Untersuchungen zur Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern embryonaler Fibroblasten und Neuronen von Gallus domesticus

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1 Aus dem Institut für Anthropologie und Humangenetik der Universität München Vorstand: Prof. Dr. med. Thomas Cremer Untersuchungen zur Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern embryonaler Fibroblasten und Neuronen von Gallus domesticus Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München vorgelegt von Felix A. Habermann aus München 2000

2 Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München Betreuer: Berichterstatter: Mitberichterstatter: Prof. Dr. T. Cremer Prof. Dr. J. Murken Prof. Dr. H.-G. Klobeck Prof. Dr. H. Künzle Dekan: Prof. Dr. K. Peter Tag der mündlichen Prüfung:

3 II 1 Einleitung Die Gliederung des Zellkerns in Chromosomenterritorien Nach welchen Regeln ordnen sich die Chromosomenterritorien im Zellkern an? Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern abhängig von der Chromosomengröße? Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern abhängig von der Gendichte bzw. dem Replikationszeitpunkt in der S-Phase? Gibt es feste, zufällige oder statistisch bevorzugte Lagebeziehungen zwischen bestimmten Chromosomenterritorien? Gibt es in differenzierten Zellen zelltypabhängige bevorzugte oder festgelegte Lagebeziehungen zwischen Chromosomenterritorien? Ziele dieser Arbeit Genom und Karyotyp von Gallus domesticus Die Darstellung von Chromosomenterritorien im Zellkern Die Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben Isolierung spezifischer Chromosomen Amplifikation der aus isolierten Chromosomen gewonnenen DNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Material und Methoden Zellkultur Anzucht embryonaler Fibroblasten Kultivierung embryonaler Neuronen Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben mit Durchflußzytometrie und DOP-PCR Durchflußzytometrische Sortierung von Chromosomen Herstellung einer Chromosomen-Suspension Chromosomen-Sortierung Primäre DOP-PCR-Amplifikation sortierter Chromosomenfraktionen Sekundäre DOP-Amplifikation sortierter Chromosomenfraktionen Markierung von DNA-Proben für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung Probenmarkierung mit DOP-PCR Probenmarkierung mit Nicktranslation Herstellung von DNA-Sonden-Pools für Mehrfarben Fluoreszenz in situ Hybridisierung...22

4 III Präparation genomischer DNA von Gallus domesticus Präparation von Cot-1-DNA aus genomischer DNA Präparation gespreiteter Metaphasechromosomen Präparation von Zellkernen für 3D-FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Hybridisierung Detektion Mikroskopie und digitale Bildverarbeitung Epifluoreszenz-Mikroskopie Konfokale Laserscanning-Mikroskopie Allgemeine Bildverarbeitung D-Bildverarbeitung Quantitative Auswertung und Statistik Ergebnisse Herstellung chromosomenspezifischer Sonden von Gallus domesticus Die Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern DNA-Sonden-Pools Makro- und Mikrochromosomen in kultivierten embryonalen Fibroblasten Makro- und Mikrochromosomen während der Mitose Makro- und Mikrochromosomen in kultivierten embryonalen Neuronen Quantitative Auswertung Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen Z im Zellkern DNA-Sonden-Pools Die Chromosomen in embryonalen Fibroblasten Die Chromosomen Z in embryonalen Neuronen Farbabbildungen...42

5 IV 4 Diskussion Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben für Gallus domesticus Methodische Probleme der dreidimensionalen Fluoreszenz in situ Hybridisierung (3D-FISH) DNA-Sonden / Sonden-Pools/Nachweisverfahren Zellkernpräparation für 3D-FISH D-M-FISH Methodische Probleme einer 3D-Mikroskopie und quantitativen Bildanalyse Optimierung der Bildaufnahme Auflösungsgrenzen und Abbildungsfehler der konfokalen Mikroskopie Verbesserung der Auflösungsgrenzen durch digitale Bildverarbeitung: Entfaltung (Dekonvolution) Objekt-Segmentierung und 3D-Rekonstruktion Die Anordnung von Chromosomenterritorien im Zellkern Die Morphologie von Chromosomenterritorien im Zellkern embryonaler Fibroblasten und embryonaler Neuronen von Gallus domesticus Die relative Anordnung der Territorien von Makrochromosomen bei Gallus domesticus Unterschiedliche Verteilung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern und in der Prometaphaserosette Gründe für eine unterschiedliche Verteilung der Makro- und Mikrochromosomen Der Einfluß physikalischer Parameter auf die Verteilung von Chromosomenterritorien im Zellkern Der Einfluß der Gendichte und des Replikationsverhaltens auf die Verteilung von Chromosomenterritorien im Zellkern Zusammenfassung Literatur...83 Danksagung...93 Lebenslauf...94

6 Einleitung 1 1 Einleitung Höher entwickelte Organismen bestehen aus mehreren Billionen Zellen, die im wesentlichen alle dasselbe Genom enthalten, jedoch ganz unterschiedliche Aufgaben erfüllen müssen. Um eine gewebs- bzw. organspezifische Funktion zu erfüllen, sind in einem Zellkern ganz bestimmte Gene aktiv, während viele andere Gene stillgelegt sind. Die Regulation der Genexpression in einem Zellkern eines vielzelligen Organismus unterliegt komplizierten und in weiten Teilen noch nicht verstandenen Mechanismen. Die Expression der einzelnen Gene ist ein mehrstufiger Prozeß, der die Transkription, eine komplizierte Verarbeitung der primären Transkripte und den Transport der reifen Messenger-RNA ins Zytoplasma umfaßt. Das haploide Genom umfaßt etwa 3000 Milliarden Basenpaare, was einem DNA-Faden von 2 Metern Länge entspricht und enthält circa einhunderttausend Gene. In einem um den Faktor vergrößerten Modell eines Zellkerns als einer Kugel von 10 cm Durchmesser müßten 46 Fäden mit einem Durchmesser von einem Tausendstel Millimeter und einer Gesamtlänge von 40 km untergebracht werden. Die Basenpaarabfolge der DNA-Fäden muß vor jeder Zellteilung fehlerfrei reproduziert werden und bei der Zellteilung muß jeweils ein vollständiger Satz der einzelnen DNA-Fäden korrekt in die beide Tochterzellen übertragen werden. Damit das vollständige Genom in einem Zellkern untergebracht werden kann, faltet sich die lineare DNA mit Histonen und anderen Proteinen zu Chromatin, das seinerseits mit übergeordneten Proteinenstrukturen reagiert, die das Chromatin weiter kompaktieren. Im Vergleich zur Menge verfügbarer Daten zur DNA-Sequenz von Genen und regulatorischen Elementen ist unser Wissen über die höhere räumliche Organisation der DNA im Zellkern, die für die ungeheuer komplexen Vorgänge im Zellkern wie der regulierten gewebs- und entwicklungsspezifischen Expression von tausenden von Genen und die DNA-Replikation erforderlich ist, noch sehr gering. 1.1 Die Gliederung des Zellkerns in Chromosomenterritorien Bereits vor etwa einhundert Jahren formulierten Carl Rabl und Theodor Boveri die Vorstellung, daß jedes Chromosom ein umschriebenes Territorium in einem tierischen Zellkern einnimmt (Rabl 1885, Boveri 1909). Dieses Konzept wurde später unter dem Eindruck elektronenmikroskopischer Untersuchungen in den 50iger Jahren weitgehend aufgegeben. Elektronenmikroskopische Schnitte durch einen typischen Säugetierzellkern, mit einer Auflösung von wenigen Nanometern (ein Nanometer entspricht einem millionstel Millimeter), zeigen ein Gewirr von Chromatinfasern mit dichter gepacktem Heterochromatin in der Kernperipherie. Während nur der Nukleolus durch eine dichte fibrilläre Struktur leicht zu erkennen ist, gibt es keinerlei Belege für die Existenz abgegrenzter Chromosomenterritorien (Übersicht bei Wischnitzer et al. 1973). Dies führte zur über längere Zeit vorherrschenden Ansicht, daß sich die DNA-Fäden der einzelnen Chromosomen jeweils im gesamten Kernraum ausbreiten könnten (Übersichten bei Comings 1968, Vogel und Schroeder 1974, Okada und Comings 1979). Die Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie (siehe 1.5.3), der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (siehe 1.5.2) sowie die Herstellung chromosomenspezifischer Proben (siehe 1.5.1) machten es schließlich möglich, selektiv die DNA einzelner Chromosomen im Zellkern sichtbar zu machen.

7 Einleitung 2 Der erste direkte Nachweis von Chromosomen-Territorien im Zellkern gelang mittels Hybridisierung von gesamtgenomischer menschlicher DNA auf somatische Hybrid- Zellinien, die ein oder mehrere menschliche Chromosomen enthielten (Manuelidis 1985, Schardin et al. 1985, Pinkel et al. 1986). Die Darstellung einzelner menschlicher Chromosomen im Zellkern menschlicher Zellen setzte zum einen die Verfügbarkeit chromosomenspezifischer Proben (sog. chromosome painting probes) voraus (s. Abschnitt 1.5.1), die den DNA-Gehalt eines spezifischen Chromosoms weitgehend repräsentieren. Zum anderen mußte eine Hybridisierung ubiqitär vorkommender repetitiver Sequenzen effektiv unterdrückt werden. Dies gelang mit dem als chromosomale in situ Supressions-Hybridisierung (CISS) bezeichneten Verfahren, bei dem durch Zugabe eines hohen Überschusses an nichtmarkierter hochrepetitiver DNA die auf allen Chromosomen vorhandenen repetitiven Sequenzen abgedeckt werden und so die markierte Sonde nur mehr mit ihren chromosomenspezifischen Sequenzen bindet. Die Darstellung ganzer menschlicher Chromosomen im Interphasezellkern machte deutlich, daß Chromosomen im Zellkern distinkte Territorien einnehmen, die keine Überlappung (intermingling) mit anderen Territorien oder allenfalls im äußersten Randbereich aufweisen (Cremer et al. 1988, Lichter et al. 1988, Pinkel et al. 1988, Cremer et al. 1993, Dietzel et al. 1998). Folgende Arbeiten mit chromosomenarm- und bandenspezifischen DNA-Sonden konnten belegen, daß Chromosomensegmente innerhalb eines Chromosomenterritoriums jeweils getrennte Subterritorien besetzen (Cremer et al. 1993, Dietzel et al. 1998). Es wurde gezeigt, daß die Gestalt von Chromosomenterritorien nicht starr festgelegt, sondern vielmehr in bestimmten Grenzen variabel ist (Cremer et al. 1995, Eils et al. 1996, Dietzel et al. 1998). Am Beispiel des aktiven und des inaktiven X-Chromosoms in weiblichen Fruchtwasserzellen wurde gezeigt, daß die Gestalt von Chromosomenterritorien in Abhängigkeit von der Transskriptionsaktivität variiert (Bischoff et al. 1993, Eils et al. 1996, Dietzel et al. 1999). Untersuchungen der letzten Jahre an menschlichen Zellen bzw. Säugerzellen ergaben wesentliche Informationen zur Organisationsstruktur von Chromosomenterritorien. Durch eine Puls-Markierung von Zellen während der S-Phase mit halogenierten Nukleotiden wie Bromdesoxyuridin (BrdU), Ioddesoxyuridin (IdU) sowie Chlordesoxyuridin (CldU) und den anschließenden Nachweis mit spezifischen Antikörpern können Bereiche aktiver DNA- Replikation (replication sites oder replication foci) dargestellt werden (Nakamura et al. 1986, Nakayasu und Berezney 1989). Schätzungen zufolge enthalten die replication foci im Durchschnitt einen Cluster aus 5 6 gleichzeitig aktiven Replikons oder 0,8 bis 1 Mbp (1 Mbp = 1 Milliarde Basenpaare) (Jackson und Pombo 1998, Ma et al. 1998). Die granulären replication foci besitzen einen Durchmesser von 300 bis 800 nm. Verlaufsbeobachtungen an einfach und doppelt pulsmarkierten Zellen wiesen nach, daß sich die markierten replication foci über mehrere Zellzyklen hinweg unabhängig vom Zellzyklusstadium nachweisen lassen (Berezney et al. 1995, Jackson und Pombo 1998, Zink et al. 1998, 1999). Es ist sehr wahrscheinlich, daß die replication foci den granulären Chromatindomänen entsprechen, die bei der Darstellung von Chromosomenterritorien mit FISH zu beobachten sind. Daraus ergibt sich die begründete Annahme, daß sich Chromosomenterritorien aus granulären Chromatindomänen mit einer Größe von 300 bis 800 nm aufbauen, die im Mittel etwa 1 Mbp enthalten und in der S-Phase jeweils einem replication focus entsprechen.

8 Einleitung 3 Untersuchungen mit Doppelmarkierungen mit IdU und CldU konnten zeigen, daß in proliferierenden Zellen frühreplizierende DNA, die genreichen R-Banden der Metaphasechromosomen entspricht, und später replizierende DNA, die genarmen G/C- Banden entspricht, im Zellkern unterschiedliche Kompartimente besetzen (Ferreira et al. 1997) und in Chromosomenterritorien abgegrenzte subchromosomale Domänen (subchromosomal foci) bilden (Zink et al. 1998, 1999). Genarmes spätreplizierendes Chromatin ordnet sich bevorzugt in der Kernperipherie und perinukleolär an, genreiches frühreplizierendes Chromatin bevorzugt in einem Bereich zwischen peripherem und perinukleolärem Chromatin. Dabei wurde eine polare Anordnung der früh- und später replizierenden subchromosomalen Domänen in getrennten Bereichen innerhalb der Territorien beobachtet, die zu einer überchromosomalen Kompartimentierung von frühund spätreplizierender DNA im Zellkern führt (Zink et al. 1999). 1.2 Nach welchen Regeln ordnen sich die Chromosomenterritorien im Zellkern an? Nach wie vor sind entscheidende Fragen zur Anordnung der Chromosomenterritorien im Zellkern weitgehend ungeklärt. Dies betrifft etwa die Frage, ob Chromosomen im Zellkern absolut festgelegte, bevorzugte oder variable Anordnungen einnehmen, die Lagebeziehung zwischen homologen Chromosomen, die Assoziation definierter nicht-homologer Chromosomen oder die Lagebeziehung zwischen den paternal und maternal ererbten haploiden Chromosomensätzen (sog. Genomseparation). Die territoriale Organisation von Chromosomen im Zellkern spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der Entstehung chromosomaler Translokationen. Spezifische Translokationen sind mit der Entwicklung spezifischer maligner hämatologischer Erkrankungen korreliert (Heim und Mitelman 1995, Rowley 1999). Die Bildung derartiger Translokationen erfordert eine enge Nachbarschaft der entsprechenden Bruchpunktregionen im Zellkern zum Zeitpunkt der fehlerhaften Rekombination (Cremer C. et al. 1996). Topologische Untersuchungen zu Nachbarschaftsbeziehungen individueller Chromosomen könnten auch Aufschluss über die Frage geben, warum die Translokationsraten individueller Chromosomen nach Bestrahlung nicht proportional zu ihrem DNA-Gehalt sind (Tanaka et al. 1996, Knehr et al. 1996) und warum in bestimmten Zelltypen spezifische Translokationen besonders häufig beobachtet werden können. Vor der Entwicklung der FISH-Technik und der Verfügbarkeit chromosomenspezifischer Proben konnten Untersuchungen zur Verteilung von Chromosomen im Zellkern nur indirekt an Metaphasechromosomen durchgeführt werden. Dabei ist nicht klar, inwieweit die Anordnung der kondensierten Chromosomen in der Metaphase Aussagen zur Anordnung der Chromosomenterritorien im Zellkern zuläßt. Bei Untersuchungen an Präparationen gespreiteter Metaphasen ist darüber hinaus vor allem fraglich, in wieweit die Chromosomenposition auf dem Objektträger der tatsächlichen Anordnung der Chromosomen in der intakten Metaphase entspricht. Um Informationen über Lagebeziehungen von Chromosomen im Zellkern zu erhalten wurde auch wiederholt mittels FISH die zweidimensionale Chromosomenanordnung in der Prometaphaserosette untersucht. Die Prometaphaserosette entspricht der Aufsicht auf die in

9 Einleitung 4 der Metaphaseebene angeordneten Chromosomen. Bei der Kultivierung von Zellen auf einer ebenen Unterlage wie einem mikroskopischen Deckglas kann die Rosette für einen kurzen Zeitraum parallel zur Unterlage liegend (für Fibroblasten ca min) beobachtet werden. Im weiteren Verlauf der Mitose wird die Rosette durch Trennung der Schwesterchromatiden in zwei Anaphasefiguren geteilt. Die relative Anordnung der Chromosomen in der Rosette bleibt über den Abschluß der Zellteilung hinaus erhalten und bildet den Ausgangspunkt für die Chromosomenanordnung in den beiden Tochterzellen. So beobachteten Sun und Yokota (1999) in Tochterzellpaaren menschlicher Fibroblasten in der G1-Phase nahezu identische Zentromerpositionen homologer Chromosomen Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern abhängig von der Chromosomengröße? Bereits in den 30er Jahren wurde an Quetsch-Präparaten von Metaphasen vom Huhn und einigen Insekten-, Amphibien- und Reptilienarten die bevorzugte Lage kleiner Chromosomen im Zentrum der Metaphasen und die bevorzugte Lage grosser Chromosomen in der Peripherie dokumentiert (Zusammenstellung bei White 1961). Die gleiche Tendenz wurde auch für menschliche Zellen beschrieben: In Messungen an mehr als 2000 gespreiteten Metaphasen menschlicher Fibroblasten zeigten die Zentromere kleiner Chromosomen ebenfalls die deutliche Tendenz zu einer mehr zentralen Lage und die von grossen Chromosomen zu einer peripheren Lage (Wollenberg et al. 1982). Hens et al. (1982) kamen in einer entsprechenden Studie an 700 Metaphasen zu dem gleichen Ergebnis. Eine mehr zentrale Zentromerposition der kleinen Chromosomen in der Metaphaseplatte wurde auch an Fibroblasten in elektronenmikroskopischen Serienschnitten dokumentiert, die allerdings nur die Analyse von zehn Zellkernen beinhalten (Leitch et al. 1994, Mosgoller et al. 1991). Hinweise auf eine mögliche Beziehung zwischen der Größe eines Chromosoms und seiner Lage im Zellkern lieferten auch zweidimensionale - FISH-Experimente an (proliferierenden) menschlichen Fruchtwasserzellen. In ca Kernen wurde mittels FISH systematisch die Verteilung der Zentromerpositionen unterschiedlich großer Chromosomen in menschlichen Fruchtwasserzellen mit zentromerspezifischen Proben für die Chromosomen 1,3,4,7,8,12, 15-18, X und Y untersucht (Volm, Dissertation 1994). Nach Einfach- und Doppelhybridisierungen wurden die Distanzen der einzelnen Hybridisierungssignale zur Zellkernmitte ermittelt sowie die Signalabstände zwischen homologen und nicht-homologen Chromosomen gemessen und mit den bei einer zufälligen Verteilung erwarteten Distanzen verglichen. Dabei ergab sich für die großen Chromosomen unabhängig vom Zellzyklusstadium eine weitgehend zufällige Verteilung, während die kleinen Chromosomen signifikant weiter im Inneren des Zellkerns lagen als unter der Annahme einer zufälligen Verteilung erwartet wurde. A. Brero (Brero, Diplomarbeit 1999) untersuchte mit zwei DNA-Sondenpools aus chromosomenspezifischen Paint-Proben die Verteilung der großen Chromosomen 1-5 und X sowie der kleinen nicht-akrozentrischen Chromosomen in ruhenden menschlichen Fibroblasten. Die Untersuchung der Territorienverteilung erfolgte anhand von Projektionsbildern aus Serien lichtoptischer Schnitte, die mit einem Laser-Scanning- Mikroskop aufgenommen wurden. Die aus 82 Kernen gemittelten Daten ergaben einen

10 Einleitung 5 signifikanten Unterschied in der Verteilung der Territorien beiden Chromosomengruppen: die Gruppe der kleine Chromosomen zeigten eine signifikante Präferenz für eine zentrale Position, während die großen Chromosomen signifikant weiter peripher (am Kernrand) lagen (A. Brero, Diplomarbeit 1999). Die Untersuchung der gleichen Territorien in nicht proliferierenden menschlichen Lymphozyten, die eine annähernd kugelförmige Gestalt besitzen, zeigte diesen Unterschied in der Verteilung der großen und der kleinen Territorien noch deutlicher (M. Cremer, unveröffentlichte Befunde) Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern abhängig von der Gendichte bzw. dem Replikationszeitpunkt in der S-Phase? Bereits in den beiden Studien von Wollenberg et al. (1982) und Hens et al. (1982) an Metaphasepräparaten menschlicher Fibroblasten (siehe oben) lag das relativ genreiche Chromosom 1 mehr zentral, das relativ genarme Chromosom 18 weiter peripher, als es die Position der anderen Chromosomen gleicher Größe erwarten ließ. Croft et al. (1999) verglichen mittels FISH die Verteilung des besonders genreichen Chromosoms 19, das fast ausschließlich früh repliziert und des genarmen, vorwiegend spät replizierenden Chromosoms 18 (Dutrillaux 1976) im Zellkern proliferierender menschlicher Fibroblasten und fanden signifikante Unterschiede: Während Chromosom 19 fast immer eine zentrale Position im Zellkern einnimmt, lag Chromosom 18 ganz vorwiegend in der Kernperipherie. Durch eine simultane Darstellung mit dem pki-67 Antigen, das im Verlauf des Zellzyklus charakteristische Verteilungsmuster zeigt (Verheijen et al., 1989), konnte das Persistieren der peripheren Position von Chromosom 18 in proliferierenden Zellen von der frühen G1-Phase an über den gesamten Zellzyklus nachgewiesen werden. Noch ist nicht geklärt, in wieweit die unterschiedliche Kernlage von Chromosom 18 und 19 sich auf proliferierende Zellen beschränkt, oder auch charakteristisch für differenzierte, nicht teilungsaktive Zellen ist. So fanden Bridger et al. (2000) in Fibroblasten, die durch Serumentzug oder Alterung nicht mehr proliferierten, eine Aufgabe der peripheren Lage von Chromosom 18 und eine Verlagerung in Richtung Kernzentrum. Entsprechende Untersuchungen an nichtstimulierten peripheren Lymphozyten ergaben hingegen eine signifikant unterschiedliche Verteilung von Chromosom 18 (peripher) und Chromosom 19 (zentral) in diesen differenzierten, ebenfalls nicht proliferierenden Zellen (M.Cremer, unveröffentlichte Daten) Gibt es feste, zufällige oder statistisch bevorzugte Lagebeziehungen zwischen bestimmten Chromosomenterritorien? Bevor Chromosomen im Zellkern angefärbt werden konnten, wurde beobachtet, daß NORs (nucleolus organizing regions) tragende akrozentrische Chromosomen, die sich in der Interphase um die Nukleolen angeordnen, häufig in Metaphase-Präparaten eng benachbart lagen. Daneben wurde an Metaphase-Präparaten eine häufige Assoziation von zentromerischem und telomerischem Heterochromatin benachbart liegender Chromosomen beschrieben. Daraus wurde eine Anziehung zwischen diesen Heterochromatinbereichen im Zellkern vermutet (Schmid et al. 1975, Kirsch-Volders et al. 1980).

11 Einleitung 6 Zur Frage einer festen Anordnung der Chromosomen in Prometaphase-Rosetten liegen widersprüchliche Aussagen aus FISH-Untersuchungen an menschlichen Zellen vor: Ausgehend von Ein- und Zweifarben-FISH-Experimenten an Prometaphaserosetten (siehe oben) menschlicher Fibroblasten sowie HeLa-Zellen und Winkelmessungen zwischen homologen Chromosomen postulierten Nagele et al in der Zeitschrift Science eine definierte speziesspezifische und zelltypunabhängige Anordnung der homologen Chromosomen in zwei haploiden Sets in einer mehr oder weniger konstanten antiparallelen Reihenfolge. Aus weiteren Untersuchungen an Rosetten embryonaler und adulter sowie triploider Fibrobroblasten wurde eine während der gesamten embryonalen Entwicklung und im adulten Organismus konservierten festen Ordnung der Chromosomen in der Mitose und einer Segregation homologer Chromosomen in haploide Sets entsprechend ihres maternalen oder paternalen Ursprungs abgeleitet (Nagele et al. 1998). Eine derartige Separation haploider Chromosomensätze war mittels in situ Hybridisierung von genomischer DNA in Metaphasen und im Zellkern von Gras-Hybriden nachgewiesen worden (Leitch et al. 1990). Im Gegensatz dazu fanden Allison und Nestor (1999) in Rosetten diploider Fibroblasten und Lymphozyten eine hoch variable, weitgehend zufällige relative Position homologer Chromosomen. In Zweifarben-FISH-Experimenten an Zellkernen von ruhenden diploiden und triploiden Fibroblasten, beobachteten Nagele et al. (1999) nichtzufällige Abstände zwischen den Homologen der Chromosomen 7, 8, 16, X und Y, ohne jedoch eine spezifische Anordnung heterologer Chromosomen nachweisen zu können. In einer Reihe von dreidimensionalen FISH-Untersuchungen an Zellkernen proliferierender Zellen wie kultivierten Fruchtwasserzellen, Fibroblasten und PHA-stimulierten Lymphozyten wurden hoch variable räumliche Lagebeziehungen zwischen homologen und heterologen Chromosomenterritorien beobachtet (Emmerich et al. 1989, Cremer et al. 1993, Popp et al. 1990, Dietzel et al. 1995) Gibt es in differenzierten Zellen zelltypabhängige bevorzugte oder festgelegte Lagebeziehungen zwischen Chromosomenterritorien? Zur Frage, ob es zelltypabhängige bevorzugte oder festgelegte Lagebeziehungen zwischen spezifischen Chromosomenterritorien in differenzierten, nicht proliferierenden Zellen gibt, liegen derzeit nur vereinzelte Daten vor. So ist die Häufigkeit, mit der homologe Chromosomen im Zellkern unmittelbar benachbart liegen, möglicherweise abhängig vom Zelltyp. Chandley et al. (1996) untersuchten die Lage der Chromosomen 3, 7, 8, 13, 17 und 21 sowie X und Y mit Chromosomen-Painting-Proben in adulten Sertolizellen und peripheren Lymphozyten. Dabei beobachteten sie in der Mehrzahl der Sertolizellen eine Assoziation der untersuchten homologen Chromosomen mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen. Im Gegensatz dazu fanden sie in proliferierenden Lymphozyten aus dem peripheren Blut ganz überwiegend eine getrennte Lage der homologen Chromosomen mit Ausnahme der akrozentrischen Chromosomenpaare 13 und 21. Eine Analyse der Abstände zwischen den homologen und heterologen Zentromeren der Chromosomen 7, 11 und 13 in peripheren Lymphozyten ergab keine Hinweise auf eine nichtzufällige Verteilung (Lesko et al. 1991). Kozubek et al. (1999) fanden eine präferentielle Lokalisierung der Chromosomen 9 und 22

12 Einleitung 7 im Zentrum von Kernen von Go-Lymphozyten und darüberhinaus eine überdurchschnittlich häufige unmittelbare Nachbarschaft dieser beiden Chromosomen. Dieser Befund könnte in Beziehung stehen zur Entstehung einer Translokation der Chromosomen 9 und 22 t(9;22) mit Involvierung der BCR/ABL Regionen, die ein charakteristischer Befund bei der chronischen myeloischen Leukämie sowie bei der adulten akuten lymphoblastoiden Leukämie (Kurzrock et al. 1988) ist. 1.3 Ziele dieser Arbeit Die Genome aller heute lebenden Arten entwickelten sich über hunderte von Millionen Jahren aus gemeinsamen Vorstufen. Die vergleichende Genomforschung, d. h. die vergleichende Analyse von Genstruktur und Genomorganisation bei entwicklungsgeschichtlich unterschiedlich weit entfernten Spezies ist ein Schlüssel für die Aufklärung der Funktion von Genen und der Regulation der Genexpression. Der Transfer genetischer Daten zwischen verschiedenen Spezies erwies sich nicht nur für die Grundlagenforschung als außerordentlich wichtig, sondern gewinnt auch in der anwendungsorientierten biomedizinischen Forschung immer mehr an Bedeutung (O Brien et al. 1999). So führen genetische Daten, die beispielsweise am Menschen gewonnen wurden zur direkten Identifizierung korrespondierender Gene bei einer Vielzahl anderer Spezies. Dies ermöglicht die Etablierung von Tiermodellen, mit deren Hilfe die Ursachen für Erkrankungen des Menschen aufgeklärt und Therapieverfahren entwickelt werden können. Befunde von entwicklungsgeschichtlich weiter entfernten Spezies mit stark abweichenden Karyotypen könnten helfen, fundamentale Gesetzmäßigkeiten der Zellkernarchitektur aufzuklären, die auch für den Menschen gültig sind. Im Rahmen dieser Dissertation sollten erstmals Morphologie und Verteilung von Makround Mikrochromosomen im Zellkern einer Vogelart, des Haushuhns Gallus domesticus untersucht werden. Das Huhn besitzt wenige, insgesamt genarme Makrochromosomen, deren Größe im Bereich menschlicher Chromosomen liegt, und viele insgesamt sehr genreiche Mikrochromosomen mit einem DNA Gehalt von jeweils nur etwa 5 bis 25 Millionen Basenpaaren (siehe 1.4). Die Chromosomen von Gallus domesticus zeichnen sich im Vergleich zu menschlichen Chromosomen durch extreme Unterschiede in ihrer Größe und in ihrer Gendichte aus. Dieser entwicklungsgeschichtliche Ansatz sollte Antworten zu folgenden Fragen geben: Unterscheiden sich die Territorien von Makro- und Mikrochromosomen bei Vögeln in wesentlichen Strukturmerkmalen untereinander oder im Vergleich zu Chromosomenterritorien von Säugern? Korrelliert die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern mit der Chromosomengröße und bzw. oder den Anteilen von genarmem und genreichem Chromatin? Liegt der Zellkernarchitektur eine eindeutig festgelegte oder eine variable relative Anordnung der Chromosomenterritorien zugrunde?

13 Einleitung 8 Das erste Ziel bestand in der Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Sonden (Chromosomen-Paints) mittels durchflußzytometrischer Sortierung von Chromosomen und DNA-Amplifikation mit DOP-PCR (siehe 1.5.1). Mit diesen DNA-Sonden, Mehrfarben- Fluoreszenz in situ Hybridisierung (siehe 1.5.2), konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (siehe 1.5.3) und digitaler Bildverarbeitung sollten Chromosomenterritorien im Zellkern in vitro kultivierter embryonaler Fibroblasten und embryonaler Neuronen dreidimensional dargestellt werden. Die beiden Zelltypen sollten Hinweise auf die Bandbreite möglicher Erscheinungsformen in Abhängigkeit von Proliferationsaktivität und zellulärer Differenzierung geben. Im Gegensatz zu den Fibroblasten teilen sich die embryonalen Neuronen unter den gewählten Kulturbedingungen nicht, sondern bilden als Ausdruck ihrer zellulären Differenzierung ein dichtes Netz verzweigter Neuriten. Um die grundsätzliche Verteilung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern zu untersuchen, wurden die Chromosomen nach ihrer Größe in drei Gruppen zusammengefaßt und die drei Chromosomengruppen mittels entsprechender DNA-Sondenpools mit drei Fluorochromen im Zellkern angefärbt. Zur Frage einer eindeutig festgelegten oder variablen relativen Anordnung der Chromosomenterritorien wurden die Makrochromosomen 1 bis 6 und Z, die zusammen etwa 75 % des Genoms enthalten, durch eine kombinatorische Markierung mit drei Fluorochromen verschiedenfarbig dargestellt. 1.4 Genom und Karyotyp von Gallus domesticus Das Haushuhn Gallus domesticus ist als Nutztier von hoher ökonomischer Bedeutung. Riesige Zuchtpopulationen und kurze Generationszeiten bieten die Basis zur Identifizierung von Genen, die für die Ausprägung phänotypischer Merkmale verantwortlich sind. In den letzten Jahren wurde bei Gallus domesticus eine große Anzahl von Einzelgenen und polygenen Markern, sowie von phänotypisch wirksamen Mutationen entdeckt und beschrieben. Darüberhinaus ist das Huhn aufgrund des einfachen Zugriffs auf den frühen Embryo ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Embryonalentwicklung. Vorliegenden Fossilienfunden zufolge trennte sich die Entwicklung der Vögel und der Säugetiere vor Millionen Jahren (Hedges et al. 1996). Die Sequenzierung homologer Gene zwischen Mensch und Huhn offenbart einen hohen Grad der Konservierung über diesen langen Zeitraum unabhängiger Entwicklung. Die vergleichende Genkartierung macht darüber hinaus klar, daß sogar die Gruppierung der Gene und ihre Anordnung innerhalb der Gruppen weit höher konserviert ist, als es die Divergenz der Karyotypen vermuten läßt. Der Grad der Konservierung homologer chromosomaler Segmente zwischen Huhn und Mensch ist vermutlich höher als zwischen Maus und Mensch und ermöglicht die wechselseitige Vorhersage von Genorten (Burt et al. 1999). Das haploide Genom von Gallus domesticus umfaßt mit etwa 1,2 Milliarden Basenpaaren rund ein Drittel des menschlichen Genoms (Smith und Burt 1998). Die Genomgröße ist bei den Vögeln im Gegensatz zu den anderen Vertebratenklassen sehr konstant, wie Untersuchungen an 135 Arten aus 17 Ordnungen ergaben (Tiersch und Wachtel 1991). Die im Vergleich zu Säugern geringere Genomgröße beruht vor allem auf einer geringeren Menge an verstreuten repetitiven Sequenzen, die bei Säugern etwa 50 % des Genoms, aber

14 Einleitung 9 weniger als 15 % eines Vogelgenoms bilden (Burt et al. 1999). Daneben ergab der Sequenzvergleich an 33 Genen im Vergleich zum Menschen bei gleicher Exonlänge signifikant kürzere Introns (Burt et al. 1999). Das Genom von Gallus domesticus besteht aus 78 Chromosomen: 9 Paar Makrochromosomen (Chr. 1 8, Z, W) und 30 Paar Mikrochromosomen, die ohne spezifische DNA-Sonden nicht unterschieden werden können (Nomenklatur: International Committee for the Standardization of the Avian Karyotype, Guelph, Canade 1993). Dabei gibt es zwischen Makro- und Mikrochromosomen keine klare, durch die Größe oder morphologische Kriterien vorgegebene Trennlinie. Die Größenunterschiede der Chromosomen sind enorm: Während das Chromosom 1 mit 250 Millionen Basenpaaren etwa so groß ist wie das menschliche Chromosom 1, liegt die Größe der Mikrochromosomen vermutlich zwischen 7 und 23 Millionen Basenpaaren (Bloom et al. 1993). Zum Vergleich: das kleinste menschliche Chromosom 21 enthält rund 55 Millionen Basenpaare. Ein Karyotyp aus wenigen Makrochromosomen und zahlreichen Mikrochromosomen ist typisch für die meisten der bisher untersuchten Vogelarten (Rodionov et al. 1996). Die Geschlechtsbestimmung erfolgt bei Vögeln über das ZW- System: Männchen sind homogamet mit zwei Z-Chromosomen, Weibchen heterogamet mit einem Z- und einem W-Chromosom. Die Gene verteilen sich asymmetrisch auf Makro- und Mikrochromosomen: Die Mikrochromosomen bilden nur rund 35 % des Genoms, tragen jedoch insgesamt vermutlich etwa 75 % der Gene (McQueen et al. 1998). Die Mikrochromosomen sind durch eine hohe Dichte an CpG-Inseln gekennzeichnet (McQueen et al. 1996). Nach Screening von Cosmiden wurde für die Mikrochromosomen eine Gen-Dichte von einem Gen auf Basenpaare berechnet (McQueen et al. 1998). Dieser Wert kommt der Gendichte des japanischen Pufferfischs (Fugu rubrides) nahe, der unter den Vertebraten das kompakteste bisher bekannte Genom besitzt und daher der vergleichenden Genomforschung als Modellorganismus dient (Elgar 1996). Daneben zeigen die Mikrochromosomen insgesamt eine amino-terminale Hyperacetylierung von Histon H4, einem Kennzeichen transkriptional aktiven Chromatins (Überblick bei Turner 1993, 1998). Dennoch zeigt die C-Bandenfärbung bei den meisten Mikrochromosomen Heterochromatin- Blöcke, viele der kleinsten erscheinen vollständig heterochromatisch (Schmid et al. 1989). Insgesamt bestehen die Mikrochromosomen überwiegend aus frühreplizierender DNA (McQueen et al. 1998), enthalten jedoch auch spätreplizierende DNA (Ponce de Leon et al. 1992). Elektronenmikroskopische Untersuchungen an synaptonemalen Komplexen konnten aufdecken, daß alle Mikrochromosomen ein Zentromer besitzen und überwiegend akrozentrisch sind (Kaelbling und Fechheimer 1983). Die autosomalen Makrochromosomen bestehen überwiegend aus AT-reicher DNA, weisen nur eine schwache R-Bänderung und gleichzeitig nur eine schwache C-Bänderung durch zentromerisches und telomerisches Heterochromatin auf. Die Telomerregion des langen Arms des Z-Chromosoms und das gesamte W-Chromosom erscheinen in der C-Bandenfärbung als konstitutives Heterochromatin (Schmid et al. 1989).

15 Einleitung Die Darstellung von Chromosomenterritorien im Zellkern Die Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben Isolierung spezifischer Chromosomen Der erste Schritt zur Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Sonden ist die Isolierung der gewünschten Chromosomen. Das heute wichtigste Verfahren ist die Sortierung von Metaphasechromosomen nach ihrer Größe und ihrer Basenzusammensetzung mittels Durchflußztytometrie (Davies et al. 1981, Carter 1990, 1994). Nach Anfärbung mit einem bevorzugt an Adenin und Thymin (AT) sowie einem bevorzugt an GC (Guanin und Cytosin) bindenden Fluoreszenzfarbstoff passieren die in einer Lösung suspendierten Chromosomen in einem kontinuierlichen Strom einzeln einen fokussierten Laserstrahl, der die Farbstoffe anregt und einen Photomultiplier, der die emittierten Fluoreszenzintensitäten mißt. Chromosomen mit einer gewählten Fluoreszenzintensität werden in einem elektromagnetischen Feld aus dem Strom abgelenkt und in einem Gefäß aufgefangen. Diese Methode wurde in den vergangenen Jahren erfolgreich zur Sortierung von Chromosomen verschiedener Spezies eingesetzt und als Ausgangsmaterial zur Generierung von Sätzen chromosomen-spezifischer DNA-Bibliotheken für den Menschen (Vooijs et al. 1993) und zahlreicher anderer Spezies verwendet. (Langford et al. 1993, Rabbits et al. 1995, Burkin et al. 1997) Alternativ können einzelne Chromosomen und Chromosomemfragmente mit Hilfe feiner Glasnadeln von mikroskopischen Metaphasepräparaten aufgenommen werden. Dieses Verfahren wurde erstmals 1981 von Scalenghe et al. an polytänen Chromosomen von Drosophila beschrieben. In der Folge konnten mittels Mikrodissektion Metaphasechromosomen verschiedener Spezies mikrodisseziert werden. (Röhme et al. 1984, Bates et al. 1986, Lüdecke et al. 1989, Guan et al. 1994, 1996). Eine weitere Alternative bietet die kürzlich entwickelte Isolierung einzelner Chromosomen mittels Laser Pressure Catapulting (Schermelleh et al.1999) Amplifikation der aus isolierten Chromosomen gewonnenen DNA Die Generierung chromosomenspezifischer DNA-Proben gelang zunächst durch Restriktionsverdau der chromosomenspezifischen DNA und anschliessender Klonierung der Fragmente in Phagen (phage libraries) (Fisher et al. 1985, Bates et al. 1986) oder Plasmiden (plasmid libraries) (Lüdecke et al. 1989, Senger et al. 1990). Diese Klonierungsverfahren waren aufwendig und technisch anspruchsvoll und die Klonierungseffizienz relativ gering. Zudem erforderte die Herstellung dieser Sonden die Kultivierung entsprechend transformierter Bakterienstämme. Insgesamt waren diese Proben aber qualitativ ausreichend für eine spezifische Darstellung einzelner Chromosomen. Ein wichtiger Fortschritt für die Generierung von komplexen DNA-Sonden für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung gelang mit der Entwicklung der Polymerasekettenreaktion (PCR), die eine universelle Amplifikation durchflußytometrisch

16 Einleitung 11 sortierter bzw. mikrodissezierter Chromosomen ermöglicht. Unter den verschiedenen PCR- Techniken für eine sequenzunabhängige Amplifikation einer Ziel-DNA brachte neben der sog. linker-adapter-pcr, bei der Restriktionsfragmente isolierter DNA mit einem linkeradapter-oligonukleotid ligiert und anschliessend mit einem linker-spezifischen Primer amplifiziert werden (Voojis et al 1993) vor allem die Entwicklung der DOP-PCR ( degenerate oligonucleotide primed PCR ) (Telenius et al. 1992) eine entscheidende Verbesserung. Die Sequenz des von Telenius beschriebenen 6MW-DOP-Primers enthält am 5 und 3 -Ende je 6 spezifische Nukleotide, während sie im mittleren Abschnitt "degeneriert" ist, d. h. eine zufällige Sequenz von 6 Basen enthält und somit 4 6 unterschiedliche Sequenzen enthält. Das ermöglicht eine grosse Anzahl an statistisch im Genom verteilten Bindungsstellen. Ein DOP-PCR-Amplifikat repräsentiert einen Großteil der Ausgangs-DNA als Fragmente von etwa Basenpaaren. Im ersten Zyklus bindet bei niedriger Annealing-Temperatur der DOP-Primer partiell mit seinem spezifischen 3 -Ende und dem degenerierten mittleren Abschnitt an die Template-DNA. In den folgenden PCR-Zyklen mit niedriger Annealing-Temperatur werden Fragmente erzeugt, die an einem Ende von einer vollständigen DOP-Primer-Sequenz und am anderen Ende von der dazu komplementären Primer-Sequenz begrenzt werden. Diese Fragmente werden in den anschließenden stringenten Zyklen weiter amplifiziert, in denen die Annealing Temperatur so hoch ist, daß nur noch eine spezifische Primerbindung in voller Länge möglich ist. Die Generierung von chromosomenspezifischen Sonden mittels DOP-PCR ist grundsätzlich technisch einfach und erfordert keine vorherige Aufbereitung der DNA. Minimale Ausgangsmengen an genomischer DNA von weniger als 0,1 Picogramm können auf diese Weise nahezu unbegrenzt amplifiziert werden Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren Licht einer bestimmten Wellenlänge und emittieren einen Teil der aufgenommenen Energie als Licht einer längeren, energieärmeren Wellenlänge. Werden solche Farbstoffmoleküle mit Licht der absorbierten Wellenlänge bestrahlt und durch ein Filter betrachtet, sieht man sie vor einem dunklen Hintergrund leuchten. In einem konventionellen Auflicht-Fluoreszenzmikroskop liefern eine Quecksilber- oder Xenonlampe und ein entsprechender Filter (Exzitationsfilter) Licht der benötigten Wellenlänge, im Falle des Laser-Scanning-Mikroskops erzeugt ein fokussierter Laser monochromatisches Licht. Ein Emissionsfilter läßt nur Wellenlängen, die von dem fluoreszierenden Farbstoff emittiert werden, zum Okular, zu einer Kamera oder einem Photomultiplier gelangen. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht es, in Metaphasepräparaten oder Zellkernen ganze Chromosomen sowie subchromosomale Regionen bis hinunter zu einzelnen Genorten anzufärben. Die in situ Hybridisierung beruht darauf, daß sich einzelsträngige DNA oder RNA im Bereich komplementärer Basensequenzen zu einem Doppelstrang zusammenlagert. Die Anfärbung spezifischer Chromosomen bzw. subchromosomaler Regionen mittels FISH ( chromosome painting ) erlangte in den letzten Jahren ein breites Einsatzspektrum in der klinischen Zytogenetik (Überblick bei Lichter 1997 und Ried et al. 1998). Chromosome painting eröffnete darüber hinaus neue Möglichkeiten für die vergleichende Zytogenetik und die Erforschung der Evolution verschiedenster Spezies (Wienberg et al. 1997, Chowdhary et al. 1998, Müller et al. 1999). Durch Hybridisierung Chromosomen-spezifischer Proben einer Spezies auf Metaphase-Präparate einer anderen Spezies ( Zoo FISH ) lassen sich

17 Einleitung 12 direkt konservierte homologe Chromosomen, Chromosomenarme und Segmente anfärben und auch komplexe chromosomale Umbauten charakterisieren, die sich einer Analyse durch herkömmliche Bandenfärbungen entziehen. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung umfaßt folgende Schritte: Die DNA-Sonde wird direkt mit einem Fluorochrom markiert oder indirekt mit einem Hapten wie Biotin, Digoxigen oder Östradiol markiert, das nach der Hybridisierung mittels spezifisch an das Hapten bindender Fluorochrom-markierter Antikörper oder Avidin nachgewiesen wird. Die indirekte Markierung mit anschließendem Nachweis durch Immunfluoreszenz- ermöglicht in der Regel eine höhere Signalintensität d. h. eine höhere Sensitivität. Die Markierung der DNA-Sonde kann durch den enzymatischen Einbau chemisch veränderter Nukleotide (dntps), vor allem über eine Nicktranslation oder bei Chromosomen-Paints eine stringente DOP-PCR erfolgen. Letztere besitzt den großen Vorteil, daß die Sonden-DNA gleichzeitig mit der Markierung amplifiziert wird. Damit die markierte Sonden-DNA auf komplementäre Sequenzen der Ziel-DNA hybridisieren kann, werden die Ziel-DNA d. h. die DNA der Metaphasechromosomen oder des Zellkerns und die Sonden-DNA durch Erhitzen denaturiert. Bei komplexen Sonden, die auch repetitive ubiquitär auftretende Sequenzen enthalten, wird vor der eigentlichen Hybridisierung eine sogenannte Vorhybridisierung zwischen Sonden-DNA und nichtmarkierter hochrepetitiver DNA wie der Cot-1-Fraktion einfügt, um eine unspezifische Hybridisierung auf entsprechende repetitive Sequenzen der Ziel-DNA zu verhindern. Anschließend wird die Sonden-DNA auf Metaphasechromosomen oder Zellkerne aufgebracht. Nach der Hybridisierung werden in einer Reihe von Waschschritten nicht gebundene Sondenmoleküle entfernt. Über die Waschbedingungen die Zugabe von Formamid, Salzkonzentration und Temperatur kann die Stringenz der Hybridisierung gesteuert werden, d. h. wie genau die korrespondierenden Sequenzen von Sonden- und Ziel- DNA aufeinander passen sollen. Im Falle einer indirekten Markierung wird eine Hybridisierung der Sonden-DNA beispielsweise über Fluorochrom-markierte Antikörper nachgewiesen, die spezifisch an das in die Sonde eingebaute Hapten binden. Die Fluoreszenzsignale der hybridisierten DNA-Sonden werden mit einer CCD-(charge coupled device)-kamera oder für dreidimensionale Untersuchungen an Zellkernen - mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop aufgenommen. Die digitalen Bilder können mit Software bearbeitet und analysiert werden. Grundsätzlich können in einem FISH-Experiment durch den Einsatz mehrerer Fluorochrome, die sich in ihrem Anregungs- und Emissionsspektrum hinreichend unterscheiden, mehrere DNA-Sonden gleichzeitig unabhängig voneinander in verschiedenen Farben dargestellt werden. Dazu wird eine entsprechende Ausrüstung des Mikroskops benötigt, um die entsprechenden Kombinationen von Anregungs- und Emissionsspektrum realisieren zu können. Aus technischen Gründen ist in der Praxis die Zahl der Fluoreszenzfarbstoffe, die gleichzeitig zuverlässig eingesetzt werden kann, begrenzt. So erfordert die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für jede Anregungswellenlänge einen eigenen Laser. Die Anzahl der Zielsequenzen, die gleichzeitig dargestellt werden soll, kann über zwei grundsätzliche Strategien über die Zahl der eingesetzten Fluorochrome hinaus erhöht werden: die kombinatorische Markierung ( combinatorial labeling, Nederlof et al. 1989)

18 Einleitung 13 und die Verhältnis-Markierung ( ratio labeling, Nederlof et al. 1990). Bei der kombinatorischen Markierung wird jede Ziel-DNA mit einer bool schen Kombination von Fluorochromen markiert. So werden Ziel 1 mit Farbstoff A, Ziel 2 mit Farbstoff B und Ziel 3 mit beiden Farbstoffen A und B markiert. Die Anzahl der möglichen Kombinationen für n Fluorochrome ist 2 n 1, d. h. 7 für 3 Fluorochrome, 15 für 4 etc.. Bei der Verhältnis- Markierung werden die DNA-Sonden mit einer Kombination aus Fluorochromen in verschiedenen Mengenverhältnissen markiert. So werden beispielsweise 3 Sonden mit jeweils 2 Farbstoffen A und B markiert: Sonde 1 im Verhältnis 1 : 4 (A : B), Sonde 2 im Verhältnis 1 : 1 und Sonde 3 im Verhältnis 4 : 1. Über eine kombinatorische Markierung mit 5 Fluorochromen gelang gleichzeitig zwei Arbeitsgruppen unabhängig voneinander die simultane Darstellung aller unterschiedlicher menschlichen Chromosomen in verschiedenen Farben (Speicher et al. 1996, Schröck et al. 1996). Bei der multiplex fluorescence in situ hybridization (Speicher et al. 1996) wird mittels fluorochrom-spezifischen Anregungs- und Emissionsfiltern separat für jedes der 5 Fluorochrome mit einer CCD(charge-coupled-device)-Kamera ein Bild aufgenommen. Aus den Einzelkanalbildern wird mit Hilfe von Software ein zusammengesetztes Bild erzeugt, das jedem Chromosom je nach Signalkombination eine Falschfarbe zuweist. Die Markierung der DNA-Sonden für M-FISH wurde durch Bildung von Probenpools und Markierung der Pools mittels DOP-PCR entscheidend vereinfacht (Roberts et al. 1999, Speicher et al. 1999). Bei dem spectral karyotyping (SKY) Verfahren (Schröck et al. 1996) wird eine Bildaufnahme mittels CCD-Kamera mit der Fourier-Spektroskopie kombiniert: dabei wird für jeden Bildpunkt das Emissionsspektrum analysiert. Software klassifiziert das Bild, indem es Pixel mit identischen Spektren identifiziert und ihnen eine entsprechende Falschfarbe zugeweist. Die Kombination aus einer Kombinations- und Verhältnis-Markierung combined binary ratio labeling (COBRA-)FISH (Tanke et al. 1999) verspricht eine weitere Steigerung der gleichzeitig differenziell anfärbbaren Zielsequenzen Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Das Prinzip eines konfokalen Mikroskops wurde von Marvin Minsky erfunden und 1957 in den USA zum Patent angemeldet (Minsky 1961). Erst 30 Jahre später ermöglichten Entwicklungen der Computer- und Lasertechnologie die Konzeption und die Realisierung der konfokalen Mikroskopie für die dreidimensionale Untersuchung fluoreszierender Objekte (Cremer und Cremer 1978, Wijnaends van Resandt et al. 1985) wurden erste konfokale Aufnahmen mit Objektiven mit hoher numerischer Apertur veröffentlicht (Brakenhoff et al. 1979) wurden in der Zeitschrift Nature erstmals konfokale Aufnahmen des Chromatins in Neuroblastomzellkernen vorgestellt (Brakenhoff et al. 1985). Bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wird das Präparat rasterförmig von einem fokussierten Laserstrahl abgetastet. Mit Hilfe einer konfokal zum Laserfokus angeordneten Lochblende im Emissionsstrahlengang werden selektiv nur aus der momentanen lateralen und axialen Position des Laserfokus emittierte Lichtsignale von einem Detektor registriert. Auf diese Weise lassen sich Serien optischer Schnitte durch einen Zellkern herstellen, aus denen dreidimensionale Bilder rekonstruiert werden können. In der Praxis liegt das physikalische Auflösungsvermögen des Laser-Scanning-Mikroskops für Fluoreszenzmarkierungen in Zellkernen bei etwa nm lateral und nm axial

19 Einleitung 14 (Edelmann et al. 1999). Das Potential der Laser-Scanning-Mikroskopie wurde in den letzten Jahren durch Entwicklungen der digitalen Bildverarbeitung zur Korrektur von Abbildungsfehlern, der Eliminierung extrafokaler Signale (Dekonvolution) und dreidimensionalen Rekonstruktion entscheidend weiter verbessert.

20 Material und Methoden 15 2 Material und Methoden 2.1 Zellkultur Für die Anzucht embryonaler Zellen wurden Bruteier von einer weißen Leghorn-Henne und einem Araucana-Hahn verwendet (Bezug: L. Hölzl, Moosburg) Anzucht embryonaler Fibroblasten Material: 50 ml, 250 ml und 750 ml Kulturflaschen (Falcon, Becton Dickinson, UK) Quadriperm Gewebekulturschalen (Heraeus, Hanau) Mikroskopische Deckgläser 76 x 26 mm, Dicke 0,17 ± 0,01 mm (Hecht Assistent No. 1014, Bezug: Labor Schubert, München) DMEM (Dulbecco s minimal essential medium) mit 3,7 g/l NaHCO3, 4,5 g/l Glucose, N-Acetyl-L-Alanyl-Glutamin (Kat.-Nr. FG0435, Biochrom, Berlin) FCS (fetal calf serum) (Kat.-Nr. S0115, Biochrom) Penicillin/Streptomycin, U/ µg/ml (Kat.-Nr. A2213, Biochrom) 10x Trypsin/EDTA 0,5 % / 0,2 % (Kat.-Nr. L2153, Biochrom) PBS (phosphate buffered saline), autoklaviert Kulturmedium: 500 ml DMEM 50 ml FCS 5 ml Penicillin/Streptomycin Durchführung: Bebrütung der Eier 5-6 Tage bei 38,5 C Sterile Entnahme des Embryos Nach Waschen in PBS Zerkleinerung von Rumpf und Gliedmaßen mit Skalpel Aufnahme des zerkleinerten Gewebes mit einer 2 ml Pipette in 2 ml Zellkulturmedium und Dispergierung in einer 50 ml Gewebekulturflasche mit 8 ml Medium. Kultivierung bei 39 C, 100 % Luftfeuchte und Begasung mit 3 5 % CO2 Nach 24 h Absaugen des Mediums und vorsichtiges Spülen der Flasche mit PBS, Ablösung und Dissoziation der die am Flaschenboden angehefteten Zellen und Gewebestückchen durch Inkubation mit 1,5 ml 0,05%/0,02% Trypsin/EDTA für 5 min bei 37 C und Aussaat in neue 50 ml Flasche mit 8 ml Kulturmedium. Bei einer Zelldichte von etwa 80 % h später erneut Abtrypsinieren der Zellen und Verteilung auf zwei 50 ml Flaschen. Die Kultur besteht nun weitestgehend aus Einzelzellen mit fibroblastärem Erscheinungsbild. Weitere Kultivierung in 250 ml Zellkulturflaschen