Viele komplexe Erkrankungen zum

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1 Genetische Analysen komplexer Erkrankungen Genetic Analysis of Complex Diseases Institut für Epidemiologie Thomas Illig Viele komplexe Erkrankungen zum Beispiel Asthma, Typ 2 Diabetes, Herz- Kreislauf-Erkrankungen nehmen in den Industrieländern deutlich an Häufigkeit zu und stellen eine große Belastung für die Budgets des Gesundheitswesens dar. Zur Entwicklung von effektiven Behandlungsstrategien müssen die molekularen Mechanismen, die diesen Krankheiten zugrunde liegen, möglichst gut verstanden sein. Hier spielen genetische Kopplungs- und Assoziationsstudien in humanen Populationen eine zentrale Rolle. An unserem Institut wurden neue Kandidatengene für atopische Erkrankungen gefunden und die Bedeutung bereits bekannter Gene bestätigt. Als Risikogen für atopische Phänotypen konnte der Transkriptionsfaktor STAT6 identifiziert werden und der zytosolische Rezeptor NOD1, der eine Rolle bei der Pathogenerkennung spielt, wurde als neues Suszeptibilitätsgen beim Atopischen Ekzem gefunden. Ferner konnte in einer großen bevölkerungsbasierten Studie die Assoziation des Gens NOD2 mit verschiedenen atopischen Phänotypen verifiziert werden. Auch bei der genetischen Analyse von Stoffwechselerkrankungen wurden vielversprechende Resultate erzielt: So konnte beispielsweise mit Hilfe von Patientenkollektiven der MONICA/KORA- Studien bestätigt werden, dass das MC4R- Gen mit reduziertem Körpergewicht assoziiert ist. Komplexe genetische Erkrankungen werden sowohl durch Umweltfaktoren als auch genetische Faktoren verursacht, wobei im Unterschied zu monogenen Erkrankun- T he frequency of many complex diseases for example asthma, type 2 diabetes, and cardiovascular diseases is increasing markedly in the industrialised countries and represents a large burden for the budgets of the health services. In order to develop effective treatment strategies, a good understanding of the molecular mechanisms that underlie these diseases is important. Genetic linkage and association studies in human populations play a central role. In the Institute, we have identified new candidate genes for atopic diseases and confirmed the importance of some known genes. The transcription factor STAT6 was identified as a risk gene for atopic phenotypes and the cytosolic receptor NOD1, which plays a role in the recognition of pathogens, was discovered as a new susceptibility gene for atopic eczema. Further, the association of the gene NOD2 with various atopic phenotypes was verified in a large population-based study. Promising results were also obtained with genetic analyses of metabolic diseases: for example, the association of the MC4R gene with reduced body weight was confirmed using patient cohorts from the MONICA/KORA studies. Aktuelle Themen GSF 39

2 gen in der Regel mehrere Gene an der Krankheitsentstehung beteiligt sind. Zu solchen komplexen Krankheiten zählen zum Beispiel atopische Erkrankungen wie Asthma, Atopische Dermatitis und Heuschnupfen, metabolische Erkrankungen wie der Typ 2 Diabetes, sowie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, verschiedene Krebserkrankungen und neurologische Erkrankungen wie Schizophrenie oder die Alzheimer-Krankheit. Viele dieser komplexen genetischen Erkrankungen treten in den Industrienationen immer häufiger auf und belasten in zunehmendem Maße die Finanzhaushalte der Gesundheitssysteme. Bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die zu solchen Erkrankungen führen, spielen neben funktionellen Analysen, Expressionsstudien und Tiermodellen genetische Kopplungs- und Assoziationsstudien in Humanpopulationen eine wichtige Rolle. In Kopplungsstudien wird die gemeinsame Vererbung der Krankheit mit genetischen Markern in Familien untersucht. Als Marker dienen hier Mikrosatelliten beziehungsweise Polymorphismen einzelner Nukleotide, die so genannten SNPs (von single nucleotide polymorphisms). Mikrosatelliten sind nichtkodierende Sequenzwiederholungen im Genom, SNPs dagegen Austausche von einzelnen Basen, die hauptsächlich in zwei Ausprägungen (biallelisch) in der Bevölkerung vorkommen. SNPs sind die am häufigsten im Genom auftretenden DNA-Variationen und daher als Genmarker für eine enge Eingrenzung der für die Krankheitsentstehung verantwortlichen DNA- Varianten von großer Bedeutung. Es wird postuliert, dass im gesamten menschlichen Genom etwa sieben Millionen SNPs mit einer Allelfrequenz größer als fünf Prozent auftreten; weitere vier Millionen SNPs zeigen eine Frequenz zwischen ein und fünf Prozent. Da die Rekombinationshäufigkeiten verschiedener DNA-Bereiche unterschiedlich sind, gibt es Abschnitte im Genom, in denen das väterliche und mütterliche Genmaterial von benachbarten chromosomalen Bereichen auch nach mehreren Generationen nicht durch Rekombination getrennt werden. In solchen Abschnitten liegen die SNPs in einem starken Kopplungs-Ungleichgewicht vor sie werden deshalb als LD-Blöcke bezeichnet (LD steht für linkage disequilibrium, Kopplungs-Ungleichgewicht). In LD-Blöcken genügt es daher, nur wenige der vorhandenen SNPs zu analysieren, um den Hauptinformationsgehalt der häufig vorkommenden Haplotypen zu beschreiben (unter Haplotyp versteht man eine Kombination von Allelen an zwei oder mehreren eng benachbarten Genloci auf einem Chromosom). Diese so genannten haplotype tagging (ht) SNPs werden zur Zeit in zwei großen Genotypisierungs-Projekten in verschiedenen Populationen bestimmt. Ziel ist es, für jeden DNA-Bereich die LD- Blöcke mit ihren ht-snps zu bestimmen, um so die Anzahl der zu genotypisierenden Marker bei der systematischen Erforschung des Genoms zu reduzieren. Genetische Assoziationsanalysen werden als Fall-Kontrollstudien der Bevölkerung oder alternativ bei Familien durchgeführt. Bei Fall-Kontrollstudien werden die Allel-, Genotyp- oder Haplotypfrequenzen zwischen einer Fallgruppe und einer möglichst gut angeglichenen Kontrollgruppe verglichen. Ein Verfahren zur statistischen Auswertung von Assoziationsstudien in Trio-Familien das heißt beide Elternteile und ein Kind ist der so genannte Transmissions-Disequilibrium-Test (TDT). Das Prinzip dieses Tests ist es, die nicht vererbten Allele beider leiblicher Eltern als interne Kontrollen zu verwenden. Beim TDT wird ausgehend von heterozygoten Elternteilen überprüft, ob das betreffende Allel häufiger an erkrankte Kinder weitergegeben wird oder nicht. Zum besseren Verständnis der Ursachen komplexer Erkrankungen wurden bereits zahlreiche Assoziationsstudien durchgeführt und bis zum Jahr 2000 mehr als 100 Einzelstudien veröffentlicht. In Wiederholungsstudien konnten die meisten der publizierten Ergebnisse jedoch nicht bestätigt werden. Gründe hierfür dürften vor allem falschpositive Zufallsergebnisse sein. Aber auch Populationsstratifikation (das heißt Frequenzunterschiede innerhalb einer Studie, die nur auf unterschiedliche Populationen und nicht auf die Erkrankungen zurückzuführen sind), die Verwendung zu kleiner Studien bei schwachen Effekten oder verschiedene Gen-Gen- oder Gen-Umwelt- 40 GSF

3 Wechselwirkungen in den Populationen könnten dafür verantwortlich sein. Genomweite Assoziationsstudien versus Kandidatengen-Studien Bei Assoziationsstudien gibt es grundsätzlich zwei verschiedene, auch miteinander kombinierbare Strategien. Auf der einen Seite stehen regionale oder genomweite Assoziationsstudien, bei denen hypothesenfrei nach Assoziationen zwischen DNA-Regionen und den untersuchten Krankheiten gesucht wird (positioneller Ansatz). Dieses Verfahren ist allerdings sehr aufwändig und wird erst seit kurzer Zeit angewendet. Auf der anderen Seite werden häufig Kandidatengen-Studien durchgeführt, bei denen auf Grund verschiedener Überlegungen bestimmte Gene als potentielle Mitverursacher der Erkrankung ausgewählt werden (Kandidatengen-Ansatz). Der Vorteil des positionellen Ansatzes liegt im Ausschluss von oft falschen Hypothesen, welche Gene für die Krankheitsentstehung von Bedeutung sind. Dieses Verfahren ist jedoch sehr teuer, erzeugt extrem viele Daten und wirft ein multiples statistisches Testproblem auf. Seit Mitte des Jahres 2005 ist ein neues Chip-System (Affymetrix) verfügbar, mit dem SNPs, die relativ gleichmäßig über das Genom verteilt sind, untersucht werden können. Kandidatengenansätze sind im Vergleich dazu billiger und untersuchen weniger SNPs, waren jedoch bisher bei der Analyse von komplexen Erkrankungen wenig erfolgreich. Populationen Bereits seit den 1980er-Jahren werden am Institut für Epidemiologie große, intensiv phänotypisierte Populationen rekrutiert. Zusätzlich steht biologisches Material für genetische und andere molekulare Untersuchungen zur Verfügung. Die MONICA/KORA- Studien (MONICA, Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Disease; KORA, Kooperative Gesundheitsforschung im Raum Augsburg) sind populationsbasierte Studien Erwachsener im Alter von 25 bis 74 Jahren bei Rekrutierungsbeginn. Die Rekrutierung erfolgt in der Stadt und im Umland von Augsburg. Insgesamt stehen Personen für genetische Analysen zur Verfügung. Schwerpunkte der Untersuchungen waren atopische sowie metabolische Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Krankheiten. Aus den MONICA/KORA-Kollektiven konnten mehr als 700 bestehende und mehr als 500 prospektive Typ 2 Diabetes-Fälle sowie nahezu 400 neu entdeckte Herzinfarktfälle identifiziert werden. Ein weiterer Schwerpunkt bei den MONICA/KORA-Studien ist die Untersuchung von quantitativen beziehungsweise intermediären Phänotypen. Diese Phänotypen, wie zum Beispiel Blutdruck, Gewicht oder Blutfettwerte, sind häufig mit metabolischen Erkrankungen korreliert, aber meist weniger komplex in ihrer Entstehung. Von nahezu allen Personen stehen Intermediärmarkerdaten zur Verfügung. Für die Untersuchung von atopischen Phänotypen wurde das KORA C-Kollektiv (1417 Teilnehmer) ausgewählt. Zusätzlich wurde zur Analyse des Atopischen Ekzems eine Trio-Familienstudie mit 250 Familien verwendet. Neben den populationsbasierten Kohorten wurden spezifische Fall-Kohorten mit den Schwerpunkten atopische Erkrankungen, Typ 2 Diabetes, Herz-Kreislauf- Erkrankungen und Lungenkrebs rekrutiert. Hochdurchsatz-Genotypisierung Ein weiterer wichtiger Faktor für die Durchführung genetisch-epidemiologischer Studien ist die Genotypisierung von DNA- Proben in großem Umfang. Im Jahr 2000 wurde am GSF Forschungszentrum das Genomanalysezentrum (GAC, Genome Analysis Center) etabliert, in dem Hochdurchsatzanalysen in den Bereichen Genomics, Proteomics und Metabolomics durchgeführt werden können. Ein MALDI-TOF- Massenspektrometer (Abb. 1) ist auf die Analyse von Einzelbasenaustauschen im Genom spezialisiert. Im Jahr 2005 wurden an der GSF noch weitere Genotypisierungsmethoden mit weitaus größeren Kapazitäten etabliert: Die Illumina- sowie die Affymetrix- Techniken erlauben einen täglichen Durchsatz von mehreren Millionen Genotypen. Aktuelle Themen GSF 41

4 Multiplex Reaktion Intensität m/z Abb. 1: MALDI TOF-Massenspektrum einer Multiplexreaktion zur Genotypisierung fünf biallelischer SNPs. Das Massenspektrum zeigt die Analyse der Primer-Extensionsreaktion für die SNPs rs [a/g], rs869085[a/g], rs16944[c/t], rs [c/t] und rs12905[c/t]. Die unterstrichenen Buchstaben zeigen die Stellen im Massenspektrum, an denen die allelspezifischen Extensionsprodukte der durchgeführten Reaktionen detektiert werden können. Durch ein Sternchen wird der Massenbereich markiert, in dem die jeweiligen nicht extendierten Primer detektiert werden können. NOD1 und Atopisches Ekzem Das Atopische Ekzem ist eine chronische entzündliche Hauterkrankung, die üblicherweise während der Kindheit zum ersten Mal auftritt und im Erwachsenenalter fortdauern kann. Das erste Kandidatengen für diese Erkrankung, NOD1, wurde in einer Kooperation mit der Technischen Universität München identifiziert. NOD1 gehört wie NOD2 zur Familie der Nukleotid-bindenden Oligomerisierungsproteine. Da NOD1 viele Merkmale mit NOD2 gemeinsam hat und letzteres bei atopischen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielt, wurde NOD1 als neuer Kandidat für das Atopische Ekzem und verwandte Merkmale analysiert. Insgesamt wurden elf SNPs des auf Chromosom 7p14 lokalisierten Gens untersucht und in drei großen, unabhängigen Populationen analysiert: i) einer populationsbasierten Studie mit 1417 Teilnehmern (KORA C), ii) einer Fall-Kontrollstudie aus KORA S4 mit 454 Personen und iii) einer Trio-Familienstudie mit Kindern, die an Atopischem Ekzem leiden, mit insgesamt 189 Familien. Die statistischen Analysen ergaben sowohl in der KORA-C Studie als auch in der KORA-S4 Fall-Kontrollstudie eine signifikante Assoziation eines Haplotyps mit dem Atopischen Ekzem. Ein weiterer Haplotyp war mit Gesamt- IgE-Spiegeln assoziiert. Außerdem konnten in den Einzel-SNP-Analysen signifikante Ergebnisse von sieben SNPs mit Gesamt- IgE-Spiegeln gefunden werden. In der Familienstudie waren diese SNPs signifikant mit dem Atopischen Ekzem assoziiert. In den drei großen Studien konnte also gezeigt werden, dass das NOD1-Gen für die Entwicklung des Atopischen Ekzems von zentraler Bedeutung ist. Parallel dazu beschrieben andere Arbeitsgruppen, dass dieses Gen signifikant mit Gesamt-IgE- Spiegel und Asthma also ebenfalls atopischen Phänotypen assoziiert ist und auch bei entzündlichen Darmerkrankungen eine wichtige Rolle spielt. NOD1 scheint daher ein interessantes Gen bei Erkrankungen zu sein, bei denen das Immunsystem in hohem Maß beteiligt ist. Weitere Validierungsstudien und funktionelle Analysen werden darüber Aufschluss geben. 42 GSF

5 STAT6 und Atopisches Ekzem Da die Chromosomenregion 12 häufig mit atopischen Merkmalen gekoppelt auftrat, wurde dort nach weiteren Kandidatengenen gesucht. Ein viel versprechender Kandidat war das STAT6-Gen, das für einen Transkriptionsfaktor (signal transducer and activator of transcription 6) kodiert. Das Gen ist relativ groß und besteht aus 23 kodierenden Bereichen (Exons). STAT6 ist involviert in die Signalübertragungswege der Interleukine IL-4 und IL-13, die beide für das IgE classswitching mitverantwortlich sind und daher bei der Entstehung von Asthma eine große Bedeutung haben. STAT6-Knockout-Mäuse entwickeln keine Überempfindlichkeit der Luftwege gegenüber Allergenprovokation. Wichtige Bereiche des Gens (Exons, Promotor, Exon-Intron-Übergänge) wurden zunächst in 32 Personen (16 Asthmatiker, 16 Kontrollen) sequenziert. Auf diese Weise wurden 13 SNPs und eine GT-Wiederholung entdeckt. Sämtliche DNA-Varianten wurden daraufhin in 108 Familien mit mindestens zwei erkrankten Kindern getestet. Es zeigte sich, dass keine der DNA-Varianten mit Asthma assoziiert war, es wurden aber signifikante Assoziationen mit Asthma-verwandten Merkmalen (Eosinophile-Konzentrationen, Gesamt-IgE-Spiegel) gefunden. Die Ergebnisse der Familienstudie wurden in großen populationsbasierten Studien Erwachsener und Kinder überprüft. In der Erwachsenenkohorte KORA-C, die auf allergische Phänotypen untersucht war, wurden sechs signifikante SNPs analysiert. Ein SNP Odds ratio [95% CI] % percentile (53 ku/l) 66% percentile (99 ku/l) IgE cut-off 90% percentile (307 ku/l) Abb. 2: Erhöhtes Risiko (odds ratios), das der Haplotyp GCTCAA im STAT6-Gen auf die IgE-Spiegel ausübt. Die Daten wurden in der KORA-C Studie generiert. im Intron 2 sowie ein Haplotyp waren signifikant mit Gesamt-IgE-Spiegeln assoziiert (Abb. 2). Diese Ergebnisse stehen in sehr guter Übereinstimmung mit den Resultaten der Familienstudie. Computeranalysen legen nahe, dass der signifikante SNP im Intron 2 eine Transkriptionsbindestelle im Transkriptionsfaktor NFkappaB verändert. NFkappaB ist ein viel diskutiertes Kandidatengen bei allergischen Erkrankungen. In Zukunft werden funktionelle Studien zeigen, ob dieser SNP für die Bindekapazität des Transkriptionsfaktors relevant ist. In einer weiteren Validierungsstudie (unter der Federführung von Dr. Kabesch, Ludwig-Maximilians-Universität München) wurden die oben beschriebenen sechs SNPs in 1120 deutschen Kindern untersucht. Es zeigte sich, dass der gleiche SNP in Intron 2 und der gleiche Haplotyp wie in der KORA-C Studie mit IgE-Spiegeln assoziiert ist. Die Analyse von CARD-15/NOD2 CARD-15 (Caspase recruitment domain 15; synonym für NOD2) ist ein zytosolischer Rezeptor, der an der Erkennung bakterieller Zellwandbestandteile beteiligt ist. Das Protein ist Teil des angeborenen Immunsystems und spielt deswegen eine wichtige Rolle bei der Entstehung atopischer Erkrankungen. Es setzt sich aus einer aminoterminalen Caspase Recruitment -Domäne, einer zentralen Nukleotid-Bindungs-Oligomerisierungs-Domäne und einem carboxyterminalen Leucin-reichen Bereich zusammen. Das CARD-15-Gen ist auf Chromosom 16 lokalisiert und für die Entstehung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie zum Beispiel Morbus Crohn mitverantwortlich. Kürzlich wurde in einer großen Kohorte von deutschen Schulkindern eine signifikante Assoziation zwischen drei SNPs und atopischen Erkrankungen gefunden. Unsere Studie zielte darauf ab, frühere Ergebnisse in einer großen populationsbasierten Studie Erwachsener (KORA-C) zu validieren. Acht SNPs, die über das gesamte Gen verteilt sind, wurden dafür genotypisiert (Abb. 3) und statistisch auf Assoziation mit atopischen Phänotypen überprüft. Einzelgenotypen sowie Haplotypen zeigten Aktuelle Themen GSF 43

6 Human CARD15 gene 35,9 kb rs rs rs rs rs rs Exon rs rs Abb. 3: Genstruktur, abgeleitete Proteinstruktur und analysierte DNA-Varianten im NOD2-Gen. CARD, Caspase recruitment domain; NOD, Nucleotide-binding oligomerisation domain; LRR, Leucin rich repeat. Pfeile mit Kreis zeigen SNPs in Exons an. CARD CARD NOD LRR signifikante Assoziationen mit atopischen Erkrankungen wie Heuschnupfen und Asthma beziehungsweise mit dem Intermediär- Phänotyp Gesamt-IgE. Somit konnten die früheren Beobachtungen bestätigt werden. Metabolische Erkrankungen: Typ 2 Diabetes und Adipositas Das Metabolische Syndrom umfasst Störungen im Glukose- und Fettstoffwechsel sowie Übergewicht, Bluthochdruck und Proteinurämie. Folgeerkrankungen sind unter anderem Typ 2 Diabetes, Adipositas und Herzinfarkt. Für Typ 2 Diabetes und Adipositas, die an unserem Institut schwerpunktmäßig bearbeitet werden, liegen zahlreiche Kopplungs- und Assoziationsstudien vor. Beide Erkrankungen zeigen eine hohe Komplexität, was sich auch in der Heterogenität der Ergebnisse genetischer Untersuchungen bemerkbar macht. Dennoch kristallisieren sich eine Reihe von Genen heraus, die eine wichtige Rolle zu spielen scheinen (Tabelle 1). Im Zusammenhang mit Typ 2 Diabetes konnte bisher nur ein kleines Kollektiv mit etwas über 200 Fällen untersucht werden. Es zeigte sich eine nicht signifikante Assoziation zwischen der Erkrankung und Polymorphismen im Promotor des Interleukin- 6-Gens, dem zentralen Regulator der Akutphase-Antwort. Der Effekt ist aber in verschiedenen Populationen unterschiedlich stark ausgeprägt. Eine Meta-Assoziationsanalyse zwischen Typ 2 Diabetes und dem Kandidatengen Tabelle 1: Kandidatengene beim Typ 2 Diabetes. OR bedeutet das erhöhte Risiko für Träger des Allels, erkrankt zu sein. Gen Protein Studie OR CAPN-10 Calcium-abhängige Protease Kopplung Meta-Analyse 1.17 INS Zuckerstoffwechselregulation Meta-Analyse 1.4 PPARG Transkriptionsfaktor Meta-Analyse 1.25 KCNJ-11 Kanalprotein in der beta-zelle Meta-Analyse GSF

7 Augsburg Essen Hinney Branson Vaisse Dubern Abb. 4: Adipositasgenetik: Die Melanokortin 4 Rezeptor-Variante 103 Isoleucin ist mit erniedrigtem Körpergewicht assoziiert. Dargestellt sind die Risiko-Ratios der Einzelstudien und der Meta-Analyse. Die KORA-Studie S4 lieferte den stärksten Beitrag zur Meta-Analyse. Gotoda Farooqi Jacobson Gu Ohshiro Meta-analysis Aktuelle Themen Calpain-10 ergab eine hochsignifikante Assoziation eines SNP im Intron des Gens mit Typ 2 Diabetes. Träger der seltenen Variante haben ein schwach erhöhtes Risiko, an Typ 2 Diabetes zu erkranken. Wegen der enorm großen Fallzahl ist das Assoziationsergebnis jedoch hochsignifikant. Die KORA- Population wurde ebenfalls genotypisiert und ging in die Meta-Analyse mit ein. Bei der Suche nach Suszeptibilitätsgenen für Adipositas war man bis vor kurzem nur bei sehr seltenen monogenen Erkrankungsformen erfolgreich. Wir konnten nun eine signifikante Assoziation zwischen geringerem Körpergewicht und einem Polymorphismus im MC4R-Gen feststellen. Das Genprodukt von MC4R der Melanokortin-4-Rezeptor spielt eine wichtige Rolle beim Energiehaushalt. Für die Analyse wurde ein großes Kollektiv von fast 8000 Personen aus der Bevölkerung (KORA S3, KORA S4) untersucht. Dabei zeigte sich ein schwach negativer Effekt einer seltenen DNA-Variante, die einen Aminosäureaustausch von Valin nach Isoleucin im Bereich der Membrandomäne zur Folge hat. Diese Ergebnisse stehen in sehr guter Übereinstimmung mit einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse, bei der ebenfalls ein Teil des KORA-S4-Kollektivs analysiert wurde (Abb. 4). Ausblick Ende 2005 wurde eine genomweite genetische Untersuchung an 1500 Personen der KORA S3 / F3-Studie begonnen. Ziel der Studie ist es, genetische Assoziationen zwischen unterschiedlichen Phänotypen (zum Beispiel Typ 2 Diabetes, Atopie, Entzündungsmarker, Blutdruck) und DNA- Varianten zu finden, um die molekularen Mechanismen, die bei diesen Phänotypen eine Rolle spielen, besser zu verstehen. Dieses ambitionierte Projekt, in dem Genotypen generiert und analysiert werden, wird wichtige Erkenntnisse im Bereich der genetischen Epidemiologie liefern. GSF 45

8 Ausgewählte Veröffentlichungen Geller, F., Reichwald, K., Dempfle, A., Illig, T., Vollmert, C., Herpertz, S., Siffert, W., Platzer, M., Hess, C., Gudermann, T., Biebermann, H., Wichmann, H.E., Schafer, H., Hinney, A., Hebebrand, J.: Melanocortin-4 receptor gene variant I103 is negatively associated with obesity. Am. J. Hum. Genet. 74: (2004) Heid, I.M., Vollmert, C., Hinney, A., Doring, A., Geller, F., Lowel, H., Wichmann, H.E., Illig, T., Hebebrand, J., Kronenberg, F.: Association of the 103I MC4R allele with decreased body mass in 7937 participants of two population based surveys. J. Med. Genet. 42: e21. (2005) Illig, T., Bongardt, F., Schopfer, A., Muller-Scholze, S., Rathmann, W., Koenig, W., Thorand, B., Vollmert, C., Holle, R., Kolb, H., Herder, C.: Significant association of the interleukin-6 gene polymorphisms C-174G and A-598G with type 2 diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: (2005) Weedon, M.N., Schwarz, P.E.H., Horikawa, Y., Iwasaki, N., Illig, T., Holle, R., Rathmann, W., Selisko, T., Schulze, J., Owen, K.R., Evans, J., Bosque-Plata, L.D., Hitman, G., Walker, M., Levy, J. C., Sampson, M., Bell, G.I., McCarthy, M.I., Hattersley, A.T., Frayling, T.M.: Meta-analysis and a large association study confirm a role for calpain-10 variation in type 2 diabetes susceptibility. Am. J. Hum. Genet. 73: (2003) Weidinger, S., Klopp, N., Rummler, L., Wagenpfeil, S., Novak, N., Baurecht, H., Groer, W., Darsow, U., Heinrich, J., Gauger, A., Schafer, T., Jacob, T., Behrendt, H., Wichmann, H. E., Ring, J., Illig, T.: Association of NOD1 Polymorphisms with Atopic Eczema and Related Phenotypes. J. Allergy Clin. Immunol. 116: (2005) 46 GSF