Lebend / Tot Differenzierung von bierschädlichen Bakterien mittels Real-Time PCR

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Steffen Althaus
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1 Lebend / Tot Differenzierung von bierschädlichen Bakterien mittels Real-Time PCR Autoren: Dipl.-Ing. Andreas Brandl, Dr.-Ing. Christoph Tenge, Prof. Dr.-Ing. Eberhard Geiger, Lehrstuhl für Technologie der Brauerei II, TU München, Freising-Weihenstephan Schlagzeile (Fettgedruckt) Durch die Verwendung einer neuen Probenaufarbeitung gelang die spezifische Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen aus Bierproben direkt mittels PCR. Falsch-positive PCR Befunde in Brauereien können somit vermieden werden. Einleitung Real-Time PCR Systeme sind schon seit einiger Zeit wertvolle Analyseninstrumente in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle. Ein bisher ungelöstes Problem stellte allerdings die - meist theoretische - Möglichkeit falsch positiver Befunde durch den Nachweis freier DNA oder die Detektion toter Zellen mittels PCR dar. Da DNA auch nach dem Zelltod ein relativ stabiles Molekül ist, war ein positives PCR Ergebnis nach erfolgter KZE oder Pasteurisation somit bisher nicht eindeutig zuordenbar. Durch den Zusatz von Ethidium Monoazid (EMA) während der PCR- Probenaufarbeitung könnte dieses Problem verhindert werden, so daß der selektive Nachweis von lebenden Keimen mittels PCR ermöglicht wird [1]. Die an pathogenen Keimen bereits erprobte Methode wurde in diesem Fall für die Detektion von bierschädlichen Bakterien angewandt. Wirkungsweise von EMA 1) EMA durchdringt spezifisch die Membranen toter Zellen und lagert sich in den Zellen in doppelsträngige DNA ein. Weiterhin interkaliert EMA in freie DNA, die sich in der Probe befindet. Freie DNA oder tote Zellen können z.b. vorliegen, wenn kontaminiertes Rückbier zum Würzekochen beigemischt wird. 2) Aktiviert man anschließend das EMA mit Hilfe von Lichtenergie, bindet dieses kovalent an DNA, wodurch diese DNA einer nachfolgenden PCR nicht mehr zur Verfügung steht (aktiviertes EMA: aema). 3) Im Anschluß kann jetzt die DNA-Isolierung der Probe erfolgen. Die extrahierte DNA aus lebenden Zellen kann durch aema nicht mehr inhibiert werden und kann mittels PCR detektiert werden [1]. Material und Methoden: Testorganismus Die prinzipielle Wirkungsweise der neuen Methode wurde anhand des am häufigsten auftretenden obligaten Bierschädlings, L. brevis, erprobt.

2 Kurzzeiterhitzung 0,5 ml Bierproben in 1,5 ml Eppendorf Tubes wurden in Doppelbestimmung mit einer Keimzahl von 4*10^6 Keimen/Probe versetzt und bei 72 C im Wasserbad 1, 3 und 5 Minuten inkubiert. Nach der KZE wurden 10 µl Aliquots der Proben 1:100 verdünnt und hiervon wiederum 20µl auf MRS-Agarplatten ausplattiert, um den Abtötungserfolg bzw. die Lebendzellzahl in den Proben zu bestimmen. Behandlung der Proben mit EMA Nach der KZE wurde ein Teil der Proben mit 50 mg/ml EMA versetzt. Die Einwirkzeit auf die Probe (in Dunkelheit) betrug 5 Minuten. Im Anschluß wurde die Probe 3 min. mit einer 50 Watt Halogenlampe bestrahlt. Es sollte beachtet werden, daß EMA bei chronischem Kontakt mit der Haut mutagen wirken kann. Daher sind bei diesem Pipettierschritt Schutzhandschuhe zu tragen. DNA Isolation und PCR Assay Die DNA Isolierung erfolgte durch Zentrifugation der Proben und anschließendem mechanischem Zellaufschluß des Bakterienpellets. Für die nachfolgende Real-Time PCR mit TaqMan-Sonden wurde der BioRad icycler verwendet. Als PCR-Assay kam ein kombiniertes Screening-System zur Erfassung bierschädlicher Lactobazillen/Pediokokken sowie Pectinatus/Megasphaera mit integrierter interner PCR-Kontrollreaktion zum Einsatz. Das verwendete Real-Time PCR-System wurde am Lehrstuhl für Technologie der Brauerei II entwickelt. Darstellung der PCR Ergebnisse Die PCR-Ergebnisse werden in einem Diagramm dargestellt, in dem die Anzahl der PCR-Zyklen (Cycle) gegen die Fluoreszenzintensität (RFU) aufgetragen ist. Positive Proben zeigen einen Fluoreszenzanstieg, während negative Proben mehr oder weniger parallel zur x-achse verlaufen. Der Maßstab für die Stärke eines PCR- Signals sind die Ct-Werte, die angeben, wann die Fluoreszenz einen gewissen Schwellenwert übersteigt und somit positiv gewertet wird. Je niedriger die Ct-Werte sind desto stärker ist demnach das PCR-Signal. Ergebnisse Auswirkung von EMA auf freie DNA Zuerst wurde die Auswirkung einer EMA-Behandlung auf Rein-DNA getestet. Hierzu wurde eine Lösung von L. brevis-dna mit 50 mg/ml EMA versetzt und wie oben behandelt. Durch die EMA Behandlung konnte sämtliche freie DNA in der Probe inaktiviert werden (siehe Abb. 1). Andererseits wurde auch gezeigt, daß eine EMA behandelte Probe die PCR-Reaktion nicht inhibiert, da die im PCR-Mix enthaltene interne Positivkontrolle positiv verlief.

Behandlung der Proben mit EMA Nach der KZE wurde ein Teil der Proben mit 50 mg/ml EMA versetzt. Die Einwirkzeit auf die Probe (in Dunkelheit) betrug 5 Minuten. Im Anschluß wurde die Probe 3 min.

3 Abb. 1: Auswirkung von EMA auf freie DNA Auswirkung von EMA auf kurzzeiterhitzte Bierproben Die beimpften Proben wurden in Vierfachbestimmung jeweils 1,5, 3 und 5 Minuten bei 72 C kurzzeiterhitzt. Anschließend wurden jeweils zwei Proben mit EMA behandelt und der DNA-Isolation unterzogen, während aus den anderen zwei Proben gleich nach KZE eine DNA-Isolation erfolgte. Desweiteren wurden noch zwei gänzlich unbehandelte angeimpfte Proben untersucht (weder KZE noch EMA behandelt) und zwei Proben, zu denen zwar EMA gegeben wurde, die aber nicht erhitzt wurden. Somit konnte die Auswirkung von EMA auf lebende Zellen untersucht werden. Bei den mit EMA behandelten L. brevis-proben war bereits eine einminütige KZE ausreichend, um ein PCR Signal zu unterdrücken. Diese Ergebnisse wurden auch durch das Wachstum auf den MRS-Platten bestätigt. Schon nach einer KZE Dauer von 1 min. war kein Wachstum auf MRS Platten mehr feststellbar. Der nachfolgenden Abbildung kann man die Ergebnisse der unbehandelten Proben, nach 1 min. KZE ohne EMA und nach 1 min. KZE mit EMA entnehmen (siehe Abb. 2). Abb.2: Auswirkung von EMA auf kurzzeiterhitze Bierproben

Desweiteren wurden noch zwei gänzlich unbehandelte angeimpfte Proben untersucht (weder KZE noch EMA behandelt) und zwei Proben, zu denen zwar EMA gegeben wurde, die aber nicht erhitzt wurden.

4 Alle weiteren erzielten Ergebnisse sind der Tabelle 1 zu entnehmen: Tabelle 1: Auswirkung von EMA auf kurzzeiterhitzte Proben (Probe1 / Probe2) PCR-Ergebnis (Ct-Werte) mit EMA PCR-Ergebnis (Ct-Werte) ohne EMA Wachstum auf MRS-Agar (CFU) KZE Dauer [min] ohne KZE neg / neg neg /neg neg /neg 28,5 / 27,9 32,7 / 30,3 31,8 / 32,6 32,3 / 33,5 26,4 / 25,7 neg /neg neg /neg neg /neg 245 / 270 Die Ct-Werte der EMA-behandelten Proben ohne KZE sind etwas höher als die unbehandelten Proben. Dies läßt sich dadurch erklären, daß in Lebend-Kulturen immer auch ein geringer Prozentsatz toter Zellen und freie DNA vorliegt, die dann durch die EMA Behandlung inaktiviert werden. In Folgeversuchen muß noch die optimale EMA-Einsatzkonzentration gefunden werden, um einen Sensitivitätsverlust durch z.b. Überkonzentration an EMA auszuschließen. Zusammenfassung Alle bisher erprobten Ansätze zum direkten Lebend/Tot Nachweis mittels PCR, z. B. Reverse-Transkiptase PCR zum Nachweis von RNA, erwiesen sich bisher als untauglich, um mittels PCR lebende Zellen detektieren zu können [2]. Die derzeit praktizierte Methode, um solche Befunde in der Praxis zu bewerten, besteht meist in einer 1-2-tägigen Nachanreicherung der Proben nach erfolgter KZE, um festzustellen, ob sich das PCR-Signal nach KZE verstärkt und somit auf lebende Keime hindeutet. Die hier vorgestellte Methode liefert einen sehr vielversprechenden Ansatz, um dieses Problem mit einer schnelleren und leicht durchzuführenden Probenaufarbeitung zu lösen. Es könnten sowohl PCR-Signale von freier DNA als auch falsch-positive Signale von toten Zellen vermieden werden. Somit könnte zukünftig auch die eindeutige Auswertbarkeit von z. B. kurzzeiterhitzten oder pasteurisierten Proben ermöglicht werden. Weitergehende Versuche zur optimalen EMA-Einsatzkonzentration und mit einem erweiterten Keimspektrum sind noch durchzuführen. Desweiteren gilt es, die Eignung der Methode unter Praxisbedingungen zu bestätigen. Danksagung Die hier erzielten Ergebnisse entstanden im Rahmen eines EU-Projektes, das finanziell unterstützt wird durch die EU Commission, Quality of Life and Management of Living Resources, Key action 1: Food, nutrition and health, Contract No. QLK1-CT

Ct-Werte der EMA-behandelten Proben ohne KZE sind etwas höher als die unbehandelten Proben.

5 Literatur [1] Nogva, H. K., et al.; Ethidium Monoazide for DNA-Based Differentiation of Viable and Dead Bacteria by 5 -Nuclease PCR; BioTechniques 34: (April 2003) [2] Juvonen, R., et al.; Real-Time RT-PCR Detection Of Beer-Spoilage Lactic Acid Bacteria; ASBC Newsletter; Vol. 62 (2002) Nr: 2 ;pp. PB26

Bacteria by 5 -Nuclease PCR; BioTechniques 34:804-813 (April 2003) [2]

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