PIGTYPE Trichinella Ab

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1 PIGTYPE Trichinella Ab ELISA-Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Trichinella spp. bei Schweinen Gebrauchsinformation Labor Diagnostik Leipzig in vitro-diagnostikum für Schweine Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach 17 c TierSG zugelassen. Zulassungs-Nr.: FLI-B 511 Verwendungszweck Der PIGTYPE Trichinella Ab ist ein indirekter Enzymimmunoassay (ELISA) im Mikrotiterplattenformat zum Nachweis von Antikörpern gegen Trichinella spp. in Serum, Plasma und Fleischsaftproben von Schweinen. Allgemeine Informationen Die Trichinellose ist eine Zoonose, die durch Fadenwürmer der Gattung Trichinella verursacht wird und beim Menschen mild bis tödlich verlaufen kann. Ursache dieser Erkrankung ist der Verzehr trichinenhaltigen Fleisches. Beim Schwein verläuft die Infektion meist subklinisch. Mit Hilfe der Trichinenuntersuchung wird verhindert, dass Fleisch infizierter Tiere in die Lebensmittelkette gelangt. Gemäß der europäischen Verordnung (EG) Nr. 2075/2005 können Schweine haltende Betriebe unter bestimmten Voraussetzungen als trichinenfrei anerkannt werden. Ein Überwachungsprogramm ist dafür die Voraussetzung. Damit ist für Mastschweine in integrierten Produktionssystemen die alternative Überwachung über ein serologisches Monitoring auf Trichinella-Antikörper ohne kostenintensive Trichinenuntersuchung möglich. Der PIGTYPE Trichinella Ab kann im Rahmen des Monitorings eingesetzt werden. Beschreibung des Testprinzips Der PIGTYPE Trichinella Ab funktioniert nach dem Prinzip eines indirekten ELISA. Die Mikrotiterplatte ist mit inaktiviertem Trichinella-Antigen (E/S-Antigen) beschichtet. Trichinella-spezifische Antikörper aus der Probe binden während der Probeninkubation an das immobilisierte Antigen, nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Die anschließende Detektion der gebundenen Antikörper erfolgt durch einen Peroxidasekonjugierten anti-schwein-igg-antikörper. Ungebundenes HRP-Konjugat wird herausgewaschen und die Farbreaktion durch Zugabe des Substrates gestartet. Nach Abstoppen der Reaktion wird die optische Dichte im Photometer gemessen; sie ist proportional zu der Konzentration der anti-trichinella-antikörper in der Probe. Bestellinformation PIGTYPE Trichinella Ab 1 Platte (Streifen) Artikelnummer /1 5 Platten (Streifen) Artikelnummer /5 20 Platten (solid) Artikelnummer /20

2 Reagenzien Testplatte, 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 Vertiefungen bzw. Testplatte, Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit nicht-infektiösem Trichinella-E/S-Antigen 1er Kit 5er Kit 20er Kit Verdünnungspuffer, Pufferlösung mit Tween und Konservierungsmittel, gebrauchsfertig 60 ml 2x 125 ml 1,0 l 3. Negativkontrolle, Trichinella-negatives Serum vom Schwein in Puffer mit Proteinstabilisatoren, gebrauchsfertig 1,5 ml 3,5 ml 2x 3,0 ml 4. Positivkontrolle, Trichinella-positives Serum vom Schwein in Puffer mit Proteinstabilisatoren, gebrauchsfertig 1,5 ml 3,5 ml 2x 3,0 ml 5. Waschpuffer (10 ), Pufferlösung mit Tween und Konservierungsmittel 125 ml 2x 125 ml 1,0 l 6. anti-igg-hrp Konjugat, anti-schwein-igg-meerrettichperoxidasekonjugat in Puffer mit Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, gebrauchsfertig 12 ml 60 ml 240 ml 7. TMB (Tetramethylbenzidin) Substratlösung, gebrauchsfertig 12 ml 60 ml 240 ml 8. Stopplösung, 0,5 M Schwefelsäure, gebrauchsfertig (Vorsicht!) 12 ml 60 ml 240 ml Benötigte Geräte und Materialien, die nicht mitgeliefert werden Bechergläser, Messzylinder, Präzisionspipetten, Mehrkanalpipetten, Einwegpipettenspitzen, Pipettierwannen, Deckel oder Abklebefolie für Testplatten, Gerät zum Einfüllen und Absaugen von Waschlösung, Mikrotiterplatten-Photometer, Röhrchen oder geeignete Mikrotiterplatten für die Verdünnung der Proben, destilliertes Wasser, ggf. Fleischsaftbehälter (SALMOSTORE) für die Fleischsaftgewinnung. Lagerung, Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise Lagern Sie die Reagenzien bei 2-8 C und bringen Sie diese erst unmittelbar vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C). Eventuell gebildete Salzkristalle im Waschpuffer (10x) müssen durch Schwenken und leichtes Erwärmen wieder aufgelöst werden. Zur Vermeidung der Salzkristallbildung können Waschpuffer (10x, Flasche 5) und Stopplösung (Flasche 8) bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Waschpuffer- Gebrauchslösung sollte nicht länger als 24 Stunden bei Raumtemperatur bzw. 1 Woche bei 2-8 C aufbewahrt werden. Nicht benutzte Teststreifen sollen bis zur Verwendung im wieder verschlossenen Plattenbeutel mit Trockenmittel bei 2-8 C gelagert werden. Nach erstmaliger Öffnung des Beutels sind die Teststreifen mindestens 6 Wochen haltbar. Den Test sollten nur für Labortätigkeit qualifizierte Personen ausführen. Lagern Sie die TMB Substratlösung im Dunkeln und setzen Sie diese während der Testdurchführung nicht starkem Lichteinfluss oder direktem Sonnenlicht aus. Die Bestandteile des Testkits dürfen nicht verunreinigt und nicht mit Bestandteilen aus anderen Chargen vermischt werden. Benutzen Sie die Bestandteile des Testkits nicht nach Ablauf des Verfallsdatums. Das für die Verdünnung des Waschpufferkonzentrates verwendete Wasser, insbesondere Wasser aus Ionenaustauscheranlagen, kann bei ungenügender Reinheit die Reaktion beeinträchtigen. Wasser mit der Qualität von bidestilliertem Wasser oder Reinstwasser (Milli-Q) ist geeignet. Die für ELISA-Prozeduren übliche Umsichtigkeit wie die Verwendung sorgfältig gereinigter Glasmaterialien, sorgfältiges Pipettieren und Waschen während der Testdurchführung und die Einhaltung konstanter Inkubationszeiten sind unabdingbare Voraussetzungen, um die Genauigkeit der Messergebnisse zu gewährleisten. Die Stopplösung enthält 2,5 % Schwefelsäure, Vorsicht! Alle Reste von Proben und mit Proben in Berührung gekommene Gegenstände sind als potenziell infektiöse Materialien zu dekontaminieren bzw. zu entsorgen. Nur für den tierärztlichen Gebrauch!

3 - 3 - Reagenzienvorbereitung Waschpuffer: Waschpuffer (10 ), Flasche 5, 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnen, z. B. für eine Testplatte 50 ml Waschpuffer (10 ) in 450 ml destilliertem Wasser verdünnen und mischen. Fleischsaft: Ca. 10 g fettfreies und von Blutverunreinigungen freies Muskelfleisch, z. B. vom Zwerchfellpfeiler, im Fleischsaftbehälter (z. B. SALMOSTORE) einfrieren und wieder auftauen. In Überwachungsprogrammen können die Fleischprobe-Entnahmestellen am Tierkörper genau festgelegt sein. Die eingefrorenen Fleischproben können mehrere Monate bei -20 C bis zur Untersuchung gelagert werden. Der aus dem aufgetauten Fleisch austretende Fleischsaft sammelt sich im Röhrchen des Fleischsaftbehälters. Die Fleischsaftproben sollten möglichst kühl gelagert und innerhalb von 24 h analysiert oder wieder eingefroren werden. Die Fleischsaftproben sind 1:10 mit Verdünnungspuffer verdünnt im Test einzusetzen, z. B. 25 µl in 225 µl Verdünnungspuffer verdünnen und mischen. Nach jeder Probe die Pipettenspitze wechseln. Die Kontrollen sind gebrauchsfertig und müssen nicht verdünnt werden. Alternativ können die Fleischsaftproben direkt in der Testplatte verdünnt werden (s. u. Testdurchführung, 1. Befüllen der Testplatte). Serum, Plasma: Serum- oder Plasmaproben sind 1:100 mit Verdünnungspuffer verdünnt im Test einzusetzen, z. B. 5 µl Serum oder Plasma in 495 µl Verdünnungspuffer verdünnen und mischen. Nach jeder Probe die Pipettenspitze wechseln. Die Kontrollen sind gebrauchsfertig und müssen nicht verdünnt werden. Alternativ können die Proben ausgehend von einer Vorverdünnung (1:10 in Verdünnungspuffer) direkt in der Testplatte verdünnt werden (s. u. Testdurchführung, 1. Befüllen der Testplatte). Serum- oder Plasmaproben können auch als Pools von 10 getestet werden. Dazu die Proben zu gleichen Teilen vereinigen und mischen (z. B. jeweils 10 µl von 10 Einzelproben vereinigen). Poolproben sind 1:20 mit Verdünnungspuffer verdünnt im Test einzusetzen, z. B. 10 µl Poolprobe in 190 µl Verdünnungspuffer verdünnen und mischen. Testdurchführung Alle Reagenzien vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C) bringen und durch Schwenken mischen. 1. Befüllen der Testplatte: Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen entsprechend der Vorlage, Negativkontrolle (NK) = A1/B1; Positivkontrolle (PK) = C1/D1; übrige Positionen für Proben. Jeweils 100 µl der gebrauchsfertigen Negativ- und Positivkontrolle (in Doppelbestimmung) sowie der 1:10 verdünnten Fleischsaftproben und/oder der 1:100 verdünnten Serum- oder Plasmaproben in die Kavitäten der Testplatte pipettieren. Alternativ können in alle Probenkavitäten 90 µl Verdünnungspuffer vorgelegt werden und jeweils 10 µl der unverdünnten Fleischsaftproben und/oder der 1:10 vorverdünnten Serum- oder Plasmaproben zupipettiert werden; anschließend gut mischen. Die Testplatte abdecken. Vorschlag für die Plattenbelegung für den PIGTYPE Trichinella Ab ELISA: A NK P5 P13 P21 P29 P37 P45 P53 P61 P69 P77 P85 B NK P6 P14 P22 P30 P38 P46 P54 P62 P70 P78 P86 C PK P7 P15 P23 P31 P39 P47 P55 P63 P71 P79 P87 D PK P8 P16 P24 P32 P40 P48 P56 P64 P72 P80 P88 E P1 P9 P17 P25 P33 P41 P49 P57 P65 P73 P81 P89 F P2 P10 P18 P26 P34 P42 P50 P58 P66 P74 P82 P90 G P3 P11 P19 P27 P35 P43 P51 P59 P67 P75 P83 P91 H P4 P12 P20 P28 P36 P44 P52 P60 P68 P76 P84 P92

4 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2-8 C inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren. 3. 3x waschen mit je 300 µl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren. 4. In jede Vertiefung 100 µl gebrauchsfertiges anti-igg-hrp Konjugat geben min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren. 6. 3x waschen mit je 300 µl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren. 7. In jede Vertiefung 100 µl TMB Substratlösung geben min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Beginn der Zeitmessung nach dem Füllen der ersten Vertiefung. 9. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung pro Vertiefung. Die Stopplösung ist in der gleichen Reihenfolge wie die Substratlösung zuzugeben. 10. Messung der optischen Dichte (OD) im Photometer bei 450 nm und optional einer Referenzwellenlänge von nm sofort oder innerhalb von 20 min nach dem Abstoppen. Testvalidierung Für einen gültigen Test soll der Mittelwert (MW) der OD der Positivkontrolle einen Wert 0,7 ergeben. Der MW der OD der Negativkontrolle soll 0,2 sein. Bei ungültigen Ergebnissen muss der Test wiederholt werden. Es wird dazu empfohlen, die Gebrauchsinformation gründlich durchzulesen. Auswertung 1. Aus den OD-Werten der Negativkontrolle sowie den OD-Werten der Positivkontrolle sind jeweils die Mittelwerte zu berechnen. 2. Vom OD-Wert der Probe und dem OD-Mittelwert der Positivkontrolle ist jeweils der OD-Mittelwert der Negativkontrolle abzuziehen. 3. Es ist das Verhältnis der OD der Probe zum OD-Mittelwert der Positivkontrolle nach der folgenden Formel zu berechnen: S/P-Quotient = OD MW OD Probe PK MW OD MW OD NK NK Beurteilung für 1h- Probeninkubation Proben mit einem S/P-Quotienten < 0,3 werden als negativ befundet. Spezifische Antikörper gegen Trichinellen wurden nicht nachgewiesen. Proben mit einem S/P-Quotienten 0,3 werden als positiv befundet. Es wurden spezifische Antikörper gegen Trichinellen nachgewiesen. Beurteilung für Übernacht-Probeninkubation Proben mit einem S/P-Quotienten < 0,45 werden als negativ befundet. Spezifische Antikörper gegen Trichinellen wurden nicht nachgewiesen. Proben mit einem S/P-Quotienten 0,45 werden als positiv befundet. Es wurden spezifische Antikörper gegen Trichinellen nachgewiesen. V

5 PIGTYPE Trichinella Ab ELISA Test Kit for the Detection of Antibodies to Trichinella spp. in Pigs Instructions for Use Labor Diagnostik Leipzig In vitro Diagnostic Kit for pigs registered in accordance with 17 c of the German Law on Animal Diseases Registration No.: FLI-B 511 Applications The PIGTYPE Trichinella Ab is an indirect enzyme immunoassay (ELISA) in microtitre plate format for the detection of antibodies to Trichinella spp. in serum, plasma and meat juice samples from pigs. General Information Trichinellosis is a zoonosis which is caused by the nematode Trichinella. In humans the infection can cause mild to lethal illness. Humans can be infected by eating meat containing Trichinella-larvae. Most infected pigs do not show clinical signs. To prevent human infections, all pigs slaughtered for human consumption are tested by artificial digestion. The European Commission Regulation (EC) No. 2075/2005 allows holdings to be certified as Trichinella-free under certain conditions. One such condition is a monitoring program. Alternatively to the cost-intensive digestion method a serological monitoring for Trichinella-antibodies is possible for the surveillance of pork from integrated production systems. PIGTYPE Trichinella Ab can be used for monitoring Trichinella infections as part of such programs. Description of the Test Principle The microtitre plate is coated with inactivated Trichinella antigen (E/S-antigen). During the sample incubation Trichinella-specific antibodies bind to the immobilised antigen; unbound material is removed by rinsing. The anti-igg-hrp conjugate detects antibodies bound to the antigen. Unbound conjugate is rinsed out. The colour reaction is started by adding the substrate solution and stopped after 10 minutes. The optical density (OD) is measured in a spectrophotometer; the OD values correlate with the concentration of anti- Trichinella antibodies in the sample. Ordering Information PIGTYPE Trichinella Ab 1 plate kit (strips) Cat. No /1 5 plate kit (strips) Cat. No /5 20 plate kit (solid) Cat. No /20

6 Reagents Test Plate, contains 12 microtitre strips with 8 wells each or Test Plate, microtitre plate with 96 wells, coated with non-infectiuos Trichinella E/S-antigen 1 plate kit 5 plate kit 20 plate kit Dilution Buffer, buffer with Tween and preservative, ready-to-use 60 ml 2x 125 ml 1.0 l 3. Negative Control, Trichinella-negative pig serum in buffer with protein stabilizers and preservative, ready-to-use 1.5 ml 3.5 ml 2x 3 ml 4. Positive Control, Trichinella-negative pig serum in buffer with protein stabilizers and preservative, ready-to-use 1.5 ml 3.5 ml 2x 3 ml 5. Wash Buffer (10 ), buffer solution with Tween and preservative 125 ml 2x 125 ml 1.0 l 6. anti-igg-hrp Conjugate, anti-pig IgG-horseradish peroxidase conjugate in buffer with protein stabilisers and preservatives, ready-to-use 12 ml 60 ml 240 ml 7. TMB (Tetramethylbenzidine) Substrate Solution, ready-to-use 12 ml 60 ml 240 ml 8. Stop Solution, 0.5 M sulfuric acid, ready-to-use, caution! 12 ml 60 ml 240 ml Additional Material and Equipment Required Beakers, measuring cylinders, analytical pipettes, multichannel pipettes, disposable pipette tips, pipetting troughs, lid, aluminium foil or adhesive for covering the Test Plate, device for delivery and aspiration of wash solution, microtitre plate spectrophotometer, tubes or plates for diluting the samples, distilled water, meat juice container (SALMOSTORE) for collecting meat juice. Storage, Precautions and Warnings Store the reagents at 2-8 C and only bring them to room temperature (18-25 C) immediately before use. Wash Solution (10x, bottle 5) and Stop Solution (bottle 8) may be stored at room temperature. Diluted Wash Solution should be stored for a maximum of 24 hours at room temperature or 1 week at 2-8 C. Store the remaining test strips in the re-sealed foil pouch with desiccant at 2-8 C until next use. The test strips can be stored at least for 6 weeks after opening the plate pouch. The test should be performed by persons qualified for laboratory work. Store the TMB Substrate Solution in the dark and do not expose it to intense light or to sunlight during the performance of the test. The components of the test kit should not be contaminated or mixed with components from other batches. Do not use the components of the test kit past expiration date. Water from ion-exchange systems used for diluting the Wash Solution (10x) may interfere with the assay if not pure enough. Water of the quality of double distilled water or highly purified water (Milli-Q) is suitable. To guarantee the precision of the results, it is absolutely essential to follow the usual precautions for ELISA procedures, including the use of clean glass devices, careful pipetting and rinsing during the test, and strict adherence to the indicated incubation times. Stop solution contains 2.5 % sulfuric acid, caution! All sample residues and objects which have come into contact with samples must be decontaminated or disposed of as potentially infectious material.

7 - 7 - Preparation of the Reagents Wash Solution: Wash Solution (10x), bottle 5, dilute 1:10 with distilled water, e.g., for one Test Plate dilute 50 ml Wash Solution (10x) in 450 ml distilled water and mix. Meat juice: Freeze approx. 10 g blood- and fat-free muscle meat, e.g. from the muscular pillars of lumbar diaphragm, in a meat juice sampling device (e.g. SALMOSTORE) and then thaw. In monitoring programmes, the meat sampling sites on the carcass can be laid down exactly. Frozen meat samples can be stored for several months at -20 C before they are assayed. The meat juice released from the thawed pork samples in the tube of the meat juice device. Thawed meat juice samples should be stored cool and analysed within 24 hours. Dilute the meat juice samples 1:10 with Dilution Buffer before use, e.g. 25 µl sample is diluted in 225 µl Dilution Buffer and mix. Make sure to change pipette tips for each sample. Controls are ready-to-use, do not dilute them. Alternatively, meat juice samples can be diluted directly in the Test Plate (see Test Procedure, 1. Filling the Test Plate). Serum, plasma: Dilute the serum or plasma samples 1:100 with Dilution Buffer, e.g. 5 µl sample is diluted in 495 µl Dilution Buffer and mix. Make sure to change pipette tips for each sample. Controls are ready-to-use, do not dilute them. Alternatively, serum or plasma samples can be diluted from a pre-dilution (1:10 in Dilution Buffer) directly in the Test Plate (see Test Procedure, 1. Filling the Test Plate). Serum or plasma samples can also be tested as pools of 10 (e.g. pool 10 µl of each of 10 samples). Dilute the pool samples 1:20 with Dilution Buffer, e.g. 10 µl sample is diluted in 190 µl Dilution Buffer and mix. Test Procedure Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use and mix well. 1. Filling the Test Plate: Record the positions of the controls and samples in a test protocol, e.g. Negative Control (NC) = A1/B1; Positive Control (PC) = C1/D1; other positions of the samples. Pipette 100 µl of each of the ready-to-use Negative and Positive Control (in duplicates) and the 1:10 diluted meat juice samples and/or 1:100 diluted serum or plasma samples into the Test Plate wells. Alternatively, pipette 90 µl of Dilution Buffer in each sample well and add 10 µl of the undiluted meat juice sample and/or of the 1:10 pre-diluted serum or plasma sample. Mix well. Cover the Test Plate. Recommended template for PIGTYPE Trichinella Ab ELISA: A NK P5 P13 P21 P29 P37 P45 P53 P61 P69 P77 P85 B NK P6 P14 P22 P30 P38 P46 P54 P62 P70 P78 P86 C PK P7 P15 P23 P31 P39 P47 P55 P63 P71 P79 P87 D PK P8 P16 P24 P32 P40 P48 P56 P64 P72 P80 P88 E P1 P9 P17 P25 P33 P41 P49 P57 P65 P73 P81 P89 F P2 P10 P18 P26 P34 P42 P50 P58 P66 P74 P82 P90 G P3 P11 P19 P27 P35 P43 P51 P59 P67 P75 P83 P91 H P4 P12 P20 P28 P36 P44 P52 P60 P68 P76 P84 P92

8 Incubate for 60 min at room temperature or overnight at 2-8 C and then empty the wells by aspiration or tapping. 3. Rinse each well 3x with 300 µl of prepared Wash Solution. Remove the buffer after each rinse. 4. Add 100 µl ready-to-use anti-igg-hrp Conjugate to each well. 5. Incubate for 30 min at room temperature and then empty the wells by aspiration or tapping. 6. Rinse each well 3x with 300 µl of prepared Wash Solution. Remove the buffer after each rinse. 7. Add 100 µl TMB Substrate Solution to each well. 8. Incubate for 10 min at room temperature in the dark. Begin timing after the first well is filled. 9. Stop the reaction by adding 100 µl Stop Solution per well. Add the Stop Solution in the same order that the Substrate Solution was added. 10. Measure the optical density (OD) in the spectrophotometer at 450 nm immediately or within 20 min after stopping the reaction. Measuring at a reference wavelength ( nm) is optional. Test Validation For the assay to be valid the mean value (MV) of the measured OD values for the Positive Control must be 0.7; the mean value (MV) of the measured OD values for the Negative Control must be 0.2. In case of invalid assays the test should be repeated after a thorough review of the instructions for use. Calculation 1. Calculate the mean values (MV) of the measured OD for the Negative Control (NC) and the Positive Control (PC). 2. Subtract the mean OD of NC from the OD of the sample and from the mean OD of PC. 3. The ratio sample (S) to mean PC (P) is calculated according to the following equation: S /P ratio OD sample MV OD PC MV OD MV OD NC NC Evaluation 1h Sample Incubation Serum samples with the S/P ratio < 0.3 are negative. Specific antibodies to Trichinella could not be detected. Serum samples with the S/P ratio 0.3 are positive. Specific antibodies to Trichinella were detected. Evaluation Overnight Sample Incubation Serum samples with the S/P ratio < 0.45 are negative. Specific antibodies to Trichinella could not be detected. Serum samples with the S/P ratio 0.45 are positive. Specific antibodies to Trichinella were detected. V

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