VO Mikrobielle Ökologie (Molekulare Methoden) WS04/05

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1 VO Mikrobielle Ökologie (Molekulare Methoden) WS04/05 Inhalt 1. Bedeutung und Zielsetzung der mikrobiellen Ökologie/Grundlagen und Anwendungsgebiete molekularer Methoden in der mikrobiellen Ökologie 2. Konzepte und Methoden zur Untersuchung mikrobieller Diversität in komplexen Umwelt- und med. Proben 3. Methoden, um gesamte Genomsequenz eines Organismus/einer Umweltprobe zu erhalten 4. Konzepte und Methoden zur funktionellen Analyse von Mikroorganismen in komplexen Umwelt- und med. Proben 1. Bedeutung und Zielsetzung der mikrobiellen Ökologie/Grundlagen und Anwendungsgebiete molekularer Methoden in der mikrobiellen Ökologie Bedeutung von Bakterien Stoffkreisläufe sind hauptsächlich von Bakterien angetrieben (Bsp: N-Zyklus) Prokaryoten machen den Hauptbestandteil der Biomasse der Erde aus ("The unseen majority") Geringe Größe (im Durchschnitt ~3 Mikrometer) durch passive Transportwege durch Zellwand/- membran -> hohes Oberflächen/Volumen-Verhältnis nötig Ausnahmen: Epulopiscium fishelsoni, 600 µm lang und Thiomargarita namibiensis, Durchmesser 750 µm haben stark gefaltete Zellwand oder spezielle Speicherorte für Nährstoffe, die größere Maße erlauben. Pelagibacter ubique ist sehr kleines Bakterium: ~0,1µm Mikrohabitate der MO's schwer nachstellbar (enorme physiko-chemische Gradienten von Ressourcen und Wachstumsbedingungen auf engstem Raum, zb in Bodenpartikeln), Kultivierung und repräsentative Probennahme dadurch erschwert Bakterien waren erstes Leben auf der Erde - 2,5 Milliarden Jahre Vorsprung an Evolutionszeit vor Entstehung der Eukaryoten (Pflanzen, Tiere und Pilze sind näher zueinander verwandt als die meisten prokaryotischen Linien) hohe Diversität der Stoffwechselwege bei Bakterien (genetische Diversität - biotechnologische Anwendungen) Je höher die Diversität eines ÖS, desto höher die Stabilität/Produktivität Artenschutz bei Prokaryoten nötig? (Hochspezialisierte Bakterien, Bsp: Endosymbionten von Insekten) - erst ~0,4% beschrieben (5200 Arten; geschätzte 4,5 Millionen Arten oder mehr als 7,9 Mill., falls jedes Insekt min. einen spezifischen Endosymbionten trägt) Begriffsdefinitionen Individuum...einzelner Prokaryot Population...durch Teilung aus Individuum entstanden Gilde...Gruppe von Bakterien, die bestimmte Nährstoffe/Elektronendonatoren nutzen Microbial community...summe aller Gilden in einem Teillebensraum eines ÖS, zb photische Zone eines stehenden Gewässers Klassische Taxonomie Phylogenie...stammesgeschichtliche Entwicklung Taxonomie...Anordnung, Nomenklatur, Identifikation von Organismen anhand eines Stammbaumschemas, Hierarchie: Domäne Phylum Klasse Ordnung Familie 1

2 Gattung Art Unterart erster bakterieller Taxonom: Antonie van Leeuwenhoek, 17/18. Jhdt. Klassifizierung nach Morphologie, Struktur, Physiologie und Biochemie Artkonzepte in der Mikrobiologie rein pragmatisch, keine biologischen Artkonzepte 1. Numerische Taxonomie anhand von phänotypischen Tests Eigenschaften von Bakterien getestet mathematische Berechnung von Ähnlichkeit Art = >80% ähnliche Eigenschaften e Wertung von einzelnen Eigenschaften? phänotypische Eigenschaften geben nur kleines Bild (5-20%) der genetischen Eigenschaften wider 2. G+C-Gehalt G+C mol% = [G+C] / [G+C+A+T] x 100 Art = weniger als 5 mol% Unterschied Gattung = bis 15 mol% Unterschied nicht immer zutreffend 3. DNA-DNA Ähnlichkeit RBR...relative binding ratio Anteil an gebildeter Heteroduplex-DNA bei Denaturierung und anschließender Reassoziation der DNA von zwei Organismen (Heteroduplex bildet sich nur bei min. 80%iger Sequenzkomplementarität aus) deltatm...unterschied der Temperaturen bei der 50% der Heteroduplex- und 50% der Homoduplex- DNA denaturiert haben Art = RBR > 70% und deltatm < 5 C heute gültiges Artkonzept 4. Taxonomie mit molekularen Chronometern Gene, die universell verbreitet, funktionell homolog sind und konservierte und variable Bereiche aufweisen, eignen sich als molekulare "Zeitmesser", anhand deren die Verwandtschaft von Organismen berechnet werden kann. Bsp: ATPase (nützt H+-Ionengradienten, um ATP zu generieren) EF-Tu (Elongation factor, der bei Transkription von mrnas zu Proteinen die mit Aminosäuren aktivierten trnas aneinander hängt) RecA (Protein, das Rekombination von homologer DNA und DNA-Reparatur katalysiert) rrnas (die bei Prokaryoten für 5S, 16S, 23S Proteine kodieren, die in Ribosomen enthalten sind) 16SrRNA heute am häufigsten verwendet. Vorteile hoher Informationsgehalt trotzdem nicht zu lange Sequenz DNA-Sonden einsetzbar Organismen, die aufgrund des mikrobiellen Artkonzepts zu einer Art gerechnet werden, weisen alle mindestens 97% Sequenzidentität der 16SrDNS auf. Umgekehrt zeigen aber nicht alle Organismen, die mehr als 97% Sequenzidentität haben, eine DNA-DNA-Ähnlichkeit von min. 70%. OTU...operational taxonomic unit, statt "Art", bei Untersuchungen, die nur 16SrDNA untersuchen. Ein unit enthält alle Sequenzen, die weniger als 97% Unterschied aufweisen. 16SrRNA-Stammbaum als Grundlage für Standardwerk der Bakteriellen Systematik (Bergey's Manual, 2nd Edition) verwendet: 2

3 Bakteria (Gram-Negative, Gram-Positive und tief verzweigte Bakteria) und Archaea (Euryarchaeota und Crenarchaeota) unterschieden monophyletisch...gruppe enthält alle Nachfahren eines gemeinsamen Vorfahrens paraphyletisch...gruppe, die primitive Eigenschaften teilt, aber nicht die weitestentwickelten Nachfahren enthält polyphyletisch...gruppe, die gemeinsame Eigenschaften aufweist, aber von verschiedenen Vorfahren abstammt Polyphasiche Taxonomie Diverse Methoden eignen sich für verschiedene Hierarchie-Ebenen bei Verwandtschafts-Untersuchungen, zb: RFLP...Restriction fragment length polymorphism für Untersuchungen auf Bakterienstammniveau mol% G+C...für Untersuchungen auf Gattungs- bis Stammebene Zellwandeigenschaften...Familien- bis Artniveau DNA-Sonden bzw. DNA-Sequenzen...decken alle Ebenen ab, je nach Grad der Konservierung der untersuchten Sequenz 2. Konzepte und Methoden zur Untersuchung mikrobieller Diversität in komplexen Umwelt- und med. Proben Kultivierungs-Methoden Kultivierung auf Agar-Platten Spread Plate Method Ausstreichen von Verdünnungen auf gehärtetem Agar Pour Plate Method Übergießen von Proben mit heißem Agar Anwachsen von Bakterien auf/in Agar und Koloniebildung aus Einzelzellen - dadurch Reinkulturen züchtbar. Verdünnungsreihen nötig, da bei hoher Zellkonzentration keine einzelnen, abgrenzbaren Kolonien auf Agar entstehen. e sehr geringer Prozentsatz an kultivierbaren Organismen (im Bereich 0,1-3%, max. 15% bei eutrophen Systemen), Ursachen: Nährmedien entsprechen meist nicht Umweltbedingungen (Anaerobe Bedingungen im Labor nur sehr aufwendig herstellbar; Organismen, die Gradienten brauchen; unbekannte Symbiosen nicht nachstellbar) eutrophe Organismen und r-strategen bevorzugt durch hohe Nährstoffkonzentration und kurze Keimungsdauer bei rel. hohen Temperaturen (Microbial weeds überwachsen eigentlich dominante Bakterien, die aber langsamere Teilungsraten haben) Aggregierte Zellen aus Biofilmen oder Flocken werden nicht gut vereinzelt heute hat Mehrzahl an definierten Phyla bei Bakterien keine kultivierbaren Vertreter Most Probable Number Method Kultivierung in flüssigem Medium in Eppendorf Tubes. Wenn Medium trüb wird, ist es positiver Hinweis auf Bakterienvermehrung. Immer drei Tubes mit derselben Verdünnung angesetzt Konfidenzintervall für geschätzte Bakterienkonzentration von geringsten Konzentration mit min. einem positivem Ergebnis bis zur Konzentration, wo alle drei Tubes positiv sind. High-Throughput extinction culturing Alle Zellen einer Umweltprobe (Meerwasser) werden mit DAPI (Fluoreszenzfarbstoff, der an DNA bindet) gefärbt 3

4 Probe wird filtriert, um höhere Zelldichte zu erlangen und Verschmutzungen zu entfernen Zählung der Zellen auf Filtermembran Kultivierungsmedium ist Meerwasser, das filtriert und autoclaviert wurde (Hitzebehandlung) 1-5 Zellen pro Eintiefung werden in Microtiterplatte für ~drei Wochen kultiviert entstandene Suspensionen werden auf Nylonmembran transferiert und mit FISH identifiziert Bsp: Pelagibacter ubique Max. Zelldichte von 10 6 erreichbar (im Vergleich mit Agar-Kulturen gering) Diffusion Chambers Bakterien aus Umweltprobe zwischen zwei Membranen, die durch Eisenring zusammengehalten werden, in natürlicher Umgebung eingegraben und für mehrere Wochen kultiviert 30-40% Erfolgsrate Transfer ins Labor zur Analyse muss trotzdem stattfinden Verluste Optical Tweezers (Optische Pinzetten) Werden benutzt um Zellen aus Gemisch zu vereinzeln. Möglich durch Fokussierung von starkem Laserstrahl auf Einzelzelle. Zelle kann sich nicht mehr frei bewegen, wird aber sonst nicht geschädigt. Konkurrenzfreie Kultivierung so möglich Gel Microdroplet Cultivation (GMD) Umweltprobe Reinigung der Probe Maschinelle Umhüllung einzelner Zellen mit Gel Micro Droplet (Agarose mit poröser Oberfläche, die Eindringen von Nährstoffen erlaubt) GMDs in Bioreaktor mit Nährmedium umspült Sortieren der GMDs mit FACS (Fluorescence activated cell sorting, basiert auf Flow Cytometry) Hydrodynamischer Focus genutzt, um GMDs einzeln an Detektoren vorbeizuführen (äußere Strömung an Wand der Kapillare ist schneller als im Zentrum, dadurch werden Zellen in Mitte fokussiert) Im Detektor werden GMDs mit Laserstrahl beleuchtet. abgelenktes Licht wird detektiert. Für jede Zelle werden zwei Daten gespeichert: forward scatter (Aussage über Größe des Partikels) und side scatter (Aussage über Oberfläche, Innere Strukturen, Fluoreszenz) FACS-Erweiterung des Durchfluß-Zytometers erlaubt anschließende physikalische Trennung von Zellen aufgrund der erhobenen Daten ( Gates werden gelegt, die bestimmte Bandbreite an Eigenschaften beinhalten) Aussortieren von Microdroplets mit entwickelten Kolonien zur weiteren Analyse Flow cytometry und FACS können auch mit FISH kombiniert werden Auf Microtiterplatte können Kolonien weiter vermehrt werden Teure und aufwändige Methode, die von Biotech-Firma entwickelt wurde Kultivierungsunabhängige Methoden Abschätzung der Diversität bei Untersuchung von Umweltproben DNA-DNA-Reassoziationsgeschwindigkeit Je länger die Reassoziation dauert, desto komplexer ist die Probe und desto mehr Arten sind vorhanden Co x t1/2...zeitpunkt, wenn 50% der ssdna reassoziiert sind 4

5 Co...ursprüngliche Konzentration an einzelsträngiger DNA t...zeit in Sekunden Rarefaction (Coverage Abschätzung) Konzept geht davon aus, dass beim Sequenzieren alle OTUs einer Umweltprobe erfasst wurden, wenn jede Sequenz mindestens zweimal gefunden wurde. (Mathematisch nicht ganz korrekt) Rarefaction-Kurve ist umso steiler, je mehr Organismen in einer Umweltprobe enthalten sind (je höher die Diversität ist) C = [1-(n1/N)] x 100 C...Coverage n1...anzahl an OTUs, die nur einmal gefunden wurden N...Gesamtzahl an OTUs rrns-ansatz (ribosomale Ribonukleinsäure) 1. Reinkultur 2. Isolierung der DNA a. Zell Lyse Zellwand und Zellmembran zerstören mechanisch [Bead beating, sehr erfolgreiche Methode] oder enzymatisch [SDS] b. Hemmung von DNAse [EDTA], RNA-Abbau c. Aufreinigung der DNA Gel-Filtration oder Anionentauscher-Säule Extraktion mit Phenol:Chlorofrom:Isoamyl-Mischung (DNA, RNA in wässriger, oberer Phase) Fällung von DNA aus wässriger Lösung durch Zugabe von Na+-Salz, Zentrifugation und Reinigung mit Ethanol zur Entfernung des Salzes Lösen der DNA in zweifach destilliertem Wasser 3. Amplifizierung (PCR) und Sequenzierung der DNA 4. Vergleichende rdns-sequenz-analyse a. "Alignment" Zwei Sequenzen werden verglichen Änderungen (Deletions-Mutationen, etc.) werden angenommen, um eine möglichst hohe Sequenz-Übereinstimmung zu erreichen Berechnung der Kosten des Alignments (Alignment mit den geringsten Kosten soll gefunden werden): D = s + w x g D...Kosten s...anzahl an Substitutionen w...strafkoeffizient für Lücken g...anzahl an Lücken (Gesamtlänge) Zusatzinformation über Sekundärstruktur der 16SrRNA meist nötig, um Qualität des Alignments einschätzen zu können b. Berechnung der Dissimilarität der Sequenzen, um Anzahl der evolutionären Änderungen abschätzen zu können und dadurch ein Maß für die evolutionären Distanz zu erhalten c. Stammbaum-Errechnung mit einer Methode, die paarweises Alignment verwendet Neighbour Joining UPMGA [Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean] mit maximum parsimony/likelihood Methode berechnet die Wahrscheinlichkeit von allen Mutations-Wegen zwischen Sequenzen d. Darstellung des Stammbaumes als Dendrogramm oder Radialbaum 5. Identifizierung des Organismus anhand Eingliederung im Stammbaum 5

6 full cycle rrns-ansatz [Legende: fett...fixpunkt/normal...arbeitsschritt] Umweltprobe PCR zur Amplifizierung der 16SrDNA 16SrDNA Klonieren der DNA in Vektor DNA in Plasmid inserieren, Vermehrung der Plasmiden in E. coli-zelle Datenbank (bestimmte) Klone sequenzieren 16SrDNA-Sequenzen Vegleichende Analyse der Sequenzen Phylogenie Sonden-Design Sonden FISH/Dot blot/microarray Umweltprobe e (gelten auch für rrns-ansatz) / Möglichkeit zur Vermeidung 1. Anzahl der Klone entspricht nicht Anzahl der Organismen a. oft mehrere 16SrRNA-Gene in einem Bakterien-Genom, die sich unterscheiden (meist nur minimal, aber Ausnahmen). Reflektiert ökologische Eigenschaften des Bakteriums: hohe Anzahl an Genkopien bei r-strategen, geringe bei K-Strategen b. multiple Genome 2. Jeder Arbeitsschritt im Zyklus verursacht Verzerrungen a. Zell-Lyse je nach Methode verschieden effizient - Verwendung verschiedener Verfahren Zellwandaufbau von Bakterien EPS (extrazelluläre polymere Substanzen), die Zellen umhüllt Verschmutzungen, die zu PCR-en führen können, oft mitextrahiert b. PCR Selektionseffekte hoher G+C-Gehalt in DNA führt zu schlechterer Amplifizierung (hohe Bindungsenergie der dreifachen H-Brückenbindung) im Gegensatz dazu binden Primer mit hohem G+C-Gehalt aber besser (bei degenerierten Primern - Gemisch aus verschiedenen Sequenzen, die hochkonservierte Region bei möglichst allen Organismen erfassen sollen - Auswirkungen) - verschiedene "universelle" Primer verwenden, möglichst nicht degenerierte Ausbildung von Sekundärstrukturen bei templates (wenn sehr stabil, weniger gute Amplifikation) Template reannealing = Endprodukthemmung (Templates sind länger als Primer und haben höhere Bindungsenergie, sind konkurrenzstärker bei hohen Konzentrationen und bilden Doppelstrang mit zweitem Template) bei hoher Zyklenzahl gleicht sich Anzahl der verschiedenen Sequenzen aus (PCR ist nicht quantitativ!) - geringe Zyklenzahl bei möglichst hoher Template-Konzentration Drift-Effekte ersten PCR Zyklen verursachen stochastische Variation (zufällige Bindung der Primer an die ersten Templates wirkt sich aus) - Poolen von parallelen PCR-Replikaten vor Analyse Artefakte Heteroduplex-Bildung Chimären (aus Bruchstücken von mehreren Sequenzen zusammengesetzt, mögliche Ursache: plötzlicher Abbruch der Primerverlängerung) Deletionsmutanten Punktmutanten 6

7 Kontamination mit Fremd-DNA (einige Organismen sind scheinbar in allen Proben enthalten) c. Klonierung (Vektoren-Einbringung verschieden erfolgreich) FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) Umweltprobe 1. Permeabilisierung/Fixierung a. Prinzip Zelle durchlässig für Sonden machen, ohne dass Zellinhalt verloren geht b. Methoden Ethanol mit Lysozym bei Gram+ Paraformaldehyd bei Gramc. e Zellen sterben durch Fixierung ab 3D-Struktur der Probe durch Fixierung, Dehydrierung und Sonden verändert - Einbetten der Probe in Agarose oder Polyacrylamid, die Hybridisierungspuffer und Sonden enthält, in einer Hybridisierungskammer (nur für CLSM) 2. Sondendesign a. Prinzip Oligonukleotid-Gensonden (manchmal Polynukleotid-Sonden) mit angeheftetem Fluoreszenzfarbstoff (oder Enzym, oder Radionukleid) am Ende der Sequenz, die in Zellen an bestimmte Stelle der 16SrRNA in Ribosomen binden und Einzelzellen so detektierbar machen konservierte bis variable Bindungsstellen können je nach gewünschter Spezifität der Sonde ausgewählt werden mehrere Sonden gleichzeitig bei einem Organismus einsetzbar - hierarchisches Sondendesign möglich. Additive Mischung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht bis zu sieben verschiedene Organismen mit nur drei Farben zu detektieren: FLUOS (grün), Cy3 (orange), Cy5 (rot) Beim Sonden-Entwerfen sind Anzahl, Position (Fehlpaarungen in Mitte der Sequenz wirken sich stärker aus) und Art der Basenfehlpaarungen (G-T Fehlpaarung hat relativ hohe Bindungsenergie) zu beachten b. e min Ribosomen pro Zelle nötig, um Detektion zu ermöglichen. in oligotrophen ÖS - Zugabe von Chloramphenicol und ein wenig Nährmedium vor Fixierung erhöht Ribosomengehalt i.d.r. manche Sonden geben kein oder nur schwaches Signal (Ursachen unbekannt) Sondeneignung muss empirisch ausgetestet werden - andere Sonden (Bindungsstellen), mehrfach markierte Polynukleotidsonden oder CARD-FISH (Enzymmarkierte [Meerrettichperoxidase] Sonden, die Fluoreszenzfarbstoff [Tyramid] umsetzen - auch mit Polynukleotidsonden möglich) Helfersonden binden an benachbarte Stellen der eigentlichen Zielsequenz und öffnen so die Sekundärstruktur, damit die Fluoreszenz-markierte Sonde besser binden kann und stärkeres Signal gibt 3. Hybridisierung a. Prinzip Stringenz (Bedingungen der Sondenanheftung [Td...Temperatur, bei der 50% der Sonden noch an rrna gebunden sind] für Ziel-Organismus optimiert, für Nicht-Zielorganismen möglichst ungünstig) b. Methoden Kompetitoren (binden an komplementäre Sequenz-Stelle bei Nichtzielorganismen) Salzgehalt (erhöht Stabilität der Bindung zwischen der negativ-geladenen rrna und der negativ geladenen Sonde) Formamid (schwächt H-Brückenbindungen: Fehlpaarung werden geschwächt) Temperatur (je höher die Temp., desto spezifischer muss Bindung sein, um noch zu halten) 7

8 4. Detektion a. Prinzip Fluoreszenz entsteht durch Anregung eines Farbstoffes mit Licht einer bestimmten Wellenlänge. Das emittierte Licht hat immer eine größere Wellenlänge als das eingestrahlte, und ist weniger energiereich. Anregung nur durch Licht mit Wellenlängen innerhalb eines bestimmten Bereichs, auch bei Emission Strahlung nur in einem bestimmten Bereich des Spektrums. Dichroitische Spiegel reflektieren kurzwelliges Licht und sind durchlässig für Licht mit Wellenlängen überhalb eines Schwellenwertes. Bei Anregung und für getrennte Detektion spezifischer Wellenlängen angewendet. b. Methoden Epifluoreszenzmikroskopie numerische Apertur beschreibt das Auflösungsvermögen eines Objektivs (abhängig von Brennweite des Objektivs, sphärischer und chromatischer Aberration, Brechungsindex des Mediums, in dem Objekt eingebettet ist, und dem halben Öffnungswinkel der Linse) sphärische Aberration...Rand- und Mittelzonen des Bildes haben verschiedene Schärfen. chromatische Aberration...farbliche Fehler des Bildes Ölfilm zwischen Frontlinse des Objektivs und Deckglas erhöht Numerische Apertur (weniger Strahlen werden abgelenkt) Höhere Auflösung des Bildes durch: kleinere Wellenlänge des emittierten Lichts, höhere Numerische Apertur und Linsen-Korrekturen, die Aberrationseffekte gering halten (führt zu kleineren Unschärfekreisen bei Bildpunkten) Schärfentiefe durch Verwendung von Blenden hinter Linse erhöhbar (Unschärfekreise sind kleiner, weil nur ein Ausschnitt des Lichtweges betrachtet wird) Je höher die numerische Apertur eines Objektivs ist, desto geringer die Schärfentiefe. : Proben müssen dünner sein als maximal mögliche Schärfentiefe bei Epifluoreszenz- Mikroskop, um scharf zu erscheinen Konfokale Laserscanning Mikroskopie Inverse Mikroskopie (Mikroskop unter Deckglas) Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe mit Laserstrahl Prinzip der Konfokalität: Illuminationslochblende - nur ein scheibenförmiger Objektbereich wird beleuchtet und das Objektfeld "Punkt für Punkt" und Zeile für Zeile abgerastert. Effekt: weniger Streulicht aus benachbarten Objektbereichen (erhöht die Schärfe und den Kontrast des resultierenden Bildes) zweite - in ihrem Durchmesser veränderbare - Lochblende in der aufnehmenden Optik fokussiert die selbe Objektebene wie die beleuchtende Optik Voraussetzung für die Akquirierung von optischen Serienschnitten durch ein Präparat scheinbar "unendliche" Schärfentiefe. Detektion digitaler Bilder 5. Digitale Bildanalyse (Anwendungen) Quantifizierung und Häufigkeitsanalysen von Bakterien mittels 1. digitale Bildsegmentierung (Schwellenwert an Signalintensität muss überschritten werden): Bild mit allgemeiner Sonde und Bild mit spezifischer Sonde werden verglichen nach Flächenanteil der markierten Zellen (in Prozent angegeben) Nachteil: Anteil nicht in absolute Zahlen umrechenbar, verschiedene Proben nicht vergleichbar 2. Spike-FISH Bild der autochthonen Population aufgenommen und Prozentanteil der Zellen an gesamter Bildfläche ausgerechnet Bekannte Konzentrationen an E. coli Zellen pro ml zu Probe zugegeben. Eichreihe erstellbar mit detektiertem Flächenanteil von E. coli und Zellkonzentration Korrekturfaktor für andere Bakterien nötig (Flächenverhältnis einer E. coli Zelle zu einer Zelle der autochthonen Population), um von Fläche auf Zellzahl rückrechnen zu können Messung der Signalintensität einzelner Zellen (Anwendungen) Optimierung der Hybridisierungpuffer Ribosomengehalt korreliert bei vielen Bakterien mit der Wachstumsrate - durch FISH in situ abschätzbar. : Ribosomen werden bei Inaktivität nicht gleich wieder abgebaut - 8

9 dadurch Fehleinschätzungen Messung von Biofilm-Parametern Kolokalisationsanalysen 3D-Visualisierung der Einzel-Schnitte durch Objekt e - Lösungsmöglichkeiten 1. unteres Detektionslimit von Zellen pro ml - Filtrieren von Wasserproben vor FISH, Anreicherung der Zellen nach FISH durch Durchflußzytometrie oder Zugabe von Nährmedien zur Probe vor FISH 2. starke Hintergrundfluoreszenz von Proben - Signalverstärkung (CARD-FISH, Polynukleotidsonden), Wegrechnen des Hintergrunds bei digitaler Bildanalyse, spezieller Detektor bei CLSM (blendet Hintergrund aus), Entfernung der Zellen aus Probe durch Auswaschung und Detektion auf Filter Dot Blot/Slot Blot blot...punktförmige Probenauftragung slot...schlitzförmige Probenauftragung Umweltprobe RNA-Extraktion (schwierig durch Labilität der RNA) Denaturierung der RNA (Sekundärstruktur wird aufgelöst, dadurch mehr Bindungsstellen für Sonden zugänglich) Fixierung der RNA auf Membran ( Blotten, immer selbe Probenmenge) Hybridisierung mit Sonde (mit radioaktivem Phosphor markiert), Waschen (entfernt überschüssige, nichthybridisierte Sonden) Detektion mit Phosphoimager/Röntgenfilm Vorteile mehrere Umweltproben gleichzeitig analysierbar mehrere Sonden anwendbar, allerdings nur hintereinander (Abwaschen der ersten Sonde mit heißem Wasser und Hybridisierung mit weiteren Sonden) relativ (% bakterielle rrna) und absolut (ng rrna) quantifizierbar durch Vergleich der erhaltenen Signalintensitäten mit Referenz-RNA Konzentrationsreihe Nachteile Konzentration nicht in Zellzahl umrechenbar rrna-gehalt erlaubt nicht Rückschlüsse auf Aktivität rrna-extraktion muss sehr effizient und sauber ablaufen (Reinigung auf Polyacrylamid-Gel) Fingerprint-Verfahren dienen dem Nachweis und der Identifikation von Bakterienstämmen DGGE Umweltprobe DNA-Extraktion PCR-Amplifikation von 16SrRNA-Genen (GC-Klammern an Sequenzen angehängt) Reinigung in Polyacrylamid-Gel Auftrennung von mehreren Umweltproben in Banden von 16SrDNA mit verschiedener Sequenz mit DGGE Anfärbung, um Banden sichtbar zu machen Ausschneiden der Banden aus Gel Sequenzierung 9

10 Prinzip durch Denaturierendes Agens werden Doppelstränge der DNA aufgetrennt in Einzelstränge, die schneller durch das Gel laufen GC-Klammer wird bei PCR ans Ende der Sequenz angeheftet und verhindert, dass Einzelstränge weiterlaufen: lange Folge von GC-Bindungen ist so stabil, dass sie noch besteht, wenn alle anderen Bindungen schon denaturiert sind. Das führt zu einer fallschirmartigen Struktur im Gel, die am Ort der vollständigen Denaturierung der eigentlichen Sequenz stecken bleibt dadurch unterschiedliche Sequenzen gleicher Länge voneinander trennbar Vorteile billige und schnelle Methode, um einen Überblick über die häufigsten Bakterien in einer Umweltprobe zu erhalten Nachteile DNA-Extraktion- und PCR-Verzerrungen begrenzte Auflösung, e vor allem bei hoher Diversität Fragmentlänge auf ~500bp begrenzt nur die häufigsten Organismen detektierbar (Richtwert >1% der Population) Varianten von DGGE perpendicular DGGE nur eine Probe analysierbar, Gradient von Denaturierendem Agens in rechtem Winkel zu Laufrichtung (von Plus- zu Minus-Pol) angelegt dient der Bestimmung der optimalen Konzentration an Denaturierendem Agens für bestimmte Probe parallel DGGE Gradient des Denaturierenden Agens verläuft parallel zu der Laufrichtung. Mehrere Proben gleichzeitig analysierbar. TGGE Temperaturgradient statt Denaturierendem Agens verwendet, um DNA zu denaturieren DNA Microarrays Prinzip Prinzip des Reverse Sample Genome Probing adaptiert Reverse Hybridisierung Gesamtes Genom eines Organismus dient als fluoreszenzmarkierte "Sonde" eigentliche Sonden (die für verschiedene, bereits identifizierte hierarchische Stufen spezifisch sind) sind auf winzigen Spots einer Glasfläche immobilisiert 1. Immobilisierung der Sonden in geordneter Reihenfolge auf aktivierter Glasfläche (transparent, unporös, nicht-fluoreszierend) immobilisiert Mehrere Sonden für ein Gen angewandt, um Spezifität zu erhöhen (Anteil an nicht-spezifischer Hybridisierung ist höher als bei FISH) In situ Sonden-Produktion auf Glas möglich mit Photolithographischer Maskierung: aktivierte Glasoberfläche mit geschützten OH-Resten wird durch gezielte Laserstrahlen an bestimmten Stellen demaskiert und somit frei für Bindungs-Reaktion mit erstem Nukleotid der Sondensequenz (modifiziert, um kovalente Bindung eingehen zu können). Nukleotid ist selbst auch geschützt für Bindungsreaktion mit darauf folgendem Nukleotid usw. auch andere Bindungsreaktionen zwischen Sonde und Glas angewandt Dichte der Sonden auf Spot muss optimal eingestellt werden, um gute Signale zu erhalten Spacer zwischen Glas und Sonde, um Sonden verschiedener Spots zu trennen durch Erzeugung 10

11 verschiedener Ebenen (durch enge Anordnung nötig) 2. Extrahiertes, unbekanntes RNA- oder DNA-Gemisch aus Umweltprobe wird fluoreszenzmarkiert DNA PCR -> markierte DNA PCR und in vitro Transkription -> markierte RNA RNA RT-PCR -> markierte DNA Direkte Markierung durch chemische Reaktion e Nicht alle Markierungsmethoden sind gleich effizient Fluoreszenzfarben unterscheiden sich in optimaler Dichte Markierungsdichte ist abhängig von Sequenz der RNA/DNA (bei PCR-Markierung nur eine der vier Basen als markiertes Nukleotid zugesetzt) 3. Hybridisierung erfolgt in Hybridisierungsöfen oder Wasserbädern Waschschritt nach Hybridisierung ist stringent e Hybridisierungsbedingungen sind Kompromiss können nicht für jede Sonde optimal sein optimale Situation (DNA bindet an Sonde) konkurriert mit drei verschiedenen unerwünschten Situationen: Sonde bildet Sekundärstruktur aus Sonden bilden untereinander Doppelhelix aus DNA-Einzelstrang bildet Sekundärstruktur Aufteilung der markierten Fragmente in max Nukleotide lange Stücke 4. Detektion für jeden Spot wird Fluoreszenzintensität und Hintergrundrauschen getrennt aufgezeichnet nicht quantifizierbare Ergebnisse: starkes Signal bedeutet nicht unbedingt große Menge an hybridisierter DNA/RNA Interaktionseffekte bei zu nahe bei einander liegenden markierten Nukleotiden (Verringerung der Signalintensität) Ergebnisse variieren bei Anwendung verschiedener Detektionsgeräte (CLS oder Fluoreszenz-Leser) Anwendungen 1. Genexpressions-Analysen Vergleich von verschiedenen Situationen 2. Struktur und Funktion von mikrobiellen Lebensgemeinschaften analysieren Phylogenetic oligonucleotide microarrays (für Phylogenetic community fingerprints) Sonden für monophyletische Gruppen entworfen (mehrere für verschiedene Hierarchiestufen) Kontrolle der Sondenqualität durch Hybridisierung mit Reinkulturen rrna-mischung aus Umweltprobe wird untersucht Functional gene microarrays mrna-mischung von funktionellen Genen wird untersucht Community genome microarrays Gesamte Genome (oder Fragmente davon) werden als Sonden immobilisiert auf Glas 3. Methoden, um gesamte Genomsequenz eines Organismus/einer Umweltprobe zu erhalten Genomanalyse von kultivierbaren Organismen DNA mit Restriktionsenzymen in kleine Stücke schneiden und einzelne Stücke in Vektor einfügen. Vektor wird in E. coli eingebracht und durch Zellteilung vermehrt Größe des Fragments hängt von Vektor ab. große Vektoren können nur in geringer Stückzahl in E. coli eingebracht werden. Dauert lange, um genügend Material für Analyse zu erhalten 11

12 Shotgun sequencing Genom wird in viele kleine Fragmente zerteilt (früher war Zwischenschritt über BAC-Library nötig, um Rechenleistung bewältigbar zu halten) Sequenz wird mittels Bioinformatik wieder errechnet Jede Sequenz wird mindestens zwei- bis dreimal analysiert (Sequenzierungshallen in Fabriken) Ressourcenverschwendung, dennoch heute kostengünstig und schnell (1-2 Tage) Analyse der Sequenz dauert dennoch Jahre Bsp: Sargasso See, Bermudas 1,045 Milliarden bp analysiert Metagenome BAC Libraries 1. Isolierung und Trennung von High molecular weight (HMW) DNA große DNA Fragmente sind schwer erhaltbar, DNA bricht leicht in kleine Fragmente, die man nicht weiter verwenden kann, da Bruchstelle zufällig erfolgte und nicht rekonstruierbar ist ( sheered DNA ) Umweltprobe wird in Agar-Block gegeben, Lyse-Enzymen hinzugefügt (zerstören Zellen) DNA Verdauung mit Restriktions-Enzymen, die an bestimmten Bindungen DNA zerschneiden (zb: A-T Bindungen) Entstandene DNA-Fragmente werden mit PFGE (Pulsed Field gel electrophoresis - kann auch längere Fragmente gut trennen. Prinzip: Elektrisches Feld wird an- und ausgeschalten, Gradient immer um 120 verschoben aufgebaut) aufgetrennt Fragmente sollen kb lang sein Wenn viele Fragmente kleiner sind, muss Konzentration des Lyse-Enzyms neu eingestellt werden 2. Ligation ausgewählte DNA und BAC-Vektor werden ligiert (zusammengefügt) Vorteile von BACs Durch lacz einfach feststellbar, ob E. coli wirklich ein Insert trägt im BAC: LacZ ist ein Gen auf dem BAC, das durch Insertion einer Sequenz zerstört wird. Nur wenn LacZ exprimiert wird, kann E. coli Lactose nutzen und erscheint dadurch blau. Wenn Insert vorhanden, erscheint Zelle weiß, weil Lactose nicht genutzt werden kann. Sequenz des Inserts ist relativ stabil, durch geringe Kopie-Zahl in E. coli Nachteil große Mengen an DNA (können bis zu 500kb-Fragmente aufnehmen) Aufreinigen ist schwierig 3. Electroporation BAC wird in E. coli inseriert Jedes E. coli kann aber aufgrund der Größe des Vektors nur ein BAC tragen 4. Screening der BAC-Library Suche nach bestimmten Gensequenzen (16SrRNA) Oder nach Gensequenzen, die für bestimmte Proteine oder Enzyme kodieren (Bacteriorhodopsin entdeckt) Mit PCR (spezifischer Primer für bestimmtes Gen) oder Membranhybridisierung (radioaktive Sonde für gesuchtes Gen) duchgeführt Heterologe Expression (Expression eines fremden Gens in E. coli) kann auch zur Entdeckung von Genen führen. ZB: Antimikrobielle Wirkung Antibiotikum. Durch Transposons Gen (ORF...open reading frame) identifizierbar, der für Protein kodiert, das antibakterielle Eigenschaften verleiht. Transposons sind Abschnitte, die im Genom herumspringen können. Durch Hineinspringen in einen ORF wird dessen Ablesung verhindert. So viele Klone hergestellt, dass statistisch jedes Gen einmal durch Transposon gestört ist, in BAC-Library -> Identifizierung des Gens durch Analyse des E. coli, das keine antibakteriellen Eigenschaften mehr hat. Welcher Organismus in der Umwelt diese Eigenschaft hat, bleibt bei diesem Ansatz jedoch unbekannt. 12

13 4. Konzepte und Methoden zur funktionellen Analyse von Mikroorganismen in komplexen Umwelt- und med. Proben Funktionsgene amoa...ammonium Monooxigenase (oxidiert Ammonium zu Hydroxylamin) dsra/b...dissimilatorische Sulfitreduktase (anaerobe Reduktion von Sulfat zu Sulfit zur Energiespeicherung) 16SrRNA sagt nichts über Funktion aus daher oft Arten mit verschiedenen Funktionen innerhalb einer Stammbaumverzweigung Stammbaumerrechnung mit Funktionsgenen führt oft zu anderen Verwandtschaftsverhältnissen als mittels Errechnung über 16SrRNA-Daten selbes Prinzip wie bei full-cycle rrna-ansatz e Finden von konservierten Regionen bei Genen, die für Protein/Enzym kodieren sehr schwierig horizontaler/lateraler Gentransfer großer Störfaktor bei Stammbaumberechnung nur potentielle Funktion feststellbar kein Nachweis für Genexpression Microsensors/FISH Physiko-chemische Parameter in Mikrometer-Abständen messbar (Gradienten) Nach Messung wird Probe mit FISH analysiert, um Bakterien zu identifizieren Durchschnittliche Umsatzraten pro Zelle abschätzbar Keine zellgenaue Zuordnung möglich (erschwert Analyse von komplexen Habitaten) Mikrosensoren brechen leicht FISH mit Intergenic spacer-targeted probes Aktivität von MO s nachgewiesen durch Sichtbarmachung von Abstandhaltern zwischen 16S/23S/5SrRNA-Genen im rrna-operon Spacer werden schnell abgebaut, nachdem rrna-transkript in einzelne rrnas geschnitten wurde Nur bei Ablesung des Gens große (detektierbare) Mengen an Spacer in Zelle -> Hinweis auf Aktivität Spacer-Region hat keinen Nutzen Mutationen werden nicht ausgebessert. Verschiedene Stämme unterscheiden sich schon sehr stark in Sequenz. Nur Länge ist konserviert. Sondendesign aufwendig FISH mit BrdU BrdU...Bromodesoxy-Uridin DNA-synthetisierende (aktive) Bakterien durch Zugabe von modifiziertem, Bromhältigen Uridin in Umweltprobe detektierbar: Bromodesoxy-Uridin wird wie normales Thymidin in DNA eingebaut DNA aus Umweltprobe wird extrahiert Immunocapture: DNA-Gemisch wird durch Säule mit Metallkugeln, die Antikörper gegen Bromodesoxyuridin an der Oberfläche haben, geschickt. DNA, die BrdU enthält, wird durch Antikörper markiert DNA mit Metallkugeln kann mit Magnet aus DNA-Mischung herausgezogen werden Analyse der aktiven DNA Identifikation der Organismen 13

14 e Cross-feeding kurze Inkubationszeit Toxische Wirkung von BrdU für manche Bakterien FISH/MAR (Microautoradiography) Inkubation einer Umweltprobe mit radioaktiv-markiertem Substrat Waschen/Fixieren und dünne Schnitte herstellen FISH-Sonden zugeben Hybridisieren mit FISH-Sonden Mit Photoemulsion überschichten radioaktive Zellen verursachen Silberkornbildung Detektion mit Inversem Mikroskop (von oben überdeckt Photoschicht Fluoreszenz-Signale) Röntgenfilm zur Detektion der Silberkörner QMAR...quantitative MAR Zugabe einer Reinkultur, deren Aktivität bekannt ist, um Anzahl der Silberkörner in physiologische Aktivität pro Zelle umrechnen zu können Erstellung einer Eichkurve durch Messung verschiedener Konzentrationen des Substrats Stable isotope probing (SIP) Stabile Isotope eingesetzt, statt radioaktiven Isotopen C 13 -markiertes Substrat zu Umweltprobe gegeben Organismen, die Substrat einbauen, haben schwerere DNA/RNA RNA/DNA-Extraktion CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation trennt RNA/DNA in leichte und schwere Banden (CsCl bildet in einer Lösung Dichtegradient aus, RNA/DNA bleibt in der Zone, die ihrer eigenen Dichte entspricht hängen) Schwere RNA/DNA wird entnommen, PCR von 16SrRNA-Genen wird durchgeführt und Organismen identifiziert Untersuchung von DNA vs. RNA (Vor- und Nachteile) DNA bildet schöne Banden aus RNA ist schneller markiert (nur Stunden an Inkubationszeit, statt Wochen) -> cross-feeding ist kein Um schöne Banden mit RNA zu erhalten RT eingesetzt -> cdna wird zentrifugiert SIP-FISH/MAR Kombination von Stable Isotope Probing mit FISH/MAR Zusätzlich zu C 13 -markiertem Substrat wird selbes Substrat C 14 -markiert angeboten Nach Identifizierung der Organismen mit SIP werden FISH-Sonden für Organismen entworfen FISH/MAR ermöglicht Bildanalyse der aktiven Zellen und ihrer Nachbarn zur Bestätigung der mit SIP erhaltenen Ergebnisse FISH/SIMS SIMS...Secondary Ion Mass Spectrometry (Oberfläche der Probe wird mit Ionenstrahl beschossen Molekülfragmente, Atome usw., die dabei aus der Probe geschleudert werden, werden mit Massenspektrometer analysiert. Sehr empfindliche Methode) Bei kontinuierlicher Analyse des delta C 13 -Wertes entlang einer Probe, kann man Rückschlüsse auf bakterielle Aktivität machen, da Organismen den Einbau von leichteren Isotopen (C 12 ) bevorzugen und sich dadurch das natürliche Isotopenverhältnis innerhalb von Zellen und bei Ausscheidungsprodukten zu Gunsten von C 12 verändert (negativere Delta-C 13 -Werte). Abbauvorgänge beobachtbar: Wenn Produkte 14

15 leichter wurden, biologischer Vorgang als Ursache. In Kombination mit FISH können Organismen identifiziert werden Auch eine Untersuchung durchgeführt, in der vorher markiertes Substrat zugegeben wurde Delta C 13 = 1000 x [C 13 /C 12 Probe C 13 /C 12 Standard] / (C 13 /C 12 Standard) In Promille angegeben C 13 /C 12 Standard...fossiler Kalkstein Methan zum Beispiel eindeutig biologischen Ursprungs Isotope array in Kombination mit Microarray Radioaktives Substrat wird in Umweltprobe eingebracht Organismen, die Substrat nutzen, werden radioaktiv markiert rrna-extraktion Fluoreszenzmarkierung der rrna Untersuchung der rrna-mischung mit Microarray Identifikation von Organismen in Umweltprobe mit Fluoreszenzdetektor Identifikation von Funktion (Stoffwechselwege) bestimmter Organismen durch Detektion der Radioaktivität Marker- und Reportergene Markergene Dienen der Markierung von Einzelzellen, damit man sie in ihrer Umwelt verfolgen kann Markergen hat einen konstitutiven Promotor, der ständige Ablesung des Gens verursacht. Synthetisiertes Markerprotein gibt detektierbares Signal an Umwelt weiter (Protein ist direkt detektierbar oder ein Enzym, das ein bestimmtes, zugegebenes Substrat umsetzt in Signal). Bsp: Verfolgung von markierten Einzelzellen autochthoner Bakterienarten im Klärschlamm Reportergene Ermöglichen die Markierung von Zellen, zu der Zeit, in der sie ein bestimmtes Gen exprimieren Induzierbarer Promotor wird durch Anwesenheit eines bestimmten Analyten angeregt, Genexpression einzuleiten. Exprimiertes Protein gibt wieder Signal. Durch Anhängen eines Reportergens an interessierendes Gen bzw. den Promotor eines interessierenden Gens kann Genaktivität nachgewiesen werden. Immer wenn Gen abgelesen wird, wird auch Reportergen abgelesen. Zum Nachweis von toxischen Substanzen eingesetzt. Green fluorescing Protein (GFP) Herkunft: Qualle (Aequoria victoria) Hat zwei Fluoreszenzfarbstoffe im Ringsystem: Aequorin und Green fluorescing Protein Green fluorescing Protein bekommt Anregungsenergie durch Aequorin GFP hat Beta-Can Struktur; Autokatalyse (selbstausgelöste Ausbildung der chromophoren Struktur) des Proteins in Anwesenheit von Sauerstoff Ende des Proteins ist frei Funktion wird nicht gestört, wenn anderes Genprodukt noch daran hängt. Fluoresziert aber nur in Anwesenheit von Sauerstoff und ist sehr stabil. Instabile Varianten erzeugt für den Nachweis von sich schnell ändernder Genexpression (haben Proteine am Ende angehängt, die Proteasen in der Zelle anzeigen, dass sie Green fluorescing Protein zerstören sollen) Farbvarianten erzeugt, für gleichzeitige Markierung von verschiedenen Zellen Anwendungen Nachweis von TNT Nachweis von Stressprotein-Bildung (Ökotoxikologie) 15

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