Empfehlungen zur Validierung von Analysenmethoden in der Forensischen Toxikologie

Transkript

1 Schweizerische Gesellschaft für Rechtsmedizin SGRM Société Suisse de Médecine Légale SSML Società Svizzera di Medicina Legale SSML Gruppe Forensische Toxikologie Empfehlungen zur Validierung von Analysenmethoden in der Forensischen Toxikologie Erarbeitet von der Arbeitsgruppe Validierungen : Beat Aebi (Gruppenleiter), Institut für Rechtsmedizin Bern Markus Baumgartner, Institut für Rechtsmedizin Zürich Jean-Luc Dubugnon, Institut de Chimie Clinique Lausanne Franz Dussy, Institut für Rechtsmedizin Basel Christian Giroud, Institut de Médecine Légale Lausanne Olivier Plaut, Institut de Médecine Légale Genève Walter Sturm, Institut für Rechtsmedizin St. Gallen Genehmigt an der Sitzung vom 7. November 2002 Seite 1/18

2 INHALTSVERZEICHNIS SEITE 1 Ziel und Zweck 3 2 Geltungsbereich 3 3 Unterlagen 3 4 Validierung Allgemeines Vorgaben zur Validierung Durchführung Auswertung Typen von Validierungen Prospektive Validierung Retrospektive Validierung Besonderheiten bei qualitativen Analysenmethoden Qualitative Bestätigungsanalysen Immunologische Screenings Chromatographische Screenings Allgemeine Suchanalysen, General Unknown Screenings Messunsicherheit 8 5 Anhang: Beispiel eines Validierungsplanes 10 6 Anhang: Beispiel eines Validierungsberichtes 13 7 Anhang: Zusätzliche Literatur 16 8 Anhang: Erläuterung der verwendeten Begriffe 17 Seite 2/18

3 1 Ziel und Zweck Grundsätzlich wird mit der Validierung überprüft, ob eine Analysenmethode das hält, was sie angibt zu können. Die vorliegenden Empfehlungen sind eine Hilfe zur Validierung von chemischen Analysenmethoden in der forensischen Toxikologie und sollen zu einer möglichst einheitlichen Vorgehensweise führen. Die Empfehlungen sollen nach erfolgter Umsetzung und anhand gewonnener Erfahrungen zu gegebener Zeit nochmals in der Arbeitsgruppe Validierungen besprochen werden. 2 Geltungsbereich Bereich forensische Toxikologie; für die Mitglieder der Arbeitsgruppe Toxikologie der Sektion Forensische Chemie und Toxikologie FCT der Schweizerischen Gesellschaft für Rechtsmedizin SGRM. 3 Unterlagen SN EN ISO/IEC 17025: 1999, Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien, im Text als ISO bezeichnet ISO 9000:2000: Qualitätsmanagement-Begriffe (vormals ISO 8402:1995) Guidelines for Accreditation of the Swiss Laboratories Performing Forensic Toxicological Analyses, Document Nr. 315.e, Emission March 2001, Rev. 00, Schweizerische Akkreditierungsstelle Leitfaden zur Akkreditierung von Schweizer Laboratorien zur Durchführung Forensischer Drogenanalytik, Entwurf der Arbeitsgruppe Forensische Chemie, , Schweizerische Akkreditierungsstelle Zusätzliche Unterlagen im Anhang (Kapitel 7), Erläuterungen der Begriffe (d/f/e) ebenfalls im Anhang (Kapitel 8). Seite 3/18

4 4 Validierung 4.1 Allgemeines Mit der Validierung einer Analysenmethode wird der Nachweis erbracht, dass diese den gestellten Anforderungen entspricht. Diese Anforderungen müssen schriftlich festgehalten werden. Die Verantwortlichkeiten zur Durchführung der Validierung müssen klar geregelt sein. 4.2 Vorgaben zur Validierung Jede Analysenmethode kann validiert werden. Für Analysenmethoden innerhalb des Geltungsbereiches der Akkreditierung schreibt die ISO eine Validierung vor. Die Validierung einer Methode setzt voraus: Die Methodenentwicklung ist abgeschlossen und es sind keine grösseren Schwächen zu erwarten. Die Methode ist schriftlich festgehalten und die verantwortliche Person hat die Methode für den Gebrauch freigegeben. Die zu erreichenden Anforderungen an die Methode (Linearität, LOD, LOQ, Präzision, usw.) sind schriftlich im Validierungsplan festgehalten; eine Validierung aufgrund von Entwürfen ist nicht sinnvoll. 4.3 Durchführung Die Validierung umfasst Parameter wie Bestimmungsgrenze (LLOQ), Nachweisgrenze (LOD), Wiederholbarkeit, Präzision, Wiederfindung (recovery), Standardabweichungen, Arbeitsbereich, Grenzwerte usw. Im Anhang (Kapitel 5 und 6) sind je ein Beispiel eines Validierungsplanes und eines Validierungsberichtes beigelegt. Anhand der zu erhebenden Daten werden die einzelnen Punkte des Validierungsplanes überprüft und im Validierungsbericht festgehalten. Wichtig ist eine intensive Vorbereitung der gesamten Validierung durch die verantwortlichen Personen, zusammen mit dem Laborpersonal. Dazu gehören sowohl Absprachen zur Planung und Durchführung (Timing) als auch die praktischen Vorbereitungen, z.b. Herstellung von Lösungen, gespikter Proben, Zustand der Analysengeräte, Zugriff auf Rückstellmuster oder Referenzproben, usw. Die Verwendung spezieller Validierungssoftware (z.b. VALISTAT der GTFCh, MVA der Firma Novia) für die Auswertung der Daten ist empfehlenswert. Seite 4/18

5 Der Umfang einer Validierung muss den Vorgaben und den Gegebenheiten angepasst sein. Einen für alle Analysenmethoden gültigen und einheitlichen Validierungsplan kann es deshalb nicht geben. Sind bei der zu validierenden Methode Schwachstellen bekannt, so sind diese speziell zu berücksichtigen und gezielt zu überprüfen. 4.4 Auswertung Alle Resultate und die gemachten Feststellungen und Beurteilungen werden im Validierungsbericht festgehalten. Die verantwortliche Person legt der vorgesetzten Stelle (i.d.r. Abteilungs- oder Laborleiter) diesen Validierungsbericht zur Ansicht und Freigabe vor. Validierungsbericht und Validierungsplan sind Q-Dokumente, welche der Dokumentenlenkung unterstellt sind. Nach erfolgter Validierung ist folgendes möglich: Validierung erfolgreich: Resultate werden in die Methode übertragen, Methode kann als validierte Methode freigegeben werden; Validierung erfolgreich (mit Auflagen): Auflagen müssen erfüllt werden, dann kann die Methode als validierte Methode freigegeben werden; Validierung nicht erfolgreich: Methode muss überarbeitet werden, eventuell nochmalige (Teil-) Validierung. 4.5 Typen von Validierungen Formell kann man in prospektive und retrospektive Validierung unterteilen. Bei der prospektiven Validierung wird eine neu entwickelte Methode validiert. Man kann noch nicht auf Erfahrungen und Daten, die mit dieser Methode gewonnen wurden, zurückgreifen. Der Validierungsplan kann in absolut systematischer Weise abgearbeitet werden. Im Gegensatz dazu stehen bei der retrospektiven Validierung schon etliche Daten und Erfahrungen zur Verfügung, auf die bei der Validierung zurückgegriffen werden kann. Demzufolge müssen nicht mehr alle im Validierungsplan benötigten Daten neu erhoben werden. Es steht den Verantwortlichen natürlich frei, auf die Verwendung bestehender Daten zu verzichten und alle Rohdaten für die Validierung neu zu erheben. Die Validierung sollte mit einem straffen Zeitplan durchgeführt werden. Zieht sie sich über mehrere Monate hin, besteht die Gefahr, dass die Anforderungen an die Methode oder die Methode selbst wieder ändern, wodurch eventuell nochmals zusätzliche Analysen notwendig werden. Seite 5/18

6 4.5.1 Prospektive Validierung Die Validierung wird direkt nach der Methodenentwicklung durchgeführt. Es stehen nur die Daten der Methodenentwicklung zur Verfügung. Üblicherweise ist bei einer Methodenentwicklung mit Validierung der folgende Ablauf anzutreffen: Neue Aufgabenstellung Entschluss zur Erstellung einer neuen Methode Zuteilung der Aufgaben Durchführung der Methodenentwicklung Überprüfung der Methodenentwicklung und Anwendbarkeit (z.b. mit Referenzproben) Validierung Retrospektive Validierung Im Gegensatz zur prospektiven Validierung ist bei der retrospektiven Validierung die Methode bereits vor längerer Zeit entwickelt und seither erfolgreich eingesetzt worden. Die Methode wurde bereits in die Routine übernommen. Die vorhandenen Daten (Kalibrierungen, Qualitätskontrollen, Ringversuche, Positiv- und Negativkontrollen usw.) können nun für die Validierung verwendet werden. Der zusätzliche analytische Aufwand für die Validierung ist demzufolge meistens kleiner. Der Laborleiter und das Laborpersonal besitzen bereits viel Erfahrung mit dieser Methode. Falls zusätzliche Analysen für die Validierung gemacht werden müssen, können die Anforderungen sehr genau definiert werden. Die Aussagekraft ist entsprechend höher. Die forensisch-toxikologischen Laboratorien der Schweiz führen seit vielen Jahren erfolgreich Analysen durch. Diese sind bisher nicht gemäss ISO validiert worden, weshalb in Zukunft im Zusammenhang mit angestrebten Akkreditierungen Validierungen zu erwarten sind. 4.6 Besonderheiten bei qualitativen Analysenmethoden Die Validierung qualitativer Methoden unterscheidet sich von der Validierung quantitativer Methoden. Der Begriff qualitative Analysenmethoden umfasst unter anderem die folgenden Analysenmethoden und -verfahren: qualitative Bestätigungsanalysen einzelner Wirkstoffe oder Wirkstoff-Gruppen Gezieltes Screening, immunologisch Gezieltes Screening, chromatographisch Allgemeine Suchanalysen, General Unknown Screenings Die Validierung dieser qualitativen Methoden enthält einige spezielle Bestimmungen. Seite 6/18

7 4.6.1 Qualitative Bestätigungsanalysen Die Validierung ist für alle Substanzen durchzuführen, welche mit dieser Methode routinemässig nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze (LOD) sowie die Präzision nahe der LOD sind zu überprüfen. Die Überprüfung der Bestimmungsgrenze (LLOQ) entfällt Immunologische Screenings Für immunologische Screenings werden üblicherweise kommerzielle Tests verwendet. Eine vollständige Validierung wird nicht durchgeführt. Es wird empfohlen, die festgelegten Nachweisgrenzen (cut-offs) gemäss den Herstellerangaben für einzelne Substanzen zu überprüfen. Die Teilnahme an Ringversuchen für immunologische Tests wird empfohlen Chromatographische Screenings Gezielte chromatographische Screenings können als Zusammenfassung einer Vielzahl von qualitativen Bestätigungsanalysen angesehen werden. Die Validierung ist für alle Substanzen durchzuführen, welche mit dieser Methode routinemässig nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze (LOD) sowie die Präzision nahe der LOD sind zu überprüfen. Die Überprüfung der Bestimmungsgrenze (LLOQ) entfällt Allgemeine Suchanalysen, General Unknown Screenings Die allgemeinen Suchanalysen (General Unknown Screenings) stellen einen Sonderfall dar. Mittels instrumenteller Analytik wird versucht, Hinweise auf unbekannte Substanzen zu erhalten. Innerhalb des General Unknown Screenings gibt es keine Garantie dafür, dass bei einem negativen Ergebnis effektiv keine toxikologisch relevanten Substanzen in der Probe vorhanden sind. Gründe dafür sind u.a.: Extraktionsausbeuten (ph / pka, Verluste) chemisch stark unterschiedliche Substanzen stark unterschiedliche pharmakologisch wirksame Konzentrationsbereiche nachzuweisenden Substanzenmengen teilweise sehr unterschiedlich Matrixeffekte Stabilität der Substanzen Neue Substanzen, welche noch nicht in Spektrenbibliotheken vorhanden sind Seite 7/18

8 Ein allgemeines Screening, welches alle Gifte dieser Welt nachzuweisen vermag, gibt es nicht. Das Resultat, also der Nachweis oder Ausschluss unbekannter Substanzen kann deshalb nicht überprüft werden. Die verschiedenen Methoden für eine allgemeine Suchanalyse (General Unknown Screening) sind im Fachbereich der forensischen Toxikologie akzeptiert. Auch wenn keine Gewissheit besteht, eine bestimmte Substanz mit der notwendigen Wahrscheinlichkeit nachzuweisen oder auszuschliessen, so sind diese Analysenmethoden weltweit erfolgreich im Gebrauch und können deshalb als erprobt und zuverlässig bezeichnet werden. Im Gegensatz zur Validierung aller anderer Methoden (quantitative und qualitative), wo vorwiegend mit Zahlenwerten gearbeitet werden kann, müssen hier vor allem die Einhaltung und Umsetzung der Methode überprüft werden. Dies sollte unter anderem die folgenden Punkte beinhalten: Ist in der Analysenvorschrift klar definiert, was die Methode können soll und was nicht? Wurde das zu verwendende Gerät vorgängig überprüft (Gerätetest)? Wird die Methode mit einem zugespikten Testmix überprüft (Methodentest)*? Werden Qualitätskontrollen mit bekanntem Inhalt mitanalysiert? Sind alle Geräteparameter klar definiert (z.b. für die chrom. Integration)? Ist das Laborpersonal in der Auswertung von Daten geschult? Weiss das Laborpersonal, was bei unklaren Fällen zu tun ist? Werden unaufgeklärte Spektren für eine nachträgliche Aufklärung gespeichert? Sind die Resultate eindeutig als Hinweise gekennzeichnet? * Mit der Verwendung eines Methodentests kann die Einhaltung der Analysenvorschrift überprüft werden (siehe auch 4.6.4, 2. Abschnitt). Mit einem internen Standard kann zudem die Extraktion kontrolliert werden. 4.7 Messunsicherheit Mit der Norm ISO wurde erstmals der Begriff der Messunsicherheit eingeführt. Zufällige und systematische Abweichungen wie auch die Richtigkeit und Präzision innerhalb einer Messung werden zusammengefasst und als Messunsicherheit bezeichnet. Die Messunsicherheit kann z.b. durch eine statistische Berechnung oder auch geordnete Schätzung aller Teilunsicherheiten oder anderer statistischer Daten bestimmt werden. Im Falle forensisch-toxikologischer Analysen ist dies jedoch sehr schwierig, vor allem aus folgenden Gründen: Seite 8/18

9 Die Proben sind nicht einheitlich und auch nicht standardisierbar ("Standard"-Blut) Es gibt deshalb kein zertifiziertes Referenzmaterial (CFRM) Die Labors haben keinen direkten Einfluss auf Probennahme, Lagerung und Transport in das Labor Es gibt keine standardisierten Analysenverfahren (wie z.b. Pharmakopoe) Teilunsicherheiten können i.d.r. nicht bestimmt werden, da die Analysenverfahren aus mehreren Schritten bestehen, die natürlich von einander abhängen, und die Messkette nur einen Detektionsschritt enthält. Aus Erfahrung kann festgestellt werden, dass folgende Parameter in der forensisch-toxikologischen Analytik nur einen kleinen Teil an die MU liefern: Waagen und kalibrierte Pipetten (korrekte Bedienung und Wartung vorausgesetzt) Probenmengen sind i.d.r. limitiert, Mehrfachbestimmungen deshalb nicht immer möglich Konzentrationen und Stabilitäten von Kalibratoren und Standards Undeuterierter Anteil von Standards (üblicherweise kleiner als 1%) Gerätebezogene Fehler bei der Einspritzung, Trennung, Akquisition und Integration (korrekte Bedienung und Wartung vorausgesetzt) Konzentrationen von Lösungsmitteln, Pufferlösungen und deren phs Die grösseren Anteile an die Messunsischerheit liefern: Probennahme und Lagerung (ausserhalb des Einflussbereiches des Labors) Qualität der Referenzproben Extraktion wegen z.t. erheblicher Matrixeffekte Chemisch-physikalische Effekte an Oberflächen (v.a. Adsorption, Absorption) Störung des Nachweises durch unregelmässig auftretende Matrixeffekte Stabilitäten von zugegebenen Kalibratoren und Standards im Extrakt Stabilitäten des Analyten in der Probe und im Extrakt (v.a. bei der Verwendung nicht-deuterierter interner Standards) Es wird deshalb empfohlen, die Messunsicherheit mittels der Validierungsdaten, Kontrollkarten, Ringversuche u.a. abzuschätzen. Dazu können die Wiederholpräzision, Laborpräzision und Vergleichspräzision verwendet werden. Seite 9/18

10 5 Anhang: Beispiel eines Validierungsplanes Vorschlag eines Validierungsplanes im multiple choice Format, welches als Grundlage für Validierungen verwendet werden kann. Kursiv: Kommentare, Ergänzungen und Beispiele Methodenname M-SOP-Nr.: Kurzbeschreibung: Überprüfung der Validierungsparameter (gemäss RL-nummer Validierungen). Verwendete Unterlagen: Ordner, Datenfiles Zu erstellende Unterlagen: Datenfiles, Ausdrucke 1 Überprüfung der Selektivität a) Blindprobe negativ (z.b. Blindwertblut, Leerserum) b) Lösungsmittel negativ c) Unterster Kalibrationspunkt positiv (autom. Erkennung oder manuell mit S/N >=3) d) Positivprobe positiv (z.b. Referenzserum als Qualitätskontrolle QC) 2 Überprüfung der Linearität a) Unterster Kalibrationspunkt kleiner als Bestimmungsgrenze (LOQ) b) Korrelationsfaktor > 0.98 (üblicherweise > 0.99) c) Anzahl Kalibrationspunkte: (mindestens 5, ohne Leerprobe, für max. 2 Dekaden) d) Kalibrationskurve linear (Typ ax + b): e) Kalibrationskurve nicht-linear:... f) Linearität berechnet mit MVA g) Linearität berechnet mit Chemstation h) Linearität berechnet mit Excel (z.b. Mandeltest) 3 Arbeitsbereich a) Von... bis... Gew.-Promille b) Von... bis... Gew.-Prozent c) Von... bis... ng/ml d) Von... bis... [Einheit] 4 Überprüfung der Richtigkeit / Wiederfindung a) Vergleich mit Referenzproben b) Verwendung von deuterierten ISTDs / Vergleich mit Response des deut. Testmixes c) Standardaddition zu Nullproben / Vergleich mit Response des Testmixes d) Vergleich mit einer bereits validierten Zweitmethode e) Bestimmung der absoluten Wiederfindung f) Andere... Seite 10/18

11 5.1 Überprüfung der Wiederholpräzision a) 5-fach Bestimmung einer Referenzprobe (Zielwertanalyse) b) 3-fach Bestimmung von je 3 Konzentrationen (z.b. Kalibrationspunkte) c) 3-fach Bestimmung von je 3 Referenzproben unterschiedlicher Konzentration d) Andere Überprüfung der Laborpräzision a) Mindestens 2 eingewiesene Laboranten / innen b) Pro Laborant/in mind. 3-fach Bestimmung von einem Kalibrationspunkt c) Pro Laborant/in mind. 3-fach Bestimmung von einer Referenzprobe d) Andere Überprüfung der Vergleichspräzision a) Resultatevergleich von Ringversuchen b) Andere... 6 Überprüfung der Nachweisgrenze a) Rohdatenfile im Excelformat vorhanden b) Auswertefile im MVA-Format vorhanden c) Berechnung mittels Chromatogramm S/N (mind.... zu 1) d) Berechnung mittels MVA: 7 Überprüfung der Bestimmungsgrenze a) Rohdatenfile im Excelformat vorhanden (zusammen mit Punkt 6a) b) Auswertefile im MVA-Format vorhanden (zusammen mit Punkt 6b) c) Berechnung mittels Chromatogramm S/N (mind.... zu 1) d) Berechnung mittels MVA: 8 Überprüfung der Robustheit a) Beurteilung aller Punkte 1 bis 7 b) Stabilität bez. Temperatur c) Stabilität bez. Zeit d) Andere:... Empfehlung: Die Überprüfung der Robustheit ist relativ schwierig. Es hat sich bewährt, einerseits die Daten zu verwenden, aber auch das Laborpersonal konkret nach Schwachpunkten und Kontrollen zu befragen. Das Laborpersonal weiss i.d.r. sehr genau über die Methoden Bescheid und geben auch gerne Auskunft. Seite 11/18

12 9 System Suitability Test (Methodentest) a) Alle Prüfsubstanzen im Testmix b) Vergleich der Retentionszeiten c) Vergleich der Flächen d) Andere: 10 Abschätzung der Messunsicherheit Empfehlung: Die Messunsicherheit soll angeben, in welchem Bereich das Resultat mit 95% oder 99% Sicherheit liegt. Die Messunsicherheit kann streng statistisch aus der Summe der Quadrate der partiellen Messunsicherheiten bestimmt werden. Für forensisch-toxikologische Analysen ist dieser Ansatz wegen der Komplexität im allgemeinen nur bedingt anwendbar. Demzufolge muss die Messunsicherheit mit Hilfe von Erfahrungswerten (z.b. der Standardabweichung) abgeschätzt werden. 11 Statistische Prozesskontrolle (SPC) Alle Methoden müssen einer kontinuierlichen statistischen Kontrolle unterliegen. Empfehlung: Verwendung von Qualitätskontrollen in jeder Serie, welche nach Abschluss der Serie z.b. mit Excel erfasst werden. Dadurch kann die Reproduzierbarkeit über längere Zeit überwacht (Robustheit) und unvorhersehbare Störungen der Analysen erkannt werden. Es können beispielweise Retentionszeiten, Peakflächen und höhen, oder berechnete Gehalte verwendet werden. Bei der Analyse mehrerer Substanzen in einer Methode empfiehlt es sich, die kritischen Parameter nach ihrer Wichtigkeit aufzulisten und dann nur einige wenige Parameter auszuwählen. Der Aufwand sollte in einem guten Verhältnis zum Nutzen stehen. Sehr stabile Methoden brauchen weniger Überwachung als weniger stabile. 12 Besonderes, Bemerkungen Müssen besondere Punkte berücksichtigt werden, so sind sie hier festzuhalten. Seite 12/18

13 6 Anhang: Beispiel eines Validierungsberichtes Retrospektive Validierung, Beispiel Diazepam Methodenname: Qualitative und quantitative Bestimmung von Benzodiazepinen in Vollblut mit GC-ECD M-SOP-Nr.: M Kurzbeschreibung: Bestimmung gängiger Benzodiazepine mittels 2-fach GC mit Elektroneneinfangdetektoren ECD Verwendete Unterlagen: Exceldateien (Referenzserum.xls, Referenzserum-1.xls, SST-AB.xls, B-1.xls, B-2.xls) Ordner Benzodiazepine 1+2, Ordner Ringversuche Erstellte Unterlagen: Valid xls (Arbeitskopie aus Referenzserum-1.xls) Valid doc (Worddatei mit den MVA-Resultaten) MVA-Dateien: Valid MVA, Valid-305(diaz)-01.MVA Detektion: GC-ECD Überprüfung der Validierungsparameter (gemäss RL-87 Validierungen) 1 Überprüfung der Selektivität a) Blindprobe negativ Teilweise wurden durch die automatische Auswertung der Chemstation in den Nullbluten Benzodiazepine als positiv (im Spurenbereich) identifiziert. Der Grund liegt in der Chemstation-Software. Da die Retentionszeiten zum Teil leicht variieren, müssen die Peakfenster entsprechend breit sein. Liegen Untergrundpeaks innerhalb dieser Integrationsfenster, werden sie automatisch als Substanz gekennzeichnet. Dieser Fehler ist bekannt. Entsprechend werden alle Auswertungen von Hand überprüft. In den Nullbluten konnten keine Benzodiazepine bestätigt werden. Die Resultate sind in der Datei valid , Ordner BW und MeOH-Spülung, festgehalten. b) Lösungsmittel negativ c) Unterster Kalibrationspunkt positiv d) Positivprobe positiv 2 Überprüfung der Linearität a) Unterster Kalibrationspunkt kleiner als Bestimmungsgrenze (LOQ) b) Korrelationsfaktor > 0.98 c) Anzahl Kalibrationspunkte: Mindestens 4 d) Kalibrationskurve linear (Typ ax + b) e) Kalibrationskurve nicht-linear:... f) Linearität berechnet mit MVA g) Linearität berechnet mit Chemstation h) Linearität berechnet mit Excel Alle Resultate sind in der Datei valid doc abgespeichert. 3 Messbereich a) Von... bis... Gew.-Promille b) Von... bis... Gew.-Prozent c) Von... bis... ng/ml Diazepam: Von 59 bis 600 ng/ml d) Von... bis... [Einheit] Seite 13/18

14 4 Überprüfung der Richtigkeit / Wiederfindung a) Vergleich mit zertifizierten Referenzproben Säule A: Mittlere Wiederfindung 94.29%, 95 % Vertrauensbereich / % Säule B: Mittlere Wiederfindung 88.00%, 95 % Vertrauensbereich / % signifikanter Unterschied zu 100 %! Zur Zeit stehen keine besseren Referenzproben (d.h. Vollblut) zur Verfügung. b) Verwendung von deuterierten ISTDs / Vergleich mit Response des deut. Testmixes c) Standardaddition zu Nullproben / Vergleich mit Response des Testmixes d) Vergleich mit einer bereits validierten Zweitmethode e) Absolute Wiederfindung: Zwischen 90 und 106% für den Arbeitsbereich (LLOQ bis höchster Kalibrator). Berechnung aus den Peakflächen der Kalibration (aus Blut) und des SST (aus Methanol). f) Andere Überprüfung der Wiederholpräzision a) 5-fach Bestimmung einer Referenzprobe (Zielwertanalyse): Sollwert t-test Säule A: Variationskoeffizient % / Säule B: Variationskoeffizient 6.82 % b) 3-fach Bestimmung von je 3 Konzentrationen (z.b. Kalibrationspunkte) c) 3-fach Bestimmung von je 3 Referenzproben unterschiedlicher Konzentration d) Andere Überprüfung der Laborpräzision a) Mindestens 2 eingewiesene Laboranten / innen (zur Zeit nur 1 Laborantin) b) Pro Laborant/in mind. 3-fach Bestimmung von einem Kalibrationspunkt c) Pro Laborant/in mind. 3-fach Bestimmung von einer Referenzprobe d) Andere Überprüfung der Vergleichspräzision a) Resultatevergleich von Ringversuchen RV xx-yy: Benzodiazepine: Unsere Werte liegen 1.2 Stabw oder 14.2 % absolut unterhalb des Sollwertes. Vorgaben +/- 30% erfüllt. b) Andere... 6 Überprüfung der Nachweisgrenze a) Rohdatenfile im Excelformat vorhanden b) Auswertefile im MVA-Format vorhanden c) Berechnung mittels Chromatogramm S/N mind. 3:1 d) Berechnung mittels MVA: LOD = 59 ng/ml 7 Überprüfung der Bestimmungsgrenze a) Rohdatenfile im Excelformat vorhanden (zusammen mit 6.a) b) Auswertefile im MVA-Format vorhanden (zusammen mit 6.b) c) Berechnung mittels Chromatogramm S/N mind. 10:1 d) Berechnung mittels MVA LLOQ = 179 ng/ml 8 Überprüfung der Robustheit a) Beurteilung gemäss bis 4.7 b) Stabilität bez. Temperatur c) Stabilität bez. Zeit d) Andere:... Seite 14/18

15 Die Beurteilung der Robustheit wird insofern erschwert, als dass zur Zeit keine Referenzproben in Vollblut existieren. Die Abweichungen von LOD und LLOQ innerhalb einer Substanz, berechnet aus den Kalibrationen, schwanken erheblich. Die Methode kann deshalb nur als grösstenteils robust bezeichnet werden. 9 System Suitability Test (Methodentest) a) Alle Prüfsubstanzen im Testmix b) Vergleich der Retentionszeiten c) Vergleich der Flächen d) Andere: Abschätzung der Messunsicherheit Aufgrund der festgestellten Präzisionen kann für Diazepam eine Messunsicherheit von +/- 20% abgeschätzt werden. Dies steht in Übereinstimmungen mit den Vorgaben der Ringversuche Drogen und Medikamente im Strassenverkehr (+ / - 30%). Allerdings konnte die Laborpräzision nicht ermittelt werden. 11 Statistische Prozesskontrolle (SPC): Die Methode ist in statistischer Kontrolle. 12 Abschliessende Bemerkungen A) Kalibration Die Kalibrationen müssen für jede Substanz festgesetzt und eingehalten werden. Für jede Substanz soll nur ein Kalibrationsbereich verwendet werden. Aufgrund der schwierigen Matrix Vollblut und der eingeschränkten Vergleichbarkeit zu den Referenzproben im Serum werden 6 Kalibrationspunkte für jede Substanz vorgeschlagen. Zusätzliche Kalibrationspunkte dürfen natürlich immer verwendet werden. B) Abgabe von Resultaten 0 bis < LOD: Negativ LOD bis < LLOQ: Positiv, Spur, ev. Richtwert = ng/ml LLOQ bis < höchster Kalibrationspunkt: Positiv, Wert = ng/ml Oberhalb höchstem Kalibrationspunkt: Stark positiv, Richtwert = ng/ml C) Dokumentation Die Resultate dieser Validierung sind in die Methode zu übernehmen. Es muss eine neue Versionsnummer vergeben werden. Die Beschreibung der Beurteilung des Nullblutes muss umfassender (Bezug, Datum) sein. Die Dokumentation wird ansonsten sehr sorgfältig geführt. Es wird zur Vereinfachung jedoch vorgeschlagen, nur noch ein maximal 2 Excelfiles mit allen Daten zu führen. D) Anzahl der eingeschulten Laboranten / innen Es wird empfohlen, dass mindestens 2 Laboranten / innen an der vorliegenden Methode ausgebildet sind und diese auch durchführen können. E) Resultat der Validierung Die Validierung ist erfolgreich bestanden. Wegen der zum Teil deutlichen Schwankungen der untersuchten Daten sowie nur einer eingearbeiteten Laborantin muss die Methode jedoch revalidiert werden. Der Q-Leiter legt den Termin dazu fest. Seite 15/18

16 7 Anhang: Zusätzliche Literatur Stavros Kromidas, Handbuch Validierung in der Analytik, Verlag Wiley-VCH, ISBN , 2000 Guidelines for Forensic Science Laboratories, ILAC/TAI(01)05 Forensic Toxicology Laboratory Guidelines, SOFT/AAFS 1997 version Laboratory Guidelines for Toxicological Analysis, TIAFT Bulletin 24(1), 7-16, 1994 Richtlinien des GTFCh zur Qualitätssicherung bei forensisch-toxikologischen Untersuchungen, GTFCh T+K 65(1) 18-24, 1998 Requirements for Initial Assay Validation and Publication in J. Chromatography B, Journal of Chromatography B, 707 (1998) 1.2 Ludwig Huber, Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Verlag Interpharm, ISBN , 1999, Eurachem / CITAG Guide, Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, second edition, draft April 2000 ( US-FDA, Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation for Human Studies, Draft, Dezember 1998 Eurachem, The Fitness for Purpose of Analytical Methods, first Internet version, December 1998 ( Eurachem/CITAG, Quality Assurance for Research and Development and Non-routine Analysis, Second Internet Version, november 1998 ( IUPAC/ISO/AOAC International/Eurachem, Harmonised Guidelines for the Use of Recovery Information in Analytical Measurement, ( E. Chapuzet, N. Mercier, S. Bervoas-Martin, B. Boulanger, P. Chevalier, P. Chiap, D. Grandjean, P. Hubert, P. Lagorce, M. Lallier, M.C. Laparra, M. Laurentie et J.C. Nivet. Méthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques: stratégie de validation. Rapport d'une commission SFSTP. S.T.P. Pharma Pratiques 7 (3) , 1997 E. Chapuzet, N. Mercier, S. Bervoas-Martin, B. Boulanger, P. Chevalier, P. Chiap, D. Grandjean, P. Hubert, P. Lagorce, M. Lallier, M.C. Laparra, M. Laurentie et J.C. Nivet. Méthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques. Exemple d'application de la stratégie de validation. Rapport d'une commission SFSTP. S.T.P. Pharma Pratiques 8 (2) , 1998 Seite 16/18

17 8 Anhang: Erläuterung der verwendeten Begriffe In diesem Kapitel werden die verwendeten Begriffe so beschrieben und erklärt, wie sie in diesen Empfehlungen verwendet wurden. Es ist zu berücksichtigen, dass je nach verwendeter Literatur und auch Sprache gewisse Unterschiede bestehen können. Grundsätzlich gelten die Festlegungen der entsprechenden Normen (SN EN ISO/IEC 17025:2000 und ISO 9000:2000, siehe Kapitel 3). Es wird deshalb empfohlen, dass jedes Labor klar festlegt, wie es die Begriffe beschreibt und auch verwendet. Messunsicherheit (MU), incertitude de mesure (IM), (uncertainty of the measurement) Jeder Messwert ist mit einer Messunsicherheit verbunden. Diese Messunsicherheit ist ein Parameter, der mit dem Resultat der Messung verknüpft ist und die Verteilung der Messwerte charakterisiert, die dem Analyten zugeordnet werden können. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik) Richtigkeit, justesse, (correctness) Richtigkeit ist das Mass der Übereinstimmung zwischen dem ermittelten Wert und einem als richtig angesehenen Wert. Die Prüfung auf Richtigkeit kann mittels Vergleich mit einer Referenzsubstanz oder bei Fehlen derselben allenfalls mit einer quantitativ abgesicherten Kontrollprobe erfolgen. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik) Präzision, précision, (fidélité), (precision) Die Präzision eines Analysenverfahrens wird üblicherweise durch die Wiederholpräzision, die Vergleichspräzision und die Laborpräzision beschrieben. Wiederholpräzision, répétabilité, (précision de répétition), (repeatability) Präzision innerhalb eines kurzen Zeitraumes unter unveränderten Arbeitsbedingungen. Wird zum Teil auch als intra-day precision bezeichnet. Vergleichspräzision, reproductibilité, (précision inter laboratoires), (reproducibility) Vergleich von Resultaten aus verschiedenen Laboratorien, jedoch unter Verwendung derselben Analysenmethode unter identischen Bedingungen. Die Laborpräzision ist nicht streng anwendbar auf die forensisch-toxikologische Analytik, weil unter anderem keine allgemein anerkannten Standardmethoden existieren. Die Laborpräzision kann deshalb nur unter Verwendung unterschiedlicher Analysenmethoden und unterschiedlicher Bedingungen, z.b. aus Ringversuchen, abgeschätzt werden. Laborpräzision, précision du laboratoire, (laboratory precision) Präzision innerhalb eines kurzen Zeitraumes unter veränderten Arbeitsbedingungen, z.b. unterschiedliches Personal, an verschiedenen Tagen durchgeführte Analysen. Wird zum Teil auch als inter-day precision bezeichnet. Robustheit, robustesse, (ruggedness, robustness) Die Robustheit ist die Fähigkeit eines Prüfverfahrens, ein Ergebnis zu liefern, das durch variierende Bedingungen nicht oder nur unwesentlich verändert wird, oder, das Ausmass von Änderungen der relevanten Einflussparameter zu beschreiben. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik) Wiederfindung, rendement, (recovery) Derjenige Anteil der Analytmenge, welcher nach Durchführung aller Arbeitsschritte noch nachgewiesen werden kann. Methodentest, test global de la méthode, (System Suitability Test) Überprüfung der Analysengeräte, ob sie den Ansprüchen zur Durchführungen einer bestimmten Analysenmethode genügen. Selektivität, sélectivité, (selectivity) Selektivität ist die Fähigkeit eines Prüfverfahrens, verschiedene, nebeneinander zu bestimmende Substanzen zu erfassen und somit eindeutig zu identifizieren. Anmerkung: Ein selektives Prüfverfahren liefert richtige Ergebnisse für alle interessierenden Analyten, wohingegen ein spezifisches Prüfverfahren richtige Ergebnisse für einen Analyten liefert, während andere Analyten sich gegenseitig stören können. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik) Seite 17/18

18 Linearität, linéarité, (linearity) Fähigkeit eines Prüfverfahrens, innerhalb eines bestimmten Bereiches Messergebnisse zu generieren, die von der Menge beziehungsweise Konzentration des Analyten in der Probe linear abhängig sind. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik). Linearität bedeutet nicht, dass die Kalibrierfunktion zwangsläufig linear (Typ y= ax + b) sein muss. Jeder Konzentration des Arbeitsbereiches muss aber ein Signal oder Resultat eindeutig zugeordnet werden können. Standardabweichungen, déviation standard, (standard deviation) (SD) Mathematische Beschreibung der Streuung innerhalb einer Serie von Analysenresultaten. Grenzwerte, valeurs limites, (limits) Durch rechtliche oder technische Stellen festgelegte Werte. Auch das Labor kann interne Grenzwerte festlegen, jedoch unter Einhaltung eventuell bestehender, übergeordneter Grenzwerte. Bestimmungsgrenze, limite de quantification, (limit of quantitation) (LOQ oder LLOQ) Kleinste Konzentration (oder Menge) eines Analyten in einer Probe, die quantitativ bestimmt werden kann. Die Bestimmungsgrenze ist diejenige Konzentration, von der ab die Messung eine vorgegebene Anforderung an die Präzision erfüllt. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik). Diese Konzentration wird üblicherweise als LOQ (limit of quantitation) oder etwas genauer als LLOQ (lower limit of quantitation) bezeichnet. Nachweisgrenze, limite de détection, (limit of detection) (LOD) Kleinste Konzentration (oder Menge) eines Analyten in einer Probe, die qualitativ noch erfasst werden kann. Die Nachweisgrenze ist eine Bestimmungsgrenze für das Vorhandensein eines Bestandteils. (Quelle: Leitfaden Forensische Drogenanalytik). Die Wahrscheinlichkeit des qualitativen Nachweises einer Substanz oberhalb der Nachweisgrenze beträgt üblicherweise mindestens 50%. Wird die Wahrscheinlichkeit sehr hoch gesetzt (z.b. über 99%), so entspricht die Nachweisgrenze der sog. Erfassungsgrenze (limit of inclusion). Die Erfassungsgrenze wird seltener verwendet. Arbeitsbereich, intervalle de mesure, (working range) Derjenige Konzentrationsbereich, innerhalb welchem die Genauigkeit überprüft und als ausreichend befunden wurde. Resultate ausserhalb des Arbeitsbereiches müssen speziell gekennzeichnet werden. Allgemeine Suchanalysen, criblages généraux, (General Unknown Screenings) Wenn unklare Hinweise auf die Aufnahme toxischer Substanzen bestehen, werden üblicherweise ungezielte forensischtoxikologische Suchanalysen durchgeführt. Zertifiziertes Referenzmaterial, matériel de référence certifié, (certified reference material) (CFRM) Durch eine speziell zertifizierte Stelle hergestelltes Referenzmaterial. Die Zertifizierung solcher Stellen obliegt der metas (Metrologie und Akkreditierung Schweiz) oder den entsprechenden ausländischen Stellen. Zurzeit gibt es keine zertifizierte Hersteller forensisch-toxikologischer Referenzproben und somit auch keine zertifizierten Referenzproben. Es kann deshalb im Moment auch keinen Zwang geben, zertifiziertes Referenzmaterial zu verwenden. Es gibt zwar Referenzproben mit Analysenzertifikat, diese entsprechen aber nicht zertifizierten Referenzproben. Seite 18/18