Entwicklung und Validierung von multiplex real-time RT-PCR assays in der Virusdiagnostik

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1 Entwicklung und Validierung von multiplex real-time RT-PCR assays in der Virusdiagnostik Bernd Hoffmann, Klaus R. Depner, Horst Schirrmeier & Martin Beer Friedrich-Loeffler-Institut Greifswald-Insel Riems Vorteile der real-time PCR Sehr sensitiv, da meistens sehr kleine Fragmente amplifiziert werden. Zuwachs an Spezifität, wenn die Detektion über Sonden erfolgt. Schnell, da Amplifikation und Detektion gleichzeitig ablaufen. Deutlich verminderte Kreuzkontaminations-gefahr, da kein Öffnen der PCR-Reaktions-gefäße nach der Amplifikation notwendig. Quantifizierung von Nukleinsäuremengen möglich.

2 Multiplex real-time PCR Differenzierung von Amplifikaten auf Basis von unterschiedlich Fluoreszenz-markierten Sonden Einsatz von speziellen Quenchern (Dark Quencher, Black Hole Quencher) Gleichzeitige Messung von bis zu 4 differenten Fluoreszenzfarbstoffen FAM 1.Zielsequenz HEX interne Kontrolle ROX/Texas Red Normalisierung/3.Zielsequenz Cy5 2.Zielsequenz Emission FAM 517 nm HEX 556 nm ROX/ Texas Red 591/615 nm Cy5 670 nm Wellenlänge Aufgabe einer Interne Kontrolle (IC) Überprüfung der Funktion und Effektivität der DNA/RNA-Isolierung und/oder der PCR/RT-PCR für jede einzelne aufgearbeitete Probe oder Probenpool

3 Arten von internen RNA-Kontrollen (1) Nutzung von interner zellulärer RNA: housekeeping genes - Verifizierung der Zelllyse - nur bedingt anwendbar in zellfreien Proben - Quantität sehr variabel - relative Quantifizierung Zugabe von externer RNA 2.1. Natürlich vorkommende RNA (z.b. heterologe virale RNA, mrna) - Verifizierung der Virionlyse - Infektions- und Kontaminationsrisiko - Arbeitsintensiv und teuer Arten von internen Kontrollen (2) 2.2. In vitro transkribierte RNA - N: kein Nachweis der Zell- bzw Virionlyse Homologes IC-System: Zielgen- und IC-Amplifikation durch identische Primer, Differenzierung über spezifische Sonden - IC-RNA muss für jede Anwendung neu konstruiert werden - Sensitivität des duplex RT-PCR-assays wird durch Co- Amplifikation eines relativ großen IC-Fragments erreicht Heterologes IC-System: Komplett eigene Primer und Sonde - identische IC-RNA ist in unterschiedlichen assays einsetzbar - Sensitivität des duplex RT-PCR-assays wird durch Co- Amplifikation eines relativ großen IC-Fragments und des Einsatzes von limitierten IC-Primern erreicht

4 Herstellung einer heterologen, universell einsetzbaren, internen Kontrolle PCR 2. Klonierung 3. In vitro Transkription EGFP-Gen-part. 722 bp pgem-egfp2 722 bp interne Kontroll-DNA interne Kontroll-RNA P15-F P14-F P13-F P12-F P11-F P1-F EGFP-Gen-part HEX P2-R P10-R Amplifikation der in vitro IC-RNA Well Well Name fragment size (bp) Ct A4 EGFP_ ,38 B4 EGFP_ ,6 C4 EGFP_ ,57 D4 EGFP_ ,64 E4 EGFP_ ,71 F4 EGFP_ ,74 G4 EGFP_ ,38 H4 EGFP_ ,61 A5 EGFP_ ,79 B5 EGFP_ ,87 C5 EGFP_ ,48 D5 EGFP_ ,84 E5 NPC No Ct 1,0 kbp 0,5 kbp 0,1 kbp

5 Stabilität der internen Kontrolle (IC) Frier-/Tauzyklen(1x, 10x, 20x, 40x) Inkubation bei 37 C (3d, 7d, 12d) Well Name Ct IC-1x 25,08 IC-10x 25,05 IC-20x 25,59 IC-40x 25,65 IC ,1 IC ,81 IC ,49 Entwicklung von multiplex real-time RT-PCR assays für die Routinediagnostik Entwicklung und Etablierung von optimierten single assays Co-Amplifikation und Detektion des Zielgens (FAM) und der IC (HEX)-duplex assay Amplifikation von ca Kopien-IC/well (TC 27-30) Nutzung von limitierten Primermengen für die Amplifikation der IC Auswahl einer geeigneten IC-Amplifikatlänge für die Co- Amplifikation mit der Zielsequenz Ziel: Sensitivität single assay = Sensitivität multiplex assay

6 Warum multiplex real-time RT-PCR? Nachweis von Zielgenom bei gleichzeitiger Co-Amplifizierung der IC Kein signifikanter Sensitivitätsverlust des multiplex assays im Vergleich zum single assay Deutlich mehr Sicherheit bei der Funktions-kontrolle der Nukleinsäureextraktion, RT und PCR Mehr Informationen zur Probe ohne signifikante Erhöhung der Kosten/Bearbeitungszeit CSFV real-time RT-PCR -Kenndaten des single assay- Copies/well NTC Amplifikation eines 93 bp Fragments aus der 5`- NTR Analytische Sensitivität: <10 Kopien/Well Sensitivität im Vergleich zur VI: 0,1 TCID 50 /RT-PCR CSFV-spezifisch Nicht-infektiöse positive Kontrolle (Standards)

7 CSFV real-time RT-PCR -Sensitivitätsvergleich single/multiplex assay- CSF-System 1 (FAM) Keine Differenz zwischen single und multiplex assay. Internal control (HEX) Rot- ohne IC Co-Amplifikation Grau- mit IC Co-Amplifikation Real-time PCR assays am FLI Insel Riems Virus Primer- & Sondenableitung Targetsequenz Targetlänge (bp) Etablierte multiplex real-time PCR-Systeme CSFV Panpesti/BVDV FMDV ASFV AIV BHV-1 modif. nach Rasmussen et al. (2003) nach King et al. (2003) nach Spackman et al. (2002) Single real-time PCR-Systeme WNFV PRRSV OvHV-2 Nipah Virus modif. nach Egli et al. (2001) nach Hüssy et al. (2001) nach Guillaume et al. (2004) Real-time PCR-Systeme in Planung NDV, SVDV, Hendra Virus 5`NTR 5`NTR 3D-Gen VP72-Gen M-Gen gd-/ge-gen 5`NTR/NS2a ORF 7 Tegument protein gene NP-Gen 93 ca /84 84/64 105(US)/96(EU)

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