten, sogenannten Oligonukleotiden (Primer), voraussetzt. Die PCR wird in speziell hierfür entwickelten PCR-Geräten (Thermocycler) durchgeführt: Die DNA wird zunächst thermisch denaturiert, so dass sie einzelsträngig vorliegt. Durch eine anschließende Temperatursenkung kommt es zur Anlagerung zweier spezifischer PCR-Primer an ihre komplementären Zielsequenzen (ca Nukleotide) auf den DNA-Einzelsträngen. Dabei muss es einen Forward- und einen Reverse-Primer geben, die jeweils an einem der beiden komplementären DNA- Strängen hybridisieren und deren beiden 3 -Enden die zu amplifizierende Sequenz einklammern (Abb. Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.). Mit Hilfe einer spezifischen thermostabilen DNA-Polymerase, die in ca. 35 Zyklen an den 3 -Enden der Primer immer wieder eine DNA-Synthese startet, wird die zwischen den Primern liegende Zielsequenz millionenfach exponenziell amplifiziert. Dafür müssen im Reaktionsansatz die 4 Desoxynukleotide (dntps) datp, dttp, dctp und dgtp vorliegen. Die optimale Synthesetemperatur für die DNA-Polymerase liegt bei ca. 72 C. Der Zyklus von Denaturierung, Primer-Anlagerung und Synthese dauert durchschnittlich ca Minuten, so dass innerhalb von 1--2 Stunden die Gewinnung einer großen Menge der gewünschten DNA-Sequenz möglich ist. Abblauf_PCR Abb 1.42 S Auflage Ablauf einer PCR. a Zunächst wird der DNA-Doppelstrang durch Erhitzen denaturiert. Die anschließende Temperatursenkung führt zu einer Anlagerung der 3 -und 5 -Primer an die Zielsequenzen der einzelsträngigen DNA. Mit Hilfe einer DNA-Polymerase kann der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt synthetisiert werden. Die entstandenen Doppelstränge werden danach durch Erwärmen wieder getrennt und die Reaktion wird wiederholt. b Die im 1. Zyklus hergestellten DNA-Stränge weisen ein definiertes 5 -Ende (entspricht dem Primer) und ein nichtdefiniertes 3 -Ende auf. Alle folgenden Tochterstränge haben eine einheitliche definierte Länge. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 4

5 DNA-Sequenzierung Durch die DNA-Sequenzierung kann die Abfolge der DNA-Basen (Nukleotid) bestimmt und somit eine Sequenzvariation nachgewiesen werden. Analog zur PCR erfolgt auch hier eine DNA-Synthese ausgehend von einem Primer, der an seine entsprechende Zielsequenz gebunden hat. Dem PCR-Ansatz sind jedoch, neben den normalen vier Nukleotiden Adenin, Thymin, Guanosin und Cytosin, in einem geringen Anteil Nukleotide beigemischt, die keine 3 -OH Gruppe tragen, so genannte Didesoxyribonukleotide (ddntps). Die vier Didesoxyribonukleotide sind jeweils mit Floureszenzfarbstoffen unterschiedlicher Farbe markiert (z.b. Adenin: grün; Cytosin: blau), Wird ein solches Nukleotid in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut, kann die Synthese nicht weitergeführt werden. Es fehlt die 3 -OH Gruppe, die für die Ausbildung einer Esterbindung zum nächsten Nukleotid notwendig wäre. Da alle vier Nukleotide zu einem geringen Anteil auch in ihrer Didesoxy-Form vorliegen, werden diese Nukleotide statistisch an allen Positionen eingebaut. Das bedeutet, die DNA-Synthese wird an allen Positionen abgebrochen. Trägt man die PCR-Produkte einer solchen Sequenzierungsreaktion in einer Gelelektrophorese auf, kann man DNA-Fragmente mit jeweils einem Nukleotid Längenunterschied nachweisen. Erfolgt der Syntheseabbruch durch den Einbau eines blau markierten Didesoxycytosins, so wird der Laser an dieser Stelle eine blaues Signal aufzeichnen. Folgt in der Sequenz an der nächsten Position ein Adenin, so wird sich hier ein grünes Signal finden. Aus der Farbabfolge der Farbsignale lässt sich auf diesem Wege auf die Nukleotidsequenz rückschließen. Diese Sequenzierungs-Verfahren sind heutzutage-in einem hohen Maße automatisiert: Die Gelelektrophorese zur Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgt in einer Kapillare, die Farbabfolge wird mit Hilfe eines Lasers bestimmt. DNA_Sequenzierung Abb S Auflage DNA-Sequenzierung in einem Reaktionsansatz. a Alle vier Didesoxyribonukleotide sind im Reaktionsgemisch enthalten, jedoch mit unterschiedlichen Farbstoffen Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 5

6 fluoreszenzmarkiert. Die Reihenfolge der Fluoreszenz in der Elektorphorese-Kapillare erlaubt die Bestimmung der DNA-Sequenz. b Beispiel einer ausgedruckten Sequenzierung. In der Analyse werden immer die beiden allelischen Genkopien (eine vom Vater und eine von der Mutter) gleichzeitig analysiert. In der Analyse können sich bei vorliegen einer Mutation folgende Möglichkeiten ergeben: Liegt in einer Genkopie eine Mutation im Sinne eines Austausches eines Nukleotids vor wird der Laser für diese Position zwei Signale aufzeichnen, man bezeichnet diese Position als heterozygot für diese beiden Nukleotide. Liegt die gleiche Mutation in beiden Genkopien vor, bezeichnet man diese Position als homozygot mutiert. Fehlt in einer Genkopie eines oder mehrere Nukleotide (Deletion) verschiebt sich die Nukleotidabfolge, ab der Deletion sind alle Signale doppelt. Da von den beiden Genkopien unterschiedliche im Laser detektiert weden. Restriktionsverdau von DNA Restriktionsenzyme spalten doppelsträngige DNA sequenzspezifisch. Liegen sich die Schnittstellen in den beiden DNA-Strängen unmittelbar gegenüber, entstehen sog. blunt ends. Sind die Schnittstellen um einige Nukleotide gegeneinander versetzt, entstehen überhängende Enden, sog. sticky ends. Die Erkennungssequenz ist für jedes Restriktionsenzym spezifisch, die Längen variieren zwischen 4 8 Basenpaaren. Eines der bekanntesten Restriktionsenzyme wurde aus dem Bakterium E.coli isoliert und trägt daher den Namen EcoRI. Bakterien benutzen ihre Restriktionsenzyme, um z.b. durch Phagen importierte DNA zu zerstören.. Restriktionsenzyme erkennen also bestimmte Sequenzabfolgen und durchtrennen in einem Hydrolyseschritt den DNA-Doppelstrang an dieser Stelle. Schneidet man menschliche DNA z.b. mit den oft schneidenden Restriktionsendonukleasen EcoRI, BamHI und HindIII, so entstehen ca. 1 Million Fragmente unterschiedlicher Länge. Gelelektrophorese Um DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (z.b. nach Restriktionsverdau) nach ihrer Länge zu ordnen, werden sie mittels der Gelelektrophorese aufgetrennt. Bei diesem Verfahren wird ein Gemisch aus DNA-Fragmenten in die Vertiefungen (Slots) eines Agarose- oder Acrylamidgels pipettiert. Das Gel befindet sich in einer Salzlösung und mit Hilfe von Elektroden wird ein Spannungsfeld aufgebaut. Die DNA-Fragmente tragen negative Ladungen, was im elektrischen Feld dazu führt, dass sie sich in Richtung der Kathode bewegen. Der ungehinderten Bewegung steht jedoch die Agarose im Wege. Kleine DNA-Fragmente werden ihren Weg durch das Gel schneller finden als die großen DNA-Fragmente. Es erfolgt also im elektrischen Feld eine Auftrennung der DNA- Fragmente entsprechend ihrer Länge. Die Sichtbarmachung der DNA-Fragmente erfolgt über interkalierende fluoreszierende Substanzen (z.b. Ethidiumbromid) oder durch radioaktive Markierung und anschließende Detektion der DNA. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 6

7 Verfahren_Gelelektrophorese Abb S Auflage Verfahren der Gelelektrophorese. Abbildung a zeigt eine Gelkammer zur Durchführung einer Gelelektrophorese. Abbildung b zeigt ein gelaufenes Gel mit den durch Ethidiumbromid sichtbar gemachten DNA-Banden verschiedener Größe. Southern-Blot-Hybridisierung. Ziel der Southern-Blot-Hybridisierung ist es, mit Hilfe eines kurzen, radioaktiv markierten DNA-Fragments einer bekannten Sequenz (DNA-Sonde), entsprechende komplementäre genomische DNA-Abschnitte aufzufinden. Aus Zellkernen isolierte genomische DNA muss man sich wie ein unordentliches Knäuel Wolle vorstellen. Wenn man sich für ein bestimmtes Gen interessiert, benötigt man eine Methode, diesen Faden zu entwirren und mit laborchemischen Methoden in handliche Abschnitte zu sortieren. Eine Möglichkeit ist, mit Hilfe von Restriktionsenzymen (s.o.) den DNA-Faden in Fragmente zu zerschneiden und diese per Gelelektrophorese (s.o.) der Länge nach aufzutrennen. Interessiert man sich für ein spezifisches Gen auf eine DNA-Fragment bestimmter Länge so wird dieses Fragment mit anderen Fragmenten gleicher Länge in der Elektrophorese an einem Ort laufen. Um das gesuchte DNA-Fragment sichtbar zu machen bedient man sich der Southern-Blot Hybridisierung. Für den Hybridisierungsschritt muss nun die durch Gelektrophorese aufgetrennte DNA auf ein Filterpapier gebunden werden. Hierzu wird die Agarose auf ein Pufferreservoir gelegt, auf die Agarose legt man das Filterpapier und durch Kapillarkraft oder durch Elektroblotting (mit Hilfe einer angelegten Spannung) werden die DNA-Fragmente aus der Agarose auf das Filterpapier transportiert (geblottet). Die Poren dieses Filterpapiers sind so eng, dass die DNA-Fragmente darauf hängen bleiben. Bei der Hybridisierungsreaktion wird die auf dem Filter gebundenen DNA mit der radioaktiv markierten DNA-Sonde in einer Hybridisierungslösung inkubiert. Innerhalb von mehreren Stunden Reaktionszeit sucht sich das markierte DNA-Fragment die zu ihm komplementäre DNA-Sequenz auf dem Filterpapier und bindet an diese, indem ein DNA- Doppelstrang ausgebildet wird. Zur Detektion legt man einen unbelichteten Film auf das Filterpapier und lässt diesen durch die radioaktiv markierte Sonde belichten. Mit dieser Methode kann also die Frage beantwortet werden, ob in der genomischen DNA eines Individuums oder Patienten ein bestimmtes Gen oder ein bestimmter Genabschnitt vorhanden ist. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 7

8 Verfahren_Southern_Blot Abb S Auflage Verfahren des Southern-Blot. Zunächst wird die genomische DNA durch Restriktionsenzyme in Fragmente gespalten. Diese Fragmente werden durch eine Gelelektrophorese entsprechend ihrer Länge aufgetrennt und danach auf einen Filter transferiert. Auf diesem Filter findet die Hybridisierungsreaktion mit der radioaktiv markierten Sonde statt, die durch Aufbringen eines strahlungssensitiven Films nachgewiesen werden kann. Oligonukleotid-Ligation (OLA) Binden zwei Oligonukleotide unmittelbar nebeneinander an die DNA, so können ihre beiden benachbarten Enden durch eine Ligasereaktion miteinander verbunden werden. Diese Reaktion findet jedoch nur statt, wenn die Enden der beiden Oligonukleotide zur DNA, die entweder der Wiltyp- oder der mutierten Sequenz entspricht, komplementär sind. Bei diesem Verfahren müssen zwei Ligasereaktionen durchgeführt werden, eine mit der Wildtyp-DNA und eine mit der mutierten DNA. Hierzu werden drei verschiedene Oligonukleotide benötigt: Ein Forward-Oligonukleotid ist komplementär zur Wildtyp-Sequenz die Reverse- Oligonukleotide unterscheiden sich in Sequenz und Länge in dem Sinne, dass eines die Wildtyp-Sequenz und das andere die mutierte Sequenz erkennt. Nach dem Binden der Oligotnukleotide erfolgt die Ligasereaktion, anschließend werden die zu einem langen Oligonukleotid verbundenen Primer mittels Gelelektrophorese nachgewiesen. Eine Differenzierung der beiden Ligationsprodukte, z.b. bei heterozygotem Vorliegen der Mutation, erfolgt durch die unterschiedliche Länge der beiden verschiedenen Ligationsprodukte, die durch die unterschiedliche Länge der Reverse-Primer vorgegeben worden ist. Oligonukleotid_Ligierung Abb S Von dieer Abbildung fehlt nur Teil a. Auflage Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 8

9 Verfahren der Oligonukleotid-Ligierung. A: Liegt die Wildtyp-Sequenz vor, so werden die Oligonukleotide 1 und 2 zu einem größeren Oligonukleotid ligiert. Liegt eine Mutation vor, so werden die Oligonukleotide 1 und 3 zu einem größeren Oligonukleotid ligiert. In einer Gelelektrophorese können die entstandenen Oligonukleotide durch ihren Längenunterschied differenziert werden. B: Das Verfahren der Oligonukleotidligation zur Diagnostik der Cystischen Fibrose. In der untersten Spur ist ein unauffälliges Peakmuster für 11 Mutationen dargestellt, die alle ein einem PCR-Ansatz analysiert werden. In der obersten Spur erkennt man einen zusätzlichen Peak für die Mutation deltaf508. Da der normale Peak ebenfalls vorhanden ist, deutet dies auf das Vorliegen der Mutation in heterozygoter Form hin. In der mittleren Spur ist kein normaler Peak mehr vorhanden, die Mutation liegt in homozygoter Form vor. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 9

10 Verfahren zum Nachweis genomischer Deletionen Genomische Deletionen, die einzelne Exons oder größere Abschnitte eines Gens mit mehreren Exons umfassen, sind besonders bei Genen mit sehr vielen Exons ein nicht seltener Mutationsmechanismus. Die Analyse dieser Deletionen durch Methoden, denen eine PCR vorausgegangen ist, wird in der heterozygoten Situation (z.b. ein Allel ist für Exon 4 deletiert, das andere nicht) durch das Vorhandensein des nicht deletierten Allels erschwert. Es sind quantitative PCR-Verfahren notwendig, von denen sich eines zu bewähren scheint. MLPA-Analyse In einem Multiplex-PCR-Ansatz werden die Primer zur Amplifikation mehrerer Exons gleichzeitig eingesetzt. Man benötigt für jedes zu untersuchende Exon im Gen zwei spezifische Oligonukleotide. Diese sind hierbei so zu lokalisieren, dass das 3 -Ende des einen und das 5 -Ende des anderen Oligonukleotids unmittelbar nebeneinander liegen. Durch eine Ligasereaktion können die beiden Oligonukleotide miteinander verbunden werden. Diese Reaktion läuft in einem Multiplex-Ansatz für alle zu analysierenden Exons gleichzeitig ab. Fehlt ein Exon, findet keine Hybridisierung und damit auch keine Ligation der Oligonukleotide statt. Die Oligonukleotide sind hier an den Enden mit einer Universal-Sequence versehen, die die Anlagerung eines weiteren Primerpaares ermöglicht. Diese Universal- Sequence ist an allen Primern gleich. Das bedeutet, dass die auf die Exons hybridisierten, miteinander verbundenen Oligonukleotide nach der Ligasereaktion mit einem zusätzlichen Primerpaar amplifiziert werden können. Diese Polymerasereaktion kann jedoch nur für die Exons erfolgen, auf denen die Hybridisierungsreaktion stattfinden konnte, also nicht für die deletierten Exons. Bei Duplizierten Exons ergibt sich ein in der Intensität verdoppeltes Signal.. Eine Differenzierung der Reaktionsprodukte erfolgt über die Fragmentlänge, die durch die Länge der exonspezifischen Sequenzen bestimmt werden kann. MLPA-Deletionsanalyse Abb S Auflage Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 10

11 -Deletionsanalyse. A: Zunächst erfolgt die Anlagerung der Forward- und Reverse- Primer an das jeweilige Exon. Nach der Ligasereaktion können die hybridisierten Primer mit den Universal-Primern amplifiziert werden, und durch eine anschließende Gelelektrophorese kann eine Differenzierung anhand der erhaltenen Fragmentlängen durchgeführt werden. Da bei deletierten Exons keine Hybridisierung stattfinden kann, wird auch kein PCR-Produkt auf dem Gel zu sehen sein (Exon 3). B: MRC-Deletionsanalyse des DMD-Gens bei Muskeldystrophie Duchenne. In der oberen Spur sind die Signale der einzelnen Exons für eine Kontroll-DNA abgebildet, in der unteren Spur die Signale einer Patienten-DNA. Mann erkennt das Fehlen einzelner Signale, was auf eine Deletion der jeweiligen Exons hindeutet. Methoden_der_genetischen_Diagnostik_Holinski-Feder.doc 11

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