Statistische Analyse von hochdimensionalen Daten in der Bioinformatik

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1 Statistische Analyse von hochdimensionalen Daten in der Bioinformatik Florian Frommlet Institut für medizinische Statistik, Medizinische Universität Wien Wien, November 2013

2 Einführung DNA Molekül Zwei komplementäre Stränge bilden Doppelhelix Vier Basen Adenin Thymin Cytosin Guanin

3 Einführung DNA Molekül Zwei komplementäre Stränge bilden Doppelhelix Vier Basen Adenin Thymin Cytosin Guanin Genetische Information als String in Alphabet mit vier Buchstaben gaacgaatca ttgcaaagag ccaaagatcc aaaatttgca acaaaaacaa aaactctacc

4 Welche genetische Information? Codierung von Proteinen Makromoleküle aus 20 Aminosäuren Grundbausteine aller Zellen Unglaubliche Vielfalt an Aufgaben Codierung von RNA Ribonukleinsäure - Umsetzung von genetischer Information, aber auch viele andere Aufgaben

5 Welche genetische Information? Codierung von Proteinen Makromoleküle aus 20 Aminosäuren Grundbausteine aller Zellen Unglaubliche Vielfalt an Aufgaben Codierung von RNA Ribonukleinsäure - Umsetzung von genetischer Information, aber auch viele andere Aufgaben

6 Was ist ein Gen? Übliche Definition: Abschnitt der DNA, der ein Protein codiert Triplets von DNA - Basen codieren Aminosäuren 64 Möglichkeiten (Redundanz)

7 Was ist ein Gen? Übliche Definition: Abschnitt der DNA, der ein Protein codiert Triplets von DNA - Basen codieren Aminosäuren 64 Möglichkeiten (Redundanz)

8 Standardmodell der Genetik

9 Technologien zum Messen von RNA - Expression Älter: Microarrays Chip mit kurzen DNA Stücken von Genen an Spots (jeweils nur ein Strang) Hybridisierung: Anlagerung von komplementärem DNA oder RNA Strang Neuer: RNA-Seq Komplexere Technologie, die erlaubt mittels next generation sequencing einen generellen Überblick über die in einer Zelle vorhandene RNA zu erhalten

10 Technologien zum Messen von RNA - Expression Älter: Microarrays Chip mit kurzen DNA Stücken von Genen an Spots (jeweils nur ein Strang) Hybridisierung: Anlagerung von komplementärem DNA oder RNA Strang Neuer: RNA-Seq Komplexere Technologie, die erlaubt mittels next generation sequencing einen generellen Überblick über die in einer Zelle vorhandene RNA zu erhalten

11 Prinzip von Micro Arrays Was wird gemessen? DNA Proben mit Fluorophoren gekennzeichnet Je mehr Hybridisierung an einem Spot desto stärker das Farbsignal Zweifarben Microarrays Zwei Gruppen mit unterschiedlichen Farben gekennzeichnet (z. Bsp. rot und grün) Gelb: Beide Gruppen exprimiert Dunkel: Keine von beiden

12 Prinzip von Micro Arrays Was wird gemessen? DNA Proben mit Fluorophoren gekennzeichnet Je mehr Hybridisierung an einem Spot desto stärker das Farbsignal Zweifarben Microarrays Zwei Gruppen mit unterschiedlichen Farben gekennzeichnet (z. Bsp. rot und grün) Gelb: Beide Gruppen exprimiert Dunkel: Keine von beiden

13 Datenaufbereitung Vor der eigentlichen Datenanalyse müssen die Bilddaten aufgearbeitet werden Eigene Vorlesung Wesentliche Schritte: Bildanalyse (speziell interessant bei Zweifarben-Arrays) Qualitätskontrolle (Viele Fehlermöglichkeiten) Transformation und Normalisierung (um danach einfache statistische Verfahren anwenden zu können) Behandlung von fehlenden Werten etc. Am Ende dieser Prozedur erhält man bei Zweifarben-Arrays für jeden Spot eine Zahl, die mißt ob es für das jeweilige Gen einen Unterschied in der Genexpression zwischen den beiden jeweiligen Proben gibt.

19 Beispiel: Studie über Prostatakrebs Singh et al. (2002) Gene expression correlates of clinical prostate cancer behavior, Cancer Cell 1, pp Microarray Experiment: Von jedem Patien gesunde und Krebszellen Gleason Score als Maß für Differenzierungsgrad der Zelle 52 Individuen: 26 davon mit schlechter Differenzierung etwa Gene Wikipedia Frage: Gibt es Gene die Differenzierungsgrad beeinflussen?

24 Studie über Prostatakrebs Ein spezielles Gen Homo sapiens mrna for RET finger protein-like 3 Graphische Darstellung: Boxplot

25 Vergleich für ein einziges Gen Nullhypothese: Expression in beiden Gruppen ist gleich H 0 : µ 1 = µ 2 Alternative: Expression in beiden Gruppen ist verschieden H A : µ 1 µ 2 Vergleiche Mittelwerte zwischen den beiden Gruppen Gruppe 1: x 1 = , Gruppe 2: x 2 = Je mehr die Daten streuen desto weniger Aussagekräftig ist dieser Unterschied zwischen den beiden Gruppen

28 Der Zweistichproben t-test t-test Statistik T : T = x 1 x 2 S wobei S 2 geeigneter Schätzer für die Varianz der Mittelwertsdifferenz. Testentscheidung Falls T größer als kritischer Wert Entscheidung für H A Sonst Beibehaltung von H 0

29 Der Zweistichproben t-test t-test Statistik T : T = x 1 x 2 S wobei S 2 geeigneter Schätzer für die Varianz der Mittelwertsdifferenz. Testentscheidung Falls T größer als kritischer Wert Entscheidung für H A Sonst Beibehaltung von H 0

30 Wahrscheinlichkeitsverteilung von T Theoretische Verteilung von T = x1 x2 S unter Nullhypothese: t-verteilt mit n 2 Freiheitsgraden Dichte der t-verteilung mit df Freiheitsgraden

31 Bestimmung des kritischen Werts Unter Annahme dass H 0 stimmt, suche symmetrischen Bereich wo H 0 mit Wahrscheinlichkeit α abgelehnt wird d.h. Nullhypothese wird fälschlich verworfen (Fehler 1. Art) Wahl des kritischen Werts für α = 0.05 und df = 50

32 t-test für unser spezielles Gen x 1 = 17.08, x 2 = 8.88 S = T = 4.26 Kritischer Wert: Entscheidung für H 1 p-wert: Wahrscheinlichkeit unter H 0 den Wert T oder noch einen extremeren Wert zu beobachten Im Beispiel: p = T > kritischer Wert p-wert < α

35 Prinzip des statistischen Testens Entscheidung z. Bsp. basierend auf t-test Statistik T : T > kritischer Wert H 0 abgelehnt T kritischer Wert H 0 beibehalten H 0 wahr H 1 wahr H 0 beibehalten Fehler 2. Art H 0 abgelehnt Fehler 1. Art Kontrolliere Fehler 1. Art zum Niveau α (z.b. α = 0.05, oder α = 0.01) Power Wahrscheinlichkeit einen tatsächlichen Unterschied zu erkennen Je kleiner α desto kleiner die Power

38 Prinzip des statistischen Testens Entscheidung z. Bsp. basierend auf t-test Statistik T : T > kritischer Wert H 0 abgelehnt T kritischer Wert H 0 beibehalten H 0 beibehalten H 0 abgelehnt H 0 wahr Fehler 1. Art H 1 wahr Fehler 2. Art Power Kontrolliere Fehler 1. Art zum Niveau α (z.b. α = 0.05, oder α = 0.01) Power Wahrscheinlichkeit einen tatsächlichen Unterschied zu erkennen Je kleiner α desto kleiner die Power

40 Multiples Testproblem Ein statistischer Test: Wahrscheinlichkeit für falsche Entdeckung ist α Was passiert bei vielen (m) Tests? Family wise error rate: FWER := P(Mindestens eine falsche Entdeckung) In unserem Beispiel: m = Gene Wie groß ist FWER für α = 0.05?

43 Multiples Testproblem Ein statistischer Test: Wahrscheinlichkeit für falsche Entdeckung ist α Was passiert bei vielen (m) Tests? Family wise error rate: FWER := P(Mindestens eine falsche Entdeckung) In unserem Beispiel: m = Gene Wie groß ist FWER für α = 0.05? Unter der (gewagten) Annahme, dass die Tests unabhängig sind: FWER = 1 (1 α) m = FWER praktisch nicht von 1 unterscheidbar Man erwartet = 600 falsche Entdeckungen

44 Multiples Testproblem Es bedarf einer Korrektur für multiples Testen

45 Bonferroni Korrektur Klassische (1936) und extrem einfache Korrekturmethode: Teste zum Signifikanzniveau α Bon = α/m Beispiel: α = 0.05, m = 10 α Bon = α = 0.05, m = 100 α Bon = Bonferroni kontrolliert FWER weil m P j=1 A i m P(A i ) Bonferroni Korrektur sehr populär, aber Problem mit geringer Power In unserem Beispiel α Bon = Gen mit p-wert nicht mehr signifikant j=1

48 False Discovery Rate Konzept der FDR Eingeführt von Benjamini und Hochberg (1995) ( ) V FDR = E R R... Gesamtanzahl der abgelehnten Hypothesen V... Anzahl der falschen Entdeckungen V /R = 0 falls R = 0 FDR: Erwarteter relativer Anteil an falschen Entdeckungen FWER zu kontrollieren ist eine stärkere Anforderung als FDR, größere Power, dafür mehr falsche Entdeckungen

51 Benjamini - Hochberg Prozedur Vorgangsweise 1. Ordne alle p-werte: p [1] p [m] 2. Bestimme { } k = argmax i p[i] iα m 3. Ablehnung aller Hypothesen mit p-wert p [k] Beispiel: m = 5 p [1] = p [2] = p [3] = > 0.03 p [4] = p [5] = > 0.05 Verwerfe 4 Hypothesen BH kontrolliert FDR zum Level α

56 Studie über Prostatakrebs Anzahl signifikanter Gene α = 0.05 m = Keine Korrektur: 1967 Bonferroni: 1 Benjamini Hochberg: 5 10 kleinsten p-werte p-wert p [1] = p [2] = p [3] = p [4] = p [5] = p [6] = p [7] = p [8] = p [9] = p [10] = iα n

59 Weitere Methoden Multiples Testen ein sehr aktiver Forschungsbereich Einige weitere Stichworte Permutationstests Baysianische Modellselektion Empirical Bayes Literatur für Microarrayanalyse Speed (2003) Statistical analysis of gene expression microarray data Lee (2004) Analysis of microarray gene expression data Zhang (2006) Advanced analysis of gene expression microarray data Mallick, Gold (2009) Bayesian analysis of microarray gene expression data etc.

60 Weitere Methoden Multiples Testen ein sehr aktiver Forschungsbereich Einige weitere Stichworte Permutationstests Baysianische Modellselektion Empirical Bayes Literatur für Microarrayanalyse Speed (2003) Statistical analysis of gene expression microarray data Lee (2004) Analysis of microarray gene expression data Zhang (2006) Advanced analysis of gene expression microarray data Mallick, Gold (2009) Bayesian analysis of microarray gene expression data etc.

61 Genome Wide Associations Studies Assoziationsstudie Suche nach Regionen der DNA die im Zusammenhang mit Merkmalen stehen Merkmale: Quantitativ (Größe) Dichotom (Krankheit) etc. Genetischer Marker: Position der DNA wo es Unterschiede zwischen Individuen gibt

64 SNPs als genetische Marker Single Nucleotide Polymorphism SNP: Punktmutation Beim Menschen fast 20 Millionen SNPs bekannt HapMap Projekt Karte von SNPs für 270 Individuen Wikipedia

65 SNPs als genetische Marker Single Nucleotide Polymorphism SNP: Punktmutation Beim Menschen fast 20 Millionen SNPs bekannt HapMap Projekt Karte von SNPs für 270 Individuen Wikipedia

66 SNP Arrays Bis zu 1 Million SNPs auf einem Array Technologie ähnlich zu Microarrays Zwei Spots für jeweilige Variante von einem SNP Hybridisierung Markierung mit Fluorophoren Chromosomenpaar Zwei Allele 3 mögliche Genotypen: aa, aa, AA Homozygot vs. Heterozygot Clusteralgorithmen zur Bestimmung des Genotyps from BLOG of Bryce Christensen

69 GWAS Datenstruktur Y X 1,..., X m n Individuen typisch n > 1000 m SNPs typisch m > Y... n - Vektor der Merkmale X i... n - Vektor der Genotypen Codierung z. Bsp X i { 1, 0, 1} Frage: Welche X i sind mit dem Merkmal assoziiert? Oft hat SNP nicht unmittelbar selbst Einfluss auf Merkmal sondern ist nur Indikator für Gen in der Nähe (Linkage disequilibrium)

70 GWAS Datenstruktur Y X 1,..., X m n Individuen typisch n > 1000 m SNPs typisch m > Y... n - Vektor der Merkmale X i... n - Vektor der Genotypen Codierung z. Bsp X i { 1, 0, 1} Frage: Welche X i sind mit dem Merkmal assoziiert? Oft hat SNP nicht unmittelbar selbst Einfluss auf Merkmal sondern ist nur Indikator für Gen in der Nähe (Linkage disequilibrium)

71 Test von einzelnen Markern Die einfachste und derzeit auch am weitesten verbreitete Methode zur Datenanalyse von GWAS besteht darin, jeden SNP einzeln zu untersuchen Test von individuellen Markern Verschiedene Tests für Zusammenhang zwischen Y und X i Y quantitativ: Lineare Regression, ANOVA, etc. Y dichotom: χ 2 -Test, Cochran-Armitage, etc. In jedem Fall wiederum multiple Testkorrektur notwendig

72 Test von einzelnen Markern Die einfachste und derzeit auch am weitesten verbreitete Methode zur Datenanalyse von GWAS besteht darin, jeden SNP einzeln zu untersuchen Test von individuellen Markern Verschiedene Tests für Zusammenhang zwischen Y und X i Y quantitativ: Lineare Regression, ANOVA, etc. Y dichotom: χ 2 -Test, Cochran-Armitage, etc. In jedem Fall wiederum multiple Testkorrektur notwendig

73 Alternative: Modellselektion Im Falle von quantitativen Merkmalen mittels Regressionsmodell Modell mit k SNPs i. e. Y = β 0 + β i1 X i1 + β i2 X i2 + + β ik X ik + ɛ, Es gibt 2 m 1 mögliche Modelle Wie findet man das richtige? Derzeit mein Forschungsbereich (WWTF Projekt) Modellselektionskriterien für m > n Suchstrategien in dem riesigen Raum der Modelle Sparsity hilfreich (k m) - Entwicklung von Theorie Effiziente Implementation etc.