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2 Quelle: NHGRI GWA Catalog, Juli 2007, Deutsches Ärzteblatt: Asthma-Gen entdeckt. Eine Genvariante in Chromosom 17 erhöht bei Kindern das Risiko, an Asthma zu erkranken, um 70 Prozent. November 2007, Diabetes-Gen bei Jugendlichen aufgespürt. Eine Mutation zweier Gene erhöht das Risiko der Typ-1-Diabetes bei Kindern und Jugendlichen. Januar 2008, Adipositas-Gen rs Forscher findet neues Gen, das die Entstehung von Adipositas unterstützt. Diese Liste von Überschriften aus den unterschiedlichsten Medien ließe sich beliebig fortsetzen, denn in den letzten fünf Jahren wurden für eine Vielzahl komplexer, multifaktorieller Erkrankungen, wie Diabetes, Adipositas, Herzinfarkt etc., genetische Varianten als Marker für mögliche Ursachen aufgespürt. Was früher der berühmten Suche nach der Nadel im Heuhaufen glich schließlich stehen etwa menschliche Gene zur Auswahl geht heute dank Microarraytechnik schneller und effizienter. Der Heuhaufen scheint also deutlich übersichtlicher geworden zu sein. Es ist aber nach wie vor ein Heuhaufen, gibt Prof. Daniela Steinberger, medizinische Leiterin und Gründerin der bio.logis GmbH in Frankfurt am Main, zu bedenken. Denn auch wenn seit den letzten Jahren immer mehr Navon Dr. Eva A. Schulte deln gefunden wurden und werden, herrscht nach wie vor einiges an Unordnung. Multifaktoriellen Erkrankungen auf der Spur Grundlagen für die zitierten Pressemeldungen und damit für das Aufspüren von Nadeln im Heuhaufen bilden in den allermeisten Fällen Ergebnisse genomweiter Assoziationsstudien (). Mit einer kann mithilfe der Microarraytechnik systematisch das Genom von vielen tausend Menschen auf genetische Variationen parallel untersucht werden, mit dem Ziel, die entdeckten genetischen Variationen einem gewissen Krankheitsbild zuzuordnen. Das Prinzip einer ist damit eigentlich nicht neu, so Steinberger. Bereits die Drosophila-Genetiker aus den 40er und 50er Jahren haben mit ihren Kreuzungsversuchen genetische Varianten für bestimmte Phänotypen lokalisieren können. Den Molekularbiologen der neueren Zeit ist es dann gelungen, mittels Kopplungsanalysen besonders bei monogenen Erkrankungen bestimmte genetische Veränderungen einem krankhaften Phänotyp zuzuordnen. Dies war aber in der Regel ein sehr aufwendiger und langwieriger Prozess, der bei multifaktoriellen

3 Erkrankungen keine Aussicht auf Erfolg hatte. Und genau das ist das Neue an den. Mithilfe von Microarrays können bis zu einer Million genetische Variationen in einem Durchgang untersucht und bestimmt werden [1]. Untersuchungsgegenstand der meisten sind die SNPs (engl. single nucleotide polymorphisms = Einzelnukleotidpolymorphismen), also Bereiche der DNA-Sequenz, die nur in einer einzelnen Base variieren [2]. Durchschnittlich tritt alle 200 Basenpaare ein SNP auf. Dabei wird zwischen nicht synonymen (auch kodierenden) und synonymen SNPs unterschieden. Im ersten Fall führt ein SNP auch zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz des durch das betroffene Gen kodierten Proteins, im zweiten Fall, zum Beispiel aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, nicht. Zudem können SNPs nicht nur innerhalb eines Gens eine wichtige Rolle spielen, sondern etwa auch, wenn sie in einer regulatorischen Region liegen. Wird durch ein SNP die Regulation der Gentranslation verändert, kann ein betroffenes Protein entweder gar nicht oder im Überschuss produziert werden. Auch SNPs in untranslatierten Regionen (UTR) können beispielsweise Einfluss auf die Stabilität der mrna haben. Ähnliches gilt für SNPs in Exon-Intron- Übergängen. Für den Menschen sind zurzeit etwa zehn Millionen SNPs in öffentlichen Datenbanken beschrieben, mit denen sich bis zu 90 Prozent aller Variationen in der menschlichen Bevölkerung erklären lassen [3,4]. Eine Reihe dieser SNPs kommen nur mit einer sehr geringen Allelfrequenz vor, aber etwa sechs Millionen haben eine Allelfrequenz von fünf Prozent oder mehr und werden deshalb häufig im Zusammenhang mit gängigen Erkrankungen in der Bevölkerung untersucht [5]. Diese SNPs können aufgrund der sie umgebenden DNA-Sequenzen eindeutig im Genom lokalisiert werden. So lässt sich mithilfe eines genetischen Markers innerhalb des Genoms ein SNP eindeutig einer bestimmten Genomregion zuordnen. Es ist also jetzt möglich, so Steinberger, unsere Erbinformation mit einer ganzen Reihe von diesen Markern zu überziehen, die ähnlich wie Wegweiser anzeigen, dass es in der Nähe der gekennzeichneten Bereiche genetische Veränderungen geben könnte, die die eigentliche Ursache für einen bestimmten Phänotyp sein könnte. Fragestellung (fast) immer gleich Diese genetischen Wegweiser werden in der Regel in sogenannten Fall-Kontroll-Studien ermittelt. Dabei wird bei einer das Auftreten von SNPs in erkrankten und gesunden Individuen einer Population, so etwa bei Kindern mit Asthma und solchen ohne Asthma, verglichen. Es ist möglich, das gesamte Genom der Testpopulation zu untersuchen oder auch nur bestimmte Kandidatengene, die aus vorangegangenen Kopplungsstudien bekannt sind. Wie auch immer das Studiendesign gestaltet ist, die zentrale Fragestellung aller bleibt somit relativ gleich und wird von Steinberger knapp zusammengefasst mit: Was haben die einen, was die anderen nicht haben, und umgekehrt. Aufbau einer GWA-Studie Eine typische GWA-Studie besteht in der Regel aus fünf Schritten (siehe Abbildung 1, Seite 20) [3, 6]. Als erstes muss eine genügend große Anzahl von Individuen mit der zu untersuchenden Krankheit beziehungsweise dem entsprechenden Phänotyp und eine geeignete Vergleichsgruppe rekrutiert werden. Man geht dabei von mindestens 1000 bis 2000 Individuen aus. Dann muss der entsprechende Chip mit den passenden genomweiten Markern ausgewählt werden, auf welche die Proben untersucht werden sollen. Als nächstes folgt die statistische Auswertung der Daten, bei der unter anderem evaluiert wird, inwieweit sie statistisch signifikant sind. Im zweiten Teil der Auswertung wird ermittelt, ob eine Assoziation zwischen einem SNP und dem untersuchten Phänotyp bestehen könnte. Die ermittelten Ergebnisse werden in der Regel als Quotenverhältnis (engl. odds ratio OR) angegeben. Das Quotenverhältnis gibt an, wie viel höher die Chance ist, an einer bestimmten Krankheit zu erkranken, wenn man Träger einer bestimmten genetischen Variation, also eines bestimmten SNPs, ist. Diese Ergebnisse werden in der Regel in sogenannten Wiederholungsoder Replikationsstudien in einer unabhängigen Population überprüft. Dieser Überprüfung folgen die Genotypisierung sowie die Prüfung funktioneller Implikationen der Ergebnisse mithilfe von Zellkultur oder Tiermodellen. Doch beim Studien-Design und bei der Durchführung von Studien zu genetischen Markern und deren Zusammenhang mit Krankheiten oder der Wirksamkeit von Therapien gibt 19

4 20 Abbildung 1: Typisches Studien- Design einer Quelle: modifiziert nach [6], Erika Heil, art for biomed es eine Reihe von Aspekten zu beachten, damit die erhaltenen Ergebnisse auch wirklich aussagekräftig sind. Dies machte Professor Helmut Schäfer vom Institut für Medizinische Biometrie und Epidemiologie der Universität Marburg bei einem Vortrag zur personalisierten Medizin deutlich. So spiele es beispielsweise eine große Rolle, ob es sich um eine retrospektive oder prospektive Studie handelt, genauer, ob die Studie auf einer vorher formulierten Hypothese beruhe und die zu untersuchenden genetischen Marker oder Varianten im Voraus spezifiziert worden seien. Wenn man retrospektiv Biodatenbanken nach Markern analysiert, findet man immer Untergruppen in einem untersuchten Kollektiv in denen überraschende Dinge auftreten, so der Biostatistiker. Diese Ergebnisse sind statistisch allerdings nur sehr schwer von zufälligen Artefakten zu unterscheiden. Und damit ist eine wirkliche Bewertung nicht möglich. Schäfer appelliert daher für mehr prospektive Studien, bei denen genau der Zusammenhang zwischen bestimmten genetischen Markern, Klassifikatoren und den Effekten von Therapien untersucht werden könnte. Zudem machte Schäfer in seinem Vortrag deutlich, dass sich einfache Maßzahlen wie das Quotenverhältnis aus Sicht eines Biostatistikers eigentlich nicht für die Vorhersage von individuellen Erkrankungsrisiken eignen würden. Für diesen Zweck habe die Biostatistik spezielle Kennzahlen und Verfahren entwickelt, wie etwa multivariate Analysen und sogenannte ROC (engl. Receiver Operating Characteristic)-Analysen. Dabei zeige sich beispielsweise, dass das Risiko, an Brustkrebs zu erkranken, derzeit mit einer individuellen DNA-Analyse noch nicht wesentlich genauer als mit einer gründlichen Anamnese vorhergesagt werden könne, von bestimmten familiären Formen des Brustkrebses einmal abgesehen. Dabei betonte Schäfer, dass wir diese Betrachtungen als Ansporn nehmen sollten, in unseren Analysen noch viel besser zu werden. Assoziation=Ursache? Mittlerweile wurden durch knapp 3000 SNPs für 165 Krankheitsbilder/Phänotypen in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Von diesen liegen zwölf Prozent auf proteinkodierenden Genregionen und die verbleibenden Anteile erstrecken sich mit je etwa 40 Prozent unter anderem auch auf intergenische Regionen und nicht kodierende Introns [3]. Zudem kommt es vor, dass mit einer einzigen Erkrankung eine Vielzahl von SNPs assoziiert sein kann, über deren mögliche funktionelle Auswirkungen nichts oder nur wenig bekannt ist. Umgekehrt können auch ein einziger SNP beziehungsweise entsprechende Veränderungen in einem Gen mit mehr als einem Krankheitsbild in Verbin-

5 21 dung stehen. Dies ist laut Steinberger für die multifaktoriellen Erkrankungen auch nicht überraschend. Denn schließlich gibt es eine Vielzahl biologischer Prozesse, die zu einem Symptom wie zum Beispiel Herzinfarkt oder Asthma führen können. Somit sei nur logisch, dass es auch entsprechend viele potenzielle genetische Variationsmöglichkeiten gebe. Und da die Prozesse in unserem Körper in komplexen Zusammenhängen stehen, ist es ebenfalls nicht verwunderlich, dass durch die Veränderungen in Genen aufgespürt werden, die vorher mit dem untersuchten Krankheitsbild vielleicht noch nicht im Zusammenhang standen [7]. So geschehen beispielsweise bei dem Gen ORMDL3. In einer wurde eine starke Assoziation zwischen Veränderungen in diesem Gen und Asthma im Kindes- und Jugendalter nachgewiesen, während über die tatsächliche Funktion im Krankheitsverlauf wenig bekannt ist [8]. Kurze Zeit später wurde dann auch noch eine Assoziation zwischen Veränderungen in ORMDL3 und Morbus Crohn beschrieben [9]. An diesem Beispiel zeigen sich auch die Grenzen der. Es besteht nämlich ein feiner Unterschied zwischen statistischer Signifikanz, Assoziation und Kausalität. Nur weil eine bestimmte genetische Veränderung bei einem Kollektiv einer bestimmten Erkrankung häufiger vorkommt als bei Gesunden, muss das noch lange nicht bedeuten, dass diese beschriebene Veränderung auch kausal mit dem Auftreten der Erkrankung zu tun hat, erläutert Steinberger. Die statistische Auswertung einer liefert lediglich einen Hinweis, wo in Zukunft genauer hingeschaut werden sollte, wenn es um Abbildung 2: In Microarrays werden alle zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiven Gene sichtbar gemacht. Quelle: NHGRI die Erforschung möglicher Ursachen für eine Erkrankung geht. Übertragen auf das Beispiel mit dem Heuhaufen heißt das somit: Nur weil man in schimmeligen Heuhaufen immer wieder Nadeln findet, kann man nicht schlussfolgern, dass diese Nadeln ursächlich für Schimmel im Heu verantwortlich sind. Leider wird in der Presse diese Unterscheidung gerne etwas vereinfacht. Es sollte eigentlich deutlich gemacht werden, betont Steinberger, dass zum jetzigen Zeitpunkt die Ergebnisse einer für eine multifaktorielle Erkrankung für den einzelnen Patienten keine diagnostische oder klinische Aussagekraft besitzen. Es handele sich vielmehr um eine Methode, mit der Forscher Daten sammeln können, um in Zukunft im Hinblick auf individuelle Medizin noch größere Fortschritte zu erzielen. Wir haben schon einen guten Anfang gemacht, unterstreicht die Fachärztin für Humangenetik, und können schon für eine Reihe von krankhaften Phänotypen begründete Aussagen machen, aber wir sind noch einiges davon entfernt, die komplexen multifaktoriellen Wirkungen für den Einzelnen umfassend aufzuklären. Quelle: Darryl Leja, NHGRI Schwellenwert Ein Grund dafür sind die Vielzahl und die Komplexität der biologischen Prozesse und Verflechtungen, die sich alle untereinander und unterschiedlich beeinflussen. In der Wissenschaft geht man derzeit in diesem Zusammenhang von einem sogenannten Schwellenwertmodell aus. Dies besagt, dass durch eine Ansammlung von genetischen Veränderungen und Umweltfaktoren erst eine Art Schwellenwert überschritten werden muss, damit entsprechende Symptome einer Erkrankung auf-

6 22 treten. Dieser Schwellenwert hat weniger mit der Menge von SNPs zu tun, sondern vielmehr damit, inwieweit kritische Bereiche, also beispielsweise zentrale Stoffwechselwege, durch die Veränderungen betroffen sind. Dabei muss einem einzelnen SNP nicht unbedingt eine direkte Funktion bei einer Erkrankung zugeordnet werden können; in der Summe mit anderen Veränderungen kann er aber sehr wohl eine wichtige Rolle spielen. Diese Vorstellung könnte auch erklären, warum mit den bekannten SNPs derzeit rechnerisch nur weniger als ein Prozent des vererbten Gesamtrisikos für eine Krankheit erklärt werden kann [10]. Wichtige Schlüsselstellen und Verknüpfungen sind vielleicht einfach noch nicht erforscht. Umwelt die große Unbekannte Außerdem werden Einflüsse aus der Umwelt in den gängigen nicht erfasst. Aber besonders bei komplexen Erkrankungen wie Diabetes oder Adipositas hat sich gezeigt, dass nicht nur die Gene, sondern auch die Umwelt einen entscheidenden Einfluss auf das Auftreten und die Progression einer Erkrankung haben. Und dies nicht nur bei den Betroffenen selbst, sondern dieser Einfluss kann auch von den Eltern oder gar Großeltern auf die Nachkommen übertragen werden (Pädiatrix 4/2010, Seite 20 ff.). Es wird an ersten Ansätzen gearbeitet, wie der Faktor Umwelt in die Auswertung von mit einbezogen werden könnte [11]. Somit wird deutlich, dass die Ergebnisse einer bei Weitem nicht so schlüssig sind, wie es auf den ersten Blick scheinen mag. Eine statistisch signifikante Assoziation zwischen einem SNP und einer Erkrankung muss somit noch lange keine klinische oder diagnostische Relevanz haben. Für das Individuum haben die derzeit noch keine Aussagekraft, betont Steinberger deshalb noch einmal. Das heißt also zum einen, dass selbst bei nachgewiesenen SNPs beim Einzelnen kein Grund zur Sorge besteht, und zum anderen, dass es noch ein sehr langer Weg ist, bis solche SNPs sinnvoll in eine individualisierte Medizin eingebunden werden können. Die Nadeln im Heuhaufen werden nun zwar schneller und effektiver gefunden, aber solange sie nicht richtig sortiert und analysiert worden sind, helfen sie uns erstmal wenig. Literatur 1. Spencer CC et al.: Designing genome-wide association studies: sample size, power, imputation, and the choice of genotyping chip. PLoS Genet. 2009; 5(5): e Hardy J et al.: Genomewide association studies and human disease. N Engl J Med. 2009; 360(17): Manolio TA: Genomewide association studies and assessment of the risk of disease. N Engl J Med. 2010; 363(2): Kruglyak L et al.: Variation is the spice of life. Nat Genet. 2001; 27(3): Palmer LJ et al.: Shaking the tree: mapping complex disease genes with linkage disequilibrium. Lancet. 2005; 366(9492): Kronenberg F: Genome-wide association studies in aging-related processes such as diabetes mellitus, atherosclerosis and cancer. Exp Gerontol. 2008; 43(1): Hindorff LA et al.: NHGRI Catalog of published genome-wide association studies. (Zugang unter 8. Moffatt MF et al.: Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature. 2007; 448(7152): Barrett JC et al.: Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn s disease. Nat Genet. 2008; 40(8): McCarthy MI et al.: Genome-wide association studies: potential next steps on a genetic journey. Hum Mol Genet. 2008; 17(R2): R Thomas D: Gene-environment-wide association studies: emerging approaches. Nat Rev Genet. 2010; 11(4): Quelle: Jane Ades, NHGRI

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