BRAF klinische Aspekte und Mutationstestung. R. Stockinger

Transkript

1 BRAF klinische Aspekte und Mutationstestung R. Stockinger

2 BRAF Serin/Threonin Proteinkinase

3 RTK Cell membrane RAS BRAF MEK Nuclear membrane ERK Cellular Proliferation

4 Tumor Melanom Schilddrüse Ovar Colon BRAF-Mutation 50% 50% 12% <10% >75 BRAF Mutationen, ~90% p.v600e

5 Coloncarcinom BRAF Mutationen in 5-10% Schlechtere Prognose Überwiegend BRAF V600E häufiger in sporadischen CRC mit MSI+ BRAF Mutation schließt HNPCC aus Routinemäßige Testung wird dzt. nicht empfohlen (NCCN Guidelines)

6 BRAF Mutationen in Haarzell-Leukämie Tiacci et al., BRAF mutations in hairy-cell leukemia. N Engl J Med Jun 16;364(24): Epub 2011 Jun 11, Simple genetic diagnosis of hairy cell leukemia by sensitive detection of the BRAF-V600E mutation. Blood Oct 25. [Epub ahead of print]

7 Melanom In Europa >62000 Erkrankungen und ca Todesfälle pro Jahr Inzidenz in den letzten 20a fast verdreifacht (1/50) In frühen Stadien chirurgisch heilbar Im metastasiertem Stadium therapierefraktär Medianes Überleben im Stadium IV 6-9 Monate

8 Therapie - Melanom CVD CVD +IL-2, INF-α2b Ipilimumab DTIC IL-2 Vemurafenib Ansprechrate für konventionelle Therapie 5-15% IFN-α2b 10-15% Reduktion von Rezidiven Kein Benefit in Bezug auf OS Ipilimumab Ansprechrate 10-15%, Langzeitremissionen GSK CVD = Cisplatin, Vinblastin, DTIC(Darcarbazin)

9 BRAF Mutationen in Melanomen Mutationen sind erworben (sporadisch) Frühes Ereignis, Nachweis in Nävi Häufig bei Patienten im Alter von 30-50a auf intermittierend sonnenexponierter Haut (Stamm) Höheres Risiko bei indoor workers Seltener bei älteren Menschen auf chronisch sonnenexponierter Haut (Gesicht) Selten in Schleimhaut-, Aderhaut- und akralen Melanomen

10 RTK Cell membrane RAS BRAF MEK Nuclear membrane ERK Cellular Proliferation

11 RTK Cell membrane RAS BRAF V600E Oncogenic BRAF mutation MEK Nuclear membrane ERK Cellular Proliferation

12 RTK Cell membrane RAS BRAF V600E Oncogenic BRAF mutation MEK Nuclear membrane ERK Cellular Proliferation

13 RTK Cell membrane RAS BRAF V600E Oncogenic BRAF mutation Specific BRAF inhibitors MEK Nuclear membrane ERK Apoptosis

14 RTK Cell membrane RAS BRAF V600E Oncogenic BRAF mutation Vemurafenib MEK Nuclear membrane ERK Apoptosis

15

16 Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation BRIM3-Study, NEJM, June 2011

17 Long GV, Menzies AM, Nagrial AM, Haydu LE, Hamilton AL, Mann GJ, Hughes TM, Thompson JF, Scolyer RA, Kefford RF. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J Clin Oncol Apr 1;29(10):

18 PECA der Haut in 24% der Patienten unter Vemurafenib

19 Herausforderungen Trotz guter Ansprechrate (48%) verbleibt ein signifikanter Anteil mit primär therapieresistenten Tumoren Nahezu alle Patienten erleiden einen Progress trotz fortbestehender Therapie Wenig Therapieoptionen für Patienten mit BRAF WT Melanomen

20 RTK Cell membrane RAS wt BRAF V600E MEK Nuclear membrane ERK Apoptosis

21 RTK Cell membrane PI3K BRAF RAS mt BRAF V600E Resistenzmechanismen -RAS Mutationen -Überexpression anderer Kinasen (CRAF und COT) -MEK Mutationen -Aktivierung von RTK (PDGFR-B od. IGF-1R) craf MEK mt Nuclear membrane ERK Cellular Proliferation Luke JJ, Hodi FS. Vemurafenib and BRAF Inhibition: A New Class of Treatment for Metastatic Melanoma. Clin Cancer Res Nov 14. [Epub ahead of print]

22 Mutationen von BRAF, KIT, NRAS, GNA11 oder GNAQ finden sich in ca. 70 Prozent der Melanome Auf Haut mit chronischem Sonnenschaden Auf Haut ohne chronischen Sonnenschaden Schleimhautmelanome Akrolentiginöses Melanom Uveamelanom 50% BRAF 20% NRAS 10% BRAF 10% NRAS 2% KIT 5% BRAF 20% KIT 15% NRAS 15% BRAF 15% NRAS 15% KIT <1% BRAF 50% GNAQ 30% GNA11 adaptiert n. H. Moch, 18. PCR Symposium, Basel, 11/2011

23 Zusammenfassung klinische Aspekte BRAF V600E ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung von Melanomen BRAF V600E ist ein validiertes Target in Melanomen BRAF-Inhibitoren sind wirksam Induktion von PECA als Folge von präexistenten RAS Mutationen

24 BRAF-Mutationstestung Serin/Threonin Proteinkinase

25 Alternative BRAF V600 Mutationen

26 p.v600e (c.1799t>a) Mutation ACA GTG AAA ACA GAG AAA Valin Glutaminsäure T V K T E K Ca. 90% der Mutationen

27 BRAF Mutationsanalyse Sanger-Sequenzierung Pyrosequenzierung Real-Time-PCR Endpunkt PCR Strip-Assays Chip-Assays DHPLC, HRM, u.a.

28 BRAF Mutationsanalyse Sanger-Sequenzierung Pyrosequenzierung Real-Time-PCR Endpunkt PCR Strip-Assays Chip-Assays DHPLC, HRM, u.a.

29 BRAF Mutationsanalyse Sanger-Sequenzierung: Goldstandard Problem geringe Sensitivität (>20% mutierte DNA) Pyrosequenzierung (BRAF Pyro Kit, Qiagen): höhere Sensitivität, Detektion alternativer BRAF-Mutationen Real-Time-PCR (cobas 4800 BRAF V600 Test (Roche), Entrogen BRAF (V600E/K/D) Kit (Bühlmann), Seegene Anyplex, ADx BRAF V600E Mutation Detection Kit: Sehr sensitiv, schnell, seltenere Mutationen werden nicht/ unzuverlässig detektiert Endpunkt PCR (Seeplex BRAF V600E ACE Detection, Seegene)

30 Macrodissection DNA Extraktion 10ng DNA BRAF Q24 Kit (Qiagen) Pyroseqenzierung

31 Wildtype V600E-Mutation Reverse Sequencing

32 Hohe Sensitivität Geringe DNA Menge Detektion von non V600E Mutationen Kosteneffizient

33 Cantonal Hospital Locarno (CH) Academic Teaching Hospital Feldkirch (A) Institute for Cancer Research Turin (I) University Hospital of Novara (I) University Hospital of Varese (I) Edo Tempia Foundation Biella (I) Civil Hospital of Legnano Milano (I)

34 Cantonal Hospital Locarno (CH) Academic Teaching Hospital Feldkirch (A) Institute for Cancer Research Turin (I) University Hospital of Novara (I) University Hospital of Varese (I) Edo Tempia Foundation Biella (I) Civil Hospital of Legnano Milano (I) 1 2 wt wt wt wt wt wt wt 3 4 wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt 8 9 wt wt wt wt wt wt wt 10 wt wt wt wt wt wt wt

35 Cantonal Hospital Locarno (CH) Academic Teaching Hospital Feldkirch (A) Institute for Cancer Research Turin (I) University Hospital of Novara (I) University Hospital of Varese (I) Edo Tempia Foundation Biella (I) Civil Hospital of Legnano Milano (I) 1 V600E V600E V600E V600E V600E V600E V600E 2 wt wt wt wt wt wt wt 3 V600E V600E V600E V600E V600E V600E V600E 4 wt wt wt wt wt wt wt 5 V600E V600E V600E V600E V600E V600E V600E 6 V600E V600E V600E V600E V600E V600E V600E 7 wt wt wt wt wt wt wt 8 V600E V600E V600E V600E V600E V600E V600E 9 wt wt wt wt wt wt wt 10 wt wt wt wt wt wt wt

36 Primum Metastase (1) Metastase (2) 1 V600E 2 wt Primum vs 3 V600E 4 wt Metastase 5 wt? 6 wt 7 V600E 8 wt 9 wt 10 wt

37 Primum Metastase (1) Metastase (2) 1 V600E V600E 2 wt wt Primum vs 3 V600E V600E 4 wt wt Metastase 5 wt wt? 6 wt wt 7 V600E V600E V600E 8 wt wt 9 wt wt 10 wt wt

38 , 47a

39 : Metastase

40 BRAF Ex 15 (V600 u. K601) Ref. Seq.: NCBI NM_ Chr. 7 g.[1859t>a (+) 1860G>A (+) 1861A>C] p.[val600glu (+) Lys601Gln ] unknown allel-position Prof. Wrba, Inst. f. Pathologie, Universität Wien

41 BRAF 1) Vienna:+

42 BRAF 1) Vienna:+ 2) Kassel: -

43 BRAF 1) Vienna:+ 2) Kassel: - 3) Feldkirch:+ 4) Locarno:+ 5) Graz:+

44 BRAF Sanger-Sequencing RT-PCR Pyro-Seqencing Sanger-Seqencing Sequencing

45 p.v600e (c.1799t>a) Mutation ACA GTG AAA ACA GAG AAA Valin Glutaminsäure T V K T E K Ca. 90% der Mutationen

46 Komplexe BRAF Mutation ACA GTG AAA ACA GAA CAA Valin Lysin Glutamin- Säure Glutamin T V K T E Q

47 Seegene Anyplex (RT-PCR) V600E-Mutation Yes Complex mutation (Codon 600,601) No Seegene ACE (PCR) COBAS System (RT-PCR) Amoy Diagnostics (RT-PCR) Yes Yes Yes No No Yes

48 Mutationen von BRAF, KIT, NRAS, GNA11 oder GNAQ finden sich in ca. 70 Prozent der Melanome Auf Haut mit chronischem Sonnenschaden Auf Haut ohne chronischen Sonnenschaden Schleimhautmelanome Akrolentiginöses Melanom Uveamelanom 50% BRAF 20% NRAS 10% BRAF 10% NRAS 2% KIT 5% BRAF 20% KIT 15% NRAS 15% BRAF 15% NRAS 15% KIT <1% BRAF 50% GNAQ 30% GNA11 adaptiert n. H. Moch, 18. PCR Symposium, Basel, 11/2011

49 Vidwans SJ, Flaherty KT, Fisher DE, Tenenbaum JM, Travers MD, Shrager J. A melanoma molecular disease model. PLoS One Mar 30;6(3):

50 Zusammenfassung Individualisierte Therapie erfordert individualisierte Diagnostik Identifikation von molekularen Tumor-Subtypen potentielle therapeutische Ziele Kombinationstherapien?

51 Vielen Dank.