Bakterielle Kontaminationen von Blutprodukten: Nachweismethoden und transfusionsmedizinische Bedeutung

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1 KOLT, Langen 16. April 28 Bakterielle Kontaminationen von Blutprodukten: Nachweismethoden und transfusionsmedizinische Bedeutung Dr. Jens Dreier

2 Gliederung Einleitung: Darstellung der Problematik Bakterielle Kontamination von Thrombozytenkonzentraten: Kontaminationsrisiko Sterilitätstestung: Kultur- und Schnellmethoden Entwicklung einer Nachweismethode und Screeningstrategie Methodenentwicklung: Real-time RT-PCR Nachweis von Bakterien-Sporen in TKs Studie zur Sterilitätstestung von TKs Propionibacterium acnes in der Sterilitätstestung Diskussion der Screening-Strategie: frühe vs. späte Pobenahme 2

3 Frequenz transfusionsassozierter Todesfälle (FDA, USA) Zwischenfall Hämolyse Bakterielle Kontamination TRALI Nicht-bakterielle Infektion Transfusion-ass. GvHD Fälle 161 (5%) 46 (1%) 29 (9%) 23 (7%) 18 (6%) J-H Lee, MD, CBER, FDA, 9/24/99 3

4 Bakterielle Kontamination von Blutprodukten Blutprodukte zelluläres Blutprodukt Erythrozytenkonzentrat (EK) Thrombozytenkonzentrat (TK) azelluläres Blutprodukt therapeutisches Frischplasma (FFP) Produkt: Haltbarkeit: Lagerung: EK 42 Tage 4 C TK 5 Tage 22 C FFP 36 Monate - 3 C 4

5 Bakterielle Kontamination von Blutprodukten Blutprodukte zelluläres Blutprodukt Erythrozytenkonzentrat (EK) Thrombozytenkonzentrat (TK) azelluläres Blutprodukt therapeutisches Frischplasma (FFP) 3 Bakterielle Kontamination pro %.24 %.7 % EK TK FFP mod. Walther-Wenke et al., Vox Sang (26) 5

6 Infektionsrisiko: bakteriell vs. viral Risiko pro Einheit 1:1 2 HCV 1:1 3 Bakterielle Kontamination TKs 1:2. 1:1 4 1:1 5 HBV HIV Septische Todesfälle TKs 1:14. 1:1 6 1: Zeit 1:5.. 1:5.. mod. Hillyer et al., Hematology (23) 6

7 Isolierte Bakterien in der Sterilitätstestung 48 % Propionibacterium acnes 27 % koagulase negative Staphylococci (KONS), S. epidermidis (12 %) n = positiv getestet: 135 (.26 %) Schrezenmeier et al., Transfusion (27) 8 % Bacillus sp. 4 % Corynebacterium sp. 1 % Staphylococcus lugdunensis 1 % Staphylococcus aureus 1 % Serratia marcescens aus Hof, Dörries (25) 7

8 TK-Bakterienscreening: Nachweismethoden Kultivierungsmethode (z.b. BacT/Alert) 2 x 7,5 ml Probe Ergebnis: > 3 7 Tage Zu erfüllende Kriterien: Sensitivität (Starttiter,3 CFU/ml) Spezifität Erfassung relevanter Spezies Präzision Robustheit Routinetauglichkeit Niedrige Kosten Geringer Produktverbrauch Geschwindigkeit (Ergebnis vor Transfsuion) Zeit [d] Spende Probenahme Ergebnis maximale Haltbarkeit des TKs Schnellnachweismethode (z.b. NAT) 2,4 ml Probe Ergebnis: 28 Stunden 8

9 Sampling Error : Probenahmezeitpunkt Wachstum in Pool- und Apherese TKs Erstdetektion RT-PCR Modelorganismen: Klebsiella pneumoniae (schnell wachsend) Staphylococcus epidermidis (langsam wachsend) Probenahme 24 Stunden nach Spende/Herstellung Klebsiella pneumoniae Staphylococcus epidermidis Bakterienkonzentration [KBE/mL] C T bakterielles Wachstum C T 32.8 C T 2.63 C T 22.6 C T C T 2.41 Bakterienkonzentration [KBE/mL] RT-PCR Detektion C T C T C T 11.6 C T Probenahmezeit nach Inokulation [h] Probenahmezeit nach Inokulation [h] Störmer et al., Transfus. Med. (27) 9

10 Zielmolekül der RT-PCR 16S rdna tdna 23S rdna 5S rdna DNA 16S rrna (1542 N) trna (74-94 N) 23S rrna (294 N) RT-PCR Störmer et al., Clin. Chem. (27) 5S rrna (12 N) rrna trna Reverse transcriptase (RT)-PCR ein Zahl der Kopien der rrna pro Zelle: Sequenz von den meisten Bakterien bekannt (hoch konserviert) RNA ist ein Haushaltsgenprodukt: konstitutive bzw. hohe Expression in Wachstumsphasen Dreier et al., Transfus. Med. Rev. (27) Störmer et al., Clin. Chem. (27) 1

11 Sampling Error : Probevolumen Nukleinsäureextraktion Stab Einwegspitze Stab Einwegspitze Chemagic Magnetic Separation Module 12er Kopf Chemagen DNA/RNA bindet an Magnetpartikel Chemagen magnetische Separation 2,4 ml, 4,8 ml und 9,6 ml Probenvolumen geringer Produktverlust (TK) 12 Proben pro Lauf, Dauer ca. 1,5 Stunden simultane Isolation von DNA und RNA Störmer et al., Clin. Chem. (27) 11

12 Bakterien-Screening: real-time RT-PCR Norm. Fluoro. FAM, 23S rrna.5.4 Positiv-Kontrolle Qualitätskontrollen Positiv-Kontrolle Zyklus Norm. Fluoro. JOE, Interne Kontrolle β2-mg.3 Lauf- Kontrolle TKs, Negativ -Kontrolle Lauf-Kontrolle Negativ-Kontrolle Interne Kontrolle: Extraktions- und Amplifikationskontrolle.2 Sensitivität: CFU/mL Zyklus Präzision: Intra- und Interassay- Variabilität VK 1,35-1,65 % Dreier et al., Transfus. Med. Rev. (27) Störmer et al., Clin. Chem. (27) 12

13 Bakterielle Sporen: Proliferation in TKs und Detektion mittels real-time RT-PCR Bacterial load [CFU/mL] Bacterial load [CFU/mL] Bacillus subtilis ATCC 3531 growth curve C T value RT-PCR Time [h] Bacillus cereus ATCC Time [h] CT-Value of RT-PCR CT-Value of RT-PCR Bacterial load [CFU/mL] Bacterial load [CFU/mL] 1 8 Bacillus subtilis DSM Time [h] 1 8 Clostridium sporogenes ATCC 1944, ATCC Time [h] CT-Value of RT-PCR CT-Value of RT-PCR RT-PCR detection limit: 1 spores/ml Störmer et al., Vox Sang. (28) submitted 13

14 Sterilitätstestung: Strategie Prozedur Bakterien-Sterilitätstestung Zeit [h] Probenahme Probe TK Probenahme 24 Stunden nach der Herstellung 24 Probevolumen 2.4 ml Nukleinsäureextraktion Kit Instrument Technologie Dauer chemagic viral DNA/RNA kit Magnetic Separation Module I (Chemagen) Magnetic-bead Technologie 2 min (Lyse) 75 min (magnetische Separation) 26 Nukleinsäuren RNA und DNA real-time RT-PCR Zielmolekül Sensitivität 23S rrna KBE/mL real-time Intrument Rotor-Gene 3 (Corbett Research) Dauer (RT)-PCR 1 min (RT-PCR setup) + 13 min (run) Extraktionskontrolle ko-amplifikation von β2-mg mrna 28 Inhibitionskontrolle ko-amplifikation von β2-mg mrna Lauf-Kontrolle ko-amplifikation von sterilen und geringgradig inokulierten TKs Dreier et al, Tranfus. Med. Rev. (27) Störmer et al., Clin. Chem. (27) 14

15 Routine-TK-Screening Zeit [h] Blutspendedienst Zeitraum: 24 Monate TKs gesamt: 4355 TK-Spende reaktiv (total) % 24 Fraktionierung Probenahme, Lagerung Kultur initial reaktiv initial positiv bestätigt pos %.3 %.5% RT-PCR positiv 1.3 % 5 ml aerobe Kultur Mikrobiologie Sterile Probenverteilung nur anaerob reaktiv: 16 5 ml anaerobe Kultur 3-5 ml 5 ml Röhrchen Zeitraum: 3 7 Tage 6 % S. epidermidis Bebrütung 7 Tage, 37 C BacT/Alert PCR-Labor Extraktion, RT-PCR S. warneri 6 % initial reaktiv 28 % Propionibacterium acnes 61 % 15

16 Ergebnisse der TK-Screenings im Zeitraum von Nov. 25 bis Feb

17 Ergebnisse der TK-Screenings im Zeitraum von Nov. 25 bis Feb. 28 Transfusionsmed. Relevanz +/-?? - 17

18 Propionibacterium acnes: Transfusionsreaktion - 14 kultur-positive TKs mit P. acnes - Transfusion an 14 verschiedene Patienten : keine unerwünschten Transfusionsreaktionen mitgeteilt klinisch-chemische Analytik: kein Hinweis auf inflammatorisches Geschehen Blutkulturen post Transfusion o.b. 18

19 Detektionszeit und Transfusionszeitpunkt P. acnes-pos. TKs Transfusionszeitpunkt Detektionszeit BactAlert (+1-2-Tage für Diff.) Age of apheresis platelet concentrates (APCs, bars) at transfusion compared to the mean detection time of initial positive culture bottles (5.69 ± 1.38). Dreier et al., Vox Sang. (28, subm.) 19

20 Alter der ausgegebenen TKs im Herz- und Diabeteszentrum NRW 35 3 Anteil der TKs (%) durchschn. Zeitpunkt der kulturellen Detektion Alter bei Ausgabe (Tage) ca. 5% der Tks 6 2

21 Bedeutung von Propionibacterium acnes Detektion: anaerobe Kultur nach 3-7 Tagen nach Probenahme look-back Verfahren: keine Reaktionen beim Empfänger kein Wachstum sondern Persistenz Bakterientiter [KBE/mL] P. acnes Isolat 24 Detektion: BacT/Alert Wachstum 4.28 d 3.57 d 5.6 d 4.72 d Negativ nach 7 d Bakterientiter [KBE/mL] P. acnes Isolat d 5.29 d 5.11 d 6.29 d 5.98 d Probenahme [h] Probenahme [h] Störmer et al., Vox Sang. (28) 21

22 Screening-Strategie für TKs Bacterial titer [CFUs/mL] Risk of sampling error [%] < 1 diagnostic window 1 culture methods early sampling culture methods late sampling rapid methods rapid methods bacterial growth in PC detection limit 5 Storage time [d] 1 Blood donation Storage time [d] Dreier et al., Vox Sang. (28, subm.) 22

23 Screening-Strategie für TKs early testing Donation quarantine > 24h BacT/Alert culture Sample volume: 2x 7.5 ml Result: > 3-7 d Detection limit: >1 CFU/mL NAT Sample volume: 2.4 ml Result: 28 h Detection limit: >1-3 CFUs/mL Issue of PC: negative to date Issue of PC: after testing maximum durability FACS, NAT, PGD Sample volume: variable Result: prior to transfusion Detection limit: >1-3 CFUs/mL (NAT) >1 4 CFUs/mL (FACS) CFUs/mL (PGD) Issue of PC: after bedsite testing late testing PGD:Pan Genera Detection, Verax Biomedical Inc. Dreier et al., Vox Sang. (28, subm.) 23

24 Zusammenfassung Entwicklung einer Nachweismethode und Screeningstrategie Molekulargenetisches Nachweissystem auf Basis der 23S rrna Minimierung des Probenahmefehlers durch 24 Stunden Inkubation und Probevolumen (Extraktionsmethode) Integration in die Routinetestung am UniBlutspendedienst OWL, Bad Oeynhausen und DRK Blutspendedienst West, Hagen Bedeutung von Propionibacterium acnes in der Sterilitätstestung Screening-Strategie: späte Testung mit einer Schnellmethode (NAT, FACS) 24

25 Vielen Dank Dr. M. Störmer Prof. Dr. K. Kleesiek Herz- und Diabeteszentrum Nordrhein-Westfalen Ruhr-Universität Bochum Georgstraße Bad Oeynhausen Tel.: +49 () / Fax: +49 () / jdreier@hdz-nrw.de