Entgiftung und Ausscheidung

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1 Entgiftung und Ausscheidung Einführung Entgiftung und Ausscheidung sind neben der Aufnahme, Verteilung und Verstoffwechslung von Nährstoffen unabdingbare Voraussetzungen zur Erhaltung der Funktionsfähigkeit (Homöostase) des rganismus. Die zentralen rgane der Entgiftung und Ausscheidung sind die Leber und die Nieren. Wichtige Leistungen der Leber sind in diesem Zusammenhang: 1. die Harnstoffsynthese in den periportalen Arealen und die perivenös lokalisierte Glutaminsynthetase, die das beim Proteinabbau entstehende Ammoniak in eine ungiftige (Harnstoff bzw. Glutamin) und besser ausscheidbare Form überführen und 2. die Biotransformation, die durch xidation und Kopplungsreaktionen apolare Substanzen in besser ausscheidbare polare Substanzen umsetzen. Die durch diese Mechanismen in ihrer Löslichkeit gesteigerten Substanzen werden dann über die Galle oder nach Exkretion in das Blutplasma über die Nieren ausgeschieden. Die Menge und die Zusammensetzung des Harns weisen starke Schwankungen auf, die durch die tägliche Flüssigkeitsaufnahme und die Ernährungsweise bedingt sind. Die smolarität des Harns schwankt in weiten Grenzen ( mosm / L), sie kann bis zum Fünffachen der smolarität des Plasmas betragen. Die Konzentration der gelösten Bestandteile des Harns lässt sich am einfachsten aus der Dichte bestimmen, die meist zwischen 1,015 und 1,025 liegt. Sie kann bei großer Flüssigkeitszufuhr oder unter krankhaften Bedingungen auf 1,001 absinken, oder auf Werte über 1,04 ansteigen. Über den ph-wert des Harns entscheiden das Säure-Base-Verhältnis des rganismus sowie die Nierenfunktion. Als Extremwerte werden ph-werte von 4,0 und 8,0 angegeben. Die in 24 h mit dem Harn ausgeschiedene Trockensubstanz beträgt ungefähr g, davon ist in etwa die Hälfte Harnstoff. Übersicht der normalen Harnbestandteile im 24 h Urin: Anorganische Bestandteile rganische Bestandteile Ion g mval Stoff g mmol Na Gesamt N K Harnstoff Ca² Harnsäure Mg² Kreatinin Cl Aminosäuren S 4 ² (als S) HP 4 ² (als P) + NH (als N) In geringen Mengen werden außerdem ausgeschieden: Zucker, organische Säuren, Pyrrolderivate, Steroide und Steroidkonjugate, Mucine und Enzyme 1

2 Ziel dieses Versuches ist es, durch Analyse verschiedener Harnbestandteile Einblikke in die Regulation des Protein- und Kohlenhydrat-Stoffwechsels durch Glucocorticoide und den Abbau von Purinbasen sowie der Nierenfunktion zu gewinnen. Stichworte zur Vorbereitung Leber und Stoffwechsel stickstoffhaltiger Substanzen: Bildung und Entgiftung von Ammoniak; Kreatin, Glutaminsynthese, rnithin und Polyamine, Arginin und Stickstoffmonoxid, Desaminierung, Transaminierung, Stickstoffbilanz. Galle und Biotransformation: Bilirubin, Gallensäuren, Reaktionen der Phase 1 und 2, Biotransformation von Paracetamol und Aflatoxin. Niere: Harnbestandteile, ph-wert (Säure-Base-Haushalt), Pufferung, Nitrit, Gluconeogenese. Hormone: Cortisol, Aldosteron, Adiuretin, ANF: Wirkungsweise, Rezeptoren. Ascorbinsäure: Funktionen, Ausscheidung. Pathobiochemie: Morbus Cushing, Morbus Addison, Diabetes mellitus (Ketonkörper), Diabetes insipidus, Purinabbau und Gicht, Harnkonkremente, xalat, Defekte der Harnstoffsynthese, metabolische Azidosen, Abbau von Ethanol und Methanol. Praktikumsablauf Urinproben: Für jeden Versuchstag werden vier Freiwillige gesucht, die Urin sammeln. Gebraucht werden dreimal 24 h Sammelurin: 1. Der erste Freiwillige (Versuch 2 Ascorbinsäurebestimmung) nimmt eine Gratisprobe Ascorbinsäure (1 g) vor dem Urinsammeln (Harn A). 2. Für die Harnstoffmessung sollte sich der zweite Freiwillige 24 h vor und während der Sammelperiode möglichst proteinarm (vegetarisch mit möglichst wenig Milchprodukten) ernähren (Harn V), wohingegen der 3. dritte Freiwillige proteinreiche Kost (Fleisch, Fisch, Milchprodukte..., Harn F) zu sich nehmen sollte. Gewinnung von Sammelurin: Zu Beginn der Sammelperiode (Zeitpunkt notieren) wird die Blase komplett entleert und der Urin verworfen. Ab jetzt wird der Urin gesammelt. Abschließend wird am Folgetag zum Zeitpunkt des Sammelbeginns die Blase wiederum vollständig entleert und das Gesamtvolumen notiert. Weiterhin wird eine kleine Probe Morgenmittelstrahlurin benötigt. Die Proben sollen vom Tag vor dem Praktikum stammen. Für die Bilanz ist es unabdingbar, dass das Gesamtvolumen notiert wird, während für die Analysen nur wenige Milliliter benötigt werden. Urinflaschen werden eine Woche vor dem Praktikumstag verteilt. Harnvolumina (24-h-Sammelurin): Harn A (Ascorbinsäure) ml Harn V (Vegetarier) ml Harn F (proteinreiche Kost) ml 2

3 Aufteilung einer Gruppe aus7-8 Studierenden am Praktikumstag Versuch 1: Probenvorbereitung Inkubationszeit: 60 min währenddessen:: Versuch 2: Ascorbinsäure- Bestimmung Fluorimetrische Bestimmung Versuch 2: Ascorbinsäure- Bestimmung Versuch 3a: Harnstoff- Bestimmung Versuch 3b: Kreatinin- Bestimmung Versuch 3a: Harnstoff- Bestimmung Versuch 3b: Kreatinin- Bestimmung Versuch 3c: Harnsäurebestimmung Versuch 3d: Bestimmung des Urin-pH-Wertes Versuch 4: Urin-Teststreifen Auswertung und Diskussion der Ergebnisse aller Versuche Versuch 1: Probenvorbereitung Inkubationszeit: 60 min währenddessen:: Versuch 3c: Harnsäurebestimmung Fluorimetrische Bestimmung Versuch 1: Fluorimetrische Cortisol-Bestimmung Das im Harn frei (unkonjugiert) vorkommende Cortisol besitzt erhebliche diagnostische Bedeutung, da die durch die Niere ausgeschiedenen, unkonjugierten Harn- Glucocorticoide als direktes Maß des nicht eiweißgebundenen, biologisch aktiven Plasma-Glucocorticoids angesehen werden können. Bei Normalpersonen sind nur 5-10 % des gesamten im Blut zirkulierenden Cortisols nicht eiweißgebunden. Die restlichen % sind reversibel an Transcortin oder Albumin gebunden und somit vor der Ausscheidung geschützt. Prinzip der fluorimetrischen Cortisol-Bestimmung: In ethanol-schwefelsaurer Lösung bildet Cortisol bei Raumtemperatur einen gelben, grün fluoreszierenden Farbstoff. Dessen Fluoreszenz kann zur quantitativen Bestimmung des Hormons ausgenutzt werden. Um das Cortisol von anderen im Harn vorkommenden fluoreszierenden Substanzen abzutrennen, wird es mit Dichlormethan extrahiert. Anschließend wird die Dichlormethan-Phase mit Natronlauge ausgeschüttelt um weitere störende Substanzen zu entfernen. Nach Zugabe von Ethanol / Schwefelsäure und Ausschütteln wird Cortisol in der schwefelsauren Lösung (untere Phase) fluorimetrisch bestimmt. Probenvorbereitung: Es werden jeweils eine Harnprobe (Doppelbestimmung) und eine Standardreihe mit 4 verschiedenen Standardkonzentrationen parallel angesetzt (die Herstellung der Standardreihe wird vom zuständigen Assistenten durchgeführt). Die Standardreihe entspricht 100 µg, 50 µg, 25 µg, und 12,5 µg Cortisol pro 100 ml. 3

4 2 ml Harn (Doppelbestimmung) wird durch kräftiges Schütteln mit 8 ml Dichlormethan in Schliff-Reagenzgläsern extrahiert (hoher Dampfdruck des Dichlormethans - öfter vorsichtig entlüften!!!). Nach Phasen-Trennung wird die obere wässrige Phase per Pasteurpipette vorsichtig am Rand des Reagenzglases abgesaugt (eventuell beim Assistenten nachfragen...). Die organische Phase wird mit 2 ml 0,1 N NaH durchgeschüttelt. Erneut wird die obere wässrige Phase mit einer Pasteurpipette entfernt (Pipettenspitze wiederholt am Reagenzglasrand ansetzen und absaugen). In ein zweites Schliff-Reagenzglas, in dem sich bereits 1 ml Ethanol p.a. / konz. Schwefelsäure (30 / 70) befindet, wird der gereinigte Dichlormethan-Cortisol-Extrakt umdekantiert und kräftig durchgeschüttelt. CAVE: Umdekantieren bitte nur unter Aufsicht des Assistenten!!! Nach 60-minütiger Inkubationszeit wird wiederum die obere Phase abgesaugt (das ist nun die Dichlormethanphase, die untere Schwefelsäure-Phase wird unter Aufsicht des Assistenten vermessen!!!), und die Fluoreszenz der Schwefelsäure- Phase bei einer Anregungswellenlänge von 465 nm (blau) gemessen. Das Maximum der Fluoreszenz-Emission liegt bei 525 nm (grün). µg / 100 µl Cortisol relative Fluoreszenzeinheiten ,5 Harnprobe (1. Wert) Harnprobe (2. Wert) 24-Stunden-Urin oder Morgenurin Aus den Standardverdünnungen soll eine Eichkurve erstellt werden, die im Idealfall linear verläuft. Ermitteln Sie aus der Standard-Eichgeraden, den Messdaten der Urinproben und dem 24 h-urinvolumen die Menge an ausgeschiedenem Cortisol. Welche endogenen und exogenen Faktoren beeinflussen die Cortisol-Ausscheidung? Versuch 2: Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) Die in großen Mengen chemisch synthetisierte Ascorbinsäure wird heute zahlreichen Nahrungsmitteln (z. B. Fruchtsäften) zur ernährungsphysiologischen Aufwertung und als Antioxidans zugesetzt. Die ausreichende Versorgung mit Vitamin C ist deshalb in unseren Breiten gesichert. Der nachfolgende Versuch soll demonstrieren, dass nach Einnahme übergroßer Dosen an Vitamin C ein Großteil dessen rasch wieder im Urin ausgeschieden wird. Das in hohen Dosen ausgeschiedene Vitamin kann Urintests stören (Glucose, Bilirubin; s. Versuch 4). Prinzip der titrimetrischen Ascorbinsäure-Bestimmung: Jod-Lösung (5,7 mm, Titrisol, Merck Darmstadt) oxidiert Ascorbinsäure quantitativ zu Dehydroascorbinsäure. Frisch zubereitete Stärkelösung wird als Indikator eingesetzt und verursacht einen schleppenden aber erkennbar blauen Umschlagspunkt. 4

5 Die blaue Farbe am Äquivalenzpunkt resultiert aus der Reaktion von überschüssiger Jod-Lösung mit Stärke. Hierbei baut das spiralige Amylose-Molekül der Stärke in seinen kanalartigen freien Raum passende Moleküle, wie beispielsweise das Iod, ein. Iod wird in linearen Ketten mit einem I-I-Abstand von 0,31 nm eingeschlossen und ergibt durch Lockerung des Elektronensystems eine intensive Blaufärbung. CH 2 H CHH CH 2 H CHH H H I 2 + Ascorbinsäure 2 I - + Dehydroascorbinsäure + 2 H + Gehaltsbestimmung: Zu je 20.0 ml Urin (24-Stunden-Urin, Harn A und zum Vergleich Harn V oder F) werden 2 ml 10 %-ige Schwefelsäure zugegeben. Nach Zusatz von wenigen Tropfen einer frisch angesetzten 20 %-igen Stärkelösung wird mit Jod-Lösung bis zur bleibenden Blauviolett-Färbung titriert. Berechnung: 1 ml Jod-Lösung (5,7 µmol) entspricht 1 mg Ascorbinsäure (MG: 176,1 g / mol) in der Probe. Geben Sie den Verbrauch der Titrationslösung an und berechnen Sie daraus die Menge an ausgeschiedener Ascorbinsäure. Diskutieren Sie diesen Befund im Hinblick auf Störungsmöglichkeiten bei der Bestimmung. 20 ml 24 h - Urin Verbrauch an 5,7 mm Iodlösung: Ausgeschiedene Menge Ascorbinsäure in 24 h Harn A ml mg Harn V ml mg Harn F ml mg Versuch 3: Bestimmung der Gesamt-Stickkstoffausscheidung Im Vordergrund der Ausscheidung organischer Substanzen mit dem Harn stehen folgende stickstoffhaltige Verbindungen: Harnstoff Kreatinin Harnsäure: Neben endogenen Faktoren (Stoffwechsellage, Stoffwechselerkrankungen) ist die Art und Zusammensetzung der Ernährung von entscheidender Bedeutung für die ausgeschiedene Menge dieser Substanzen. Weiterhin werden kleine Mengen an freien Aminosäuren (1-3 g / d), Aminosäurederivate (z.b. Hippursäure) und Proteine (weniger als 150 mg / d) ausgeschieden, die bei der Bestimmung der Gesamt-Stickstoffausscheidung im Rahmen des Praktikums unberücksichtigt bleiben. 5

6 Fassen Sie nach den Einzelauswertungen die Ergebnisse der Versuche 3 a-d zusammen und diskutieren Sie den Einfluss der Ernährung (vegetarisch - proteinreich) hinsichtlich der ausgeschiedenen Menge der bestimmten Substanzen und der Gesamtstickstoffausscheidung. Hat die Ernährung einen Einfluss auf den Urin-pH-Wert? Versuch 3a: Bestimmung der Harnstoffausscheidung Harnstoff (MG: 60,01 g / mol) wird als ein Produkt des Abbaus von Aminosäuren und der Entgiftung von Ammoniak in den periportalen Abschnitten der Leber synthetisiert. In Abhängigkeit von der Proteinzufuhr bzw. der Aminosäurekonzentration im Blutplasma sowie der Stoffwechsellage werden täglich wenige Gramm (Fasten), g (Kost mit g Protein / Tag) und eventuell mehr Harnstoff (proteinreiche Kost) im Urin ausgeschieden. Im klinischen Labor wird Harnstoff quantitativ im optischen Test durch xidation von NADH bei der mit der Harnstoffhydrolyse gekoppelten reduktiven Aminierung von α-ketoglutarat bestimmt: NH 2 C NH 2 + 2H 2 + H + Urease 2 NH HC - 3 NH C - C - (CH 2 ) 2 - C - GluDH - C - HCNH (CH 2 ) 2 - C - + NADH + H + + NAD + + H 2 Für rientierungszwecke ist es jedoch möglich, die Ureasereaktion mit einer Titration der gebildeten Base (NH 3 ) zu koppeln. Testprinzip: Harnstoff wird durch Urease in oben genannter Weise in Bicarbonat und 2 NH 3 gespalten. Freigesetztes NH 3 bindet Protonen mit einem pk-wert von 9,2. Der Protonenverbrauch im Ansatz führt zu einer Verschiebung des ph-wertes ins Alkalische, die mittels des zugesetzten Farbindikators o-cresolphthalein-komplexon (Phthalein Purple) nachgewiesen wird. Die Menge des umgesetzten Harnstoffs im Ansatz ist unter den gewählten Bedingungen proportional zum Anstieg des ph-wertes, der kolorimetrisch durch eine Zunahme der Violetttönung bestimmt wird (rsonneau J.L. et al., Clin Chem 38 (1992) ). Benötigte Reagenzien: 1) Farbreagenz: 2,5 mm o-cresolphthalein-komplexon (Phthalein Purple, Sigma, Taufkirchen) 30 mm Tris / HCl, ph 7,0 5 mm EDTA 0,1 % NaN 3 2) Ureaselösung: Urease (540 ku / L; Sigma, Taufkirchen) in 150 mm NaCl 6

7 Versuchsdurchführung: Die Reaktion wird nach dem folgenden Pipettierschema durchgeführt: In 6 Halbmikroküvetten pipettieren: Leerwert Standard V1: V2: F1: F2: Harn V µl 10 µl Harn F µl 10 µl H 2 10 µl -- 5 µl -- 5 µl -- 0,25 M Harnstoff µl Farbreagenz 580 µl 580 µl 580 µl 580 µl 580 µl 580 µl Reaktionsstart: Urease 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl Gesamtansatz 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl Die Küvetten mit Parafilm-Streifen fest verschließen. Nach kurzem Schütteln (Küvette 2x über Kopf stellen) erfolgt die Inkubation bei Raumtemperatur über 25 Minuten. Danach wird innerhalb weniger Minuten die Absorption der Proben gegen den Leerwert bei 578 nm gemessen. V1 V2 F1 F2 Std. 1 Std. 2 Eingesetztes Harnvolumen 5 µl 10 µl 5 µl 10 µl 10 µl 10 µl A 578 nm Absorptionskoeffizient ε (578 nm) = 68 [mol/l] -1 cm -1 (1 M Lösung entspräche einer Extinktion von 68) freigesetztes NH 3 im Ansatz (M) Harnstoff im Ansatz (M) Verdünnungsfaktor Harnstoff im Urin / Standard (M) Urinvolumen (L / 24 h) Harnstoff (mol / 24 h) Harnstoff : MG 60 g / mol Harnstoff (g / 24h) Stickstoff (g / 24 h) Proteinäquivalent (g / 24h) Anhand des berechneten Harnstoff-N-Wertes kann unter Berücksichtigung des Urinvolumens und des Faktors 6,25 (g Protein / g Stickstoff) auf den Proteinumsatz der Sammelperiode rückgeschlossen werden. Der angegebene Faktor ergibt sich aus dem empirisch ermittelten Wert von 16 Gewichts-% Stickstoff in einem durchschnittlichen Proteingemisch. 7

8 Versuch 3b: Bestimmung von Kreatinin In der Skelettmuskulatur dient Kreatinphosphat als Energiespeicher, der der raschen Wiederauffüllung des ATP-Pools dient. Ein Teil des Kreatinphosphats zyklisiert unter Abspaltung anorganischen Phosphats in einer nichtenzymatischen Reaktion zu Kreatinin (MG: 113,1 g / mol), das nicht mehr durch die Kreatinkinase rephosphoryliert werden kann und ausgeschieden wird. H 3 C H 2 - C C H N N C P + NH P H 3 C N H 2 C C NH NH Kreatinphosphat Kreatinin Diese Menge ist bei fleischarmer Diät zur Muskelmasse proportional. Das Kreatinin gelangt mit dem Blut zur Niere, wo es glomerulär filtriert wird. Eine tubuläre Rückresorption findet nicht statt; eine tubuläre Sekretion setzt erst bei einem (deutlich erhöhten) Serumspiegel von ca. 170 µmol / L ein. Testprinzip: Kreatinin bildet im alkalischen Milieu mit dem Salz der Pikrinsäure einen rot-orangen Farbkomplex (Jaffe-Reaktion). Die Reaktion wird durch im Harn enthaltene sog. Pseudokreatinine (Harnsäure, Ketonkörper, Proteine, Medikamente (Cephalosporine)) gestört, die langsam ähnlich absorbierende Farbkomplexe bilden. Dieser systematische Fehler wird vermieden, wenn man bei Pikrinsäureüberschuss und konstanter Reaktionstemperatur die Anfangsgeschwindigkeit der Farbkomplexbildung misst (kinetischer Test). Dazu werden die Extinktionen des Farbkomplexes genau 30 und 150 Sekunden nach Beginn der Reaktion gemessen. Die Differenz der Extinktionen ist ein ausreichend gutes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit. Durch Bezug auf die Reaktionsgeschwindigkeit eines Standards lässt sich die Kreatininkonzentration in der Probe berechnen. Benötigte Reagenzien: 1. Kreatinin-Standardlösung: C Standard = 176,8 µmol / L (2 mg / dl) 2. Farbreagenz: 18 mm Pikrinsäure 160 mm NaH Das Farbreagenz wird an jedem Versuchstag frisch angesetzt und muss vor Licht geschützt in einer dunklen Flasche aufbewahrt werden. Das Farbreagenz ist maximal. 5 Stunden stabil. Versuchsdurchführung: Je 20 µl der Urinproben V und F werden 1 : 49 mit dest. Wasser verdünnt. 8

9 Die Reaktionen werden bei gleicher Temperatur nacheinander durchgeführt: Mit dem Zusatz des Farbreagenz die Stopuhr starten, die Küvette ins Photometer setzen und die Extinktionen bei 492 nm nach exakt 30 und 150 Sekunden ablesen In 1 cm-küvetten pipettieren: Standard V: F: Standard 200 µl Harn V-Verdünnung (1:49) µl -- Harn F-Verdünnung (1:49) µl Farbreagenz 2000 µl 2000 µl 2000 µl Gesamtansatz 2200 µl 2200 µl 2200 µl E 492 nm 30 sec. E 492 nm 150 sec. E 492 (E 150 sec. E 30 sec.) Kreatinin in der verdünnten Probe (mg / 100 ml) Kreatinin im Urin (mg / 100 ml) Urinvolumen (L) Kreatinin (g / 24h) Stickstoff (g / 24 h) Berechnung mit Dreisatz, Verdünnung berücksichtigen! Normalwerte des 24h-Urin: 7-20 mmol / d bzw. 0,8-2,3 g / d Versuch 3c: Bestimmung von Harnsäure Testprinzip: Zur Bestimmung von Harnsäure (MG: 168,1 g / mol) dient ein gekoppelter enzymatischer Test. Harnsäure wird durch das Enzym Uricase in Allantoin umgewandelt. Dabei entsteht eine zur Harnsäure äquimolare Menge an Wasserstoffperoxid (H 2 2 ). Dieses oxidiert in einer zweiten Reaktion (Indikator-Reaktion katalysiert durch Peroxidase, PD) chromogene Substrate zu einem Chinonimin-Farbstoff, dessen Absorption zur Harnsäurekonzentration proportional ist. Uricase Harnsäure + 2 H Allantoin + C 2 + H 2 2 PD H NENMA + 4-Aminoantipyrin Chinonimin-Farbstoff + 2 H 2 (NENMA = N-Ethyl-N-3-methoxyanilin)) Im folgenden wird ein fertiges Reaktionsgemisch (Ecoline 25 Harnsäure Uicase-PAP, Merck, Darmstadt) verwendet, das alle notwendigen Komponenten (Uricase, PD, chromogene Substrate) enthält. Harnsäurestandard: 6 mg / dl. 9

10 Probenvorbereitung: Harn V und F mit dest. Wasser verdünnen Bestimmungsansatz: Spektralphotometer: 540 nm Küvette: 1 cm Schichtdicke Inkubationstemperatur: C In 5 Halbmikroküvetten pipettieren: Harn V Harn F 1. Standard 2. Standard Leerwert H 2 o µl Harn (1 + 9 verdünnt 20 µl 20 µl!) Standard (6 mg / dl) 20 µl 20 µl Pufferlösung 780 µl 780 µl 780 µl 780 µl 780 µl Startreagenz 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Mischen und 10 min bei C inkubieren. Innerhalb von 30 min die Absorption von Test und Standard gegen Leerwert messen. Harn V Harn F Standard 1 Standard 2 A 540 nm MW (Standards) Harnsäure in der ver- dünnten Probe (mg / 100 ml) Harnsäure im Urin (mg / 100 ml) Urinvolumen (L) Harnsäure (g / 24h) Stickstoff (g / 24 h) Berechnung mit Dreisatz, Verdünnung berücksichtigen! Normalwerte des 24h-Urin: 1,49-4,46 mmol / d bzw. 0,25-0,75 g / d Versuch 3d: Bestimmung des Urin-pH-Wertes Messung der ph-werte der drei Sammelurine am ph-meter. Harn A (Ascorbinsäure) ph Harn V (Vegetarier) ph Harn F (proteinreiche Kost) ph 10

11 Versuch 4: Qualitative und halbquantitative Bestimmung von Harnbestandteilen Die Diagnostics-Teststreifen (Multistix 10 SG, Bayer Diagnostics GmbH, München) ermöglichen den Nachweis von Glucose, Ketonkörper, Spez. Gewicht, Blut, ph, Eiweiß, Bilirubin, Urobilinogen, Nitrit und Leukozyten im Harn. Die Testergebnisse geben Aufschluss über evtl. Stoffwechsel-Störungen, Nieren- und Leberfunktion sowie Harnwegsinfektionen. Testdurchführung: Teststreifen kurz in den Harn eintauchen Teststreifen mit der Kante am Gefäßrand abstreifen, um überschüssigen Harn zu entfernen. Durch Farbvergleich mit dem Flaschenetikett erfolgt die visuelle Testauswertung. Einheitliche Ablesung aller Parameter mit Ausnahme der Leukozyten-Zone nach 1 Minute. Die Leukozyten-Zone wird stets nach 2 Minuten ausgewertet. Eventuelle Farbveränderungen, die nach mehr als 2 Minuten auftreten, sind diagnostisch nicht relevant. Testprinzipien: Glucose: Der spezifische Nachweis basiert auf der Glucose-xidase-Peroxidase-Reaktion (siehe Versuch rganstoffwechsel). Auf dem Teststreifen dient jedoch Kaliumjodid als Chromogen. Die Farbentwicklung erfolgt von grün nach braun. Physiologische Glucosekonzentrationen werden dabei nicht erfasst. Höhere Ascorbat- Konzentrationen (500 mg / L) und /oder hohe Ketonkörper-Konzentrationen (> 0,4 g / L) können zu falsch negativen Ergebnissen führen. Störungen: Durch Wasserstoffperoxid und andere xidationsmittel, die in Reinigungsmitteln vorkommen, kann eine falsch positive Reaktion angezeigt werden. Reduktionsmittel (z. B. Ascorbinsäure) können Wasserstoffperoxid reduzieren, so dass es nicht mehr für die xidation des Chromogens zur Verfügung steht. Enzyminhibitoren wie Fluorid oder Azid (Fluorid kann dem Blut zur Gerinnungshemmung zugesetzt werden) hemmen die Peroxidase, so dass trotz H 2 2 -Bildung die Indikatorreaktion unterbleibt. Bilirubin: Zusammensetzung: Dichloranilin-Diazonium-Salz. Das Testprinzip beruht auf der Kopplungsreaktion von diazotiertem Dichloranilin mit Bilirubin in stark saurem Milieu. Der Test erfasst Bilirubin-Konzentrationen ab 0,4-0,8 mg / dl. Schon geringste Verfärbungen müssen als positiv und damit als 11

12 pathologisch gewertet werden (Lebererkrankungen). Größere Mengen Ascorbinsäure (> 250 mg / L) können zu falsch positivem Ergebnis führen. Ketonkörper: Zusammensetzung: Nitroprussid-Natrium. Die Reaktionszone ist mit Nitroprussid-Natrium imprägniert und reagiert mit Acetessigsäure, nicht hingegen mit Aceton bzw. β-hydroxybuttersäure. Die Empfindlichkeit für Acetessigsäure liegt bei 5-10 mg / dl. Normalerweise enthalten Harnproben keine Ketone. Erkennbare Ketonkonzentrationen können nach physischen Belastungen wie Fasten, Schwangerschaft, nach starker körperlicher Anstrengung (Leistungssport) oder bei Stoffwechselentgleisungen festgestellt werden. Falsch positive Resultate können bei dunklen Harnen und bei Vorliegen von L-Dopa-Stoffwechselprodukten auftreten. Spezifisches Gewicht: Zusammensetzung: Bromthymolblau; Poly-(Methylvinylether / Maleinsäureanhydrid); Natriumhydroxid. Der Test basiert auf einer pks-änderung verschiedener Elektrolyte in Abhängigkeit von der Ionen-Konzentration. Erythrozyten / Hämoglobin: Zusammensetzung: Diisopropylbenzol Dihydroperoxid; Tetramethylbenzidin. Hämoglobin katalysiert die xidation des Farbindikators (3,3`, 5,5`- Tetramethylbenzidin) durch ein organisches Hydroperoxid (Diisopropylbenzol Dihydroperoxid) und bewirkt so den Farbumschlag. Peroxidasen mikrobiellen Ursprungs (z. B. bei Harnwegsinfektionen) können zu falsch positiven Ergebnissen führen genauso wie stark oxidierende Reinigungsmittel. ph: Zusammensetzung: Methylrot; Bromthymolblau. Eine Kontamination durch die benachbarte Eiweiß-Testzone kann erfolgen, wenn der Teststreifen nicht ausreichend am Gefäßrand abgestreift wurde. Eiweiß: Zusammensetzung: Tetrabromphenolblau; Puffer. Dem Nachweis von Eiweiß mit Teststreifen liegt die Bindung großer Anionen an Proteinmoleküle zugrunde. Als Anionen werden dabei ph-indikatoren verwendet. Im Sauren zeigt der ph-indikator die Farbe der undissoziierten Indikatorsäure; bei Verschiebung des ph-wertes ins Alkalische bildet sich das blaugefärbte Anion. Diese Farbänderung tritt auf, wenn der Indikator in einer schwach sauren Lösung mit dem Eiweiß in Berührung kommt (Eiweißfehler des Indikators). Dieser Fehler beruht darauf, dass der Indikator von den protonierten Aminogruppen des Proteins als Anion gebunden wird. Daher enthält der Teststreifen noch eine Puffersubstanz, die beim Anfeuchten einen ph-wert von 3 liefert. Bei stark gepufferten bzw. alkalischen Harnen oder bei Verunreinigungen durch Antiseptica und Desinfektionsmittel mit quartären Ammonium-Gruppen bzw. Chlorhexidin können falsch positive Ergebnisse auftreten. Urobilinogen: Zusammensetzung: Diethylaminobenzaldehyd. 12

13 Das Testprinzip beruht auf der modifizierten Ehrlich-Reaktion von p-diethylaminobenzaldehyd mit Urobilinogen in Gegenwart eines Farbverstärkers in stark saurem Milieu. Die Empfindlichkeit liegt bei ca. 0,2 mg / dl (0,2 Ehrlich-Einheiten / dl). Bei Gesunden werden Urobilinogen-Konzentrationen von 0,2-1,8 mg / dl gefunden, ab ca. 2,0 mg / dl beginnt der Übergang zum pathologischen Bereich. Falsch positive Resultate können durch eine Reaktion mit p-aminosalicylsäure und Sulfonylharnstoffen, atypische Verfärbungen bei Anwesenheit von p-aminobenzoesäure zustande kommen. Falsch negative Ergebnisse können durch Formalin verursacht werden. Nitrit: Zusammensetzung: p-arsanilsäure; 1,2,3,4-Tetrahydrobenzol[h]chinolin-3-ol. Im Harn vorhandenes Nitrat wird durch die meisten harnwegspathologischen Bakterien (gramnegative Keime) zu Nitrit reduziert. Das Testprinzip beruht auf der Diazotierung von p-arsanilsäure durch Nitrit und anschließender Kupplungsreaktion mit 1,2,3,4-Tetrahydrobenzol[h]chinolin-3-ol. Die Empfindlichkeit für Nitrit liegt bei 0,06-0,10 mg / dl. Falsch negative Ergebnisse können erhalten werden, wenn die Verweildauer des Harns in der Blase weniger als 4 Stunden betrug, wenn die Erreger der Harnwegsinfektion nicht reduzierend wirken oder der Urin durch die Ernährung keine ausreichenden Mengen an reduzierbarem Nitrat enthält. Leukozyten: Zusammensetzung: derivatisierter Pyrrolaminosäureester; Diazonium Salz. Der Test enthält ein Derivat des Pyrrolaminosäureesters und weist die Esterase- Aktivität von Granulozyten nach. Bei der Reaktion entsteht 3-Hydroxy-5-phenylpyrrol, das mit einem Diazoniumsalz zu einem violetten Farbstoff reagiert. Testfeld Ergebnis Testfeld Ergebnis Ketonkörper... Bilirubin... Protein... Urobilinogen... Nitrit... spez. Gewicht... Erythrozyten... Glucose... Leukozyten... ph... 13

14 Fragen 1. Welche Stoffwechsel-Endprodukte, die mit dem Urin ausgeschieden werden, entstehen aus Kohlenhydraten, Lipiden, Proteinen und Nucleinsäuren? 2. Wovon hängt die Harnsäure-Ausscheidung ab? Wann spricht man von Hyperuricämie, welche Symptome treten auf und wie kann man sie therapeutisch beeinflussen? 3. Welche Aminosäuren sind die Stickstoff-Donatoren im Harnstoffcyclus? Wie werden die Aminogruppen der anderen Aminosäuren auf diese Donatoren übertragen? Wie ist die Energiebilanz des Harnstoffcyclus? 4. Wie wird die Menge an abgebauten Aminosäuren aus der Menge an ausgeschiedenem Harnstoff berechnet? Welchen Einfluss hat die Wertigkeit der mit der Nahrung zugeführten Proteine auf die Harnstoffsynthese? 5. Unter welchen Stoffwechsel-Bedingungen treten vermehrt Ketonkörper im Harn auf? 6. Welches sind die physiologischen Funktionen von Cortisol? Welches sind die Ursachen und Krankheitssymptome bei Morbus Addison und Morbus Cushing? Was versteht man unter der glucocorticoiden und mineralcorticoider Wirkung von Nebennierenrinden-Steroiden? 7. Wie entsteht xalsäure und wie wird sie ausgeschieden? 8. An welchen Reaktionen ist Ascorbinsäure im rganismus beteiligt? 9. Wie wird der ph-wert des Urins reguliert? Wie entsteht alkalischer Harn? 10. Wann werden vermehrt Hydroxyprolin und Hydroxylysin ausgeschieden? Woher stammen diese Aminosäuren? Warum werden die im Blutplasma gut vertretenen Aminosäuren kaum im Urin ausgeschieden? 11. Wie wird Kreatinin gebildet und ausgeschieden? 12. Welche Reaktionen finden bei der 1. und 2. Phase der Biotransformation statt? 13. Nennen Sie die typischen Bestandteile von Harnkonkrementen und die Ursachen ihrer Bildung. 14. Wie wird Bilirubin gebildet und ausgeschieden? Was versteht man unter dem Begriff Kernikterus? 15. Welche Säuren können bei normalem und pathologischem Stoffwechsel gebildet werden und zur Ausscheidung von Protonen mit dem Urin 14