Selektivität in der GLC

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1 Selektivität in der GLC Trennung bei unterschiedlicher Löslichkeit in der stationären Phase Da K ~ 1 / (p f) mit K Verteilungskonstante p Dampfdruck f Aktivitätskoeffizient ergibt sich für das Retentionsverhältnis zweier Verbindungen 1 und 2 : ( HERINGTONsche Trennformel) Stationäre Phase unpolar polar Trennung nach Dampfdruck (Siedepunkt) Polarität und Dampfdruck ( gleichsinnige oder gegenläufige Überlagerung)

2 Trennung in der Gaschromatographie unpolare stationäre Phase z.b. Poly(dimethyl)siloxan Trennung nach dem Dampfdruck (Siedepunkt) t R ~ 1/p polare stationäre Phasen z.b. Polyethylenglycol (Carbowax) Trennung nach Polarität und Dampfdruck t R ~ 1/ (p f) geometrieselektive stationäre Phasen z.b. Benton 34, GTCB, Cyclodextrine Trennung nach der Molekülgeometrie

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4 Struktur der -, - und -Cyclodextrine

5 Säulenpolarität und Elutionsreihenfolge Trennung von Benzol und Cyclohexan Kp 80,1 C 80,6 C Stationäre Phase Polysiloxan PEG 100% Methyl 5% Phenyl 7%Ph/ 7% CP OV-1 SB-5 OV-1701 CW20M

6 Säulenpolarität und Elutionsreihenfolge Unpolare stationäre Phase: - Squalan - Methylsilicon ( OV-1) Polare stationäre Phase: - Polysiloxan mit 7 % Phenyl und 7% Cyanopropyl (OV 1701) - Polyethylenglykol (PEG, Wax) Substanz Kp/ C unpol. SP pol. SP Benzol Cyclohexan C 6 H 6 80,1 C 6 H 12 80,6 1. Peak 2. Peak* 2 1 Ethanol 2,2 Dimethylpentan Benzol C 2 H 5 OH C 7 H 16 C 6 H 6 78,5 79,0 80, Chloroform Tetrachlormethan CHCl 3 61,2 CCl 4 76, Methanol Essigsäuremethylester Diethylether CH 3 OH CH 3 COOCH 3 C 2 H 5 OC 2 H *) mit unpolarer SP ist hohe Trennstufenzahl erforderlich

7 Flüssige stationäre Phase (SP) Anforderungen hochsiedende Flüssigkeit gute Benetzung der Oberfläche uniformer, stabiler Film chemisch inert, thermisch stabil unterschiedliches Lösevermögen für trennende Stoffe unpolare stationäre Phase gute Löslichkeit für unpolare Verbindungen hohe Retention und Probekapazität Trennung nach Dampfdruck (Siedepunkten) Geringe Löslichkeit für polare Verbindungen geringe Retention, Fronting steigende Polarität der stationären Phase sinkt Retention von unpolaren Verbindungen steigt Retention von polaren Verbindungen über 80% der Trennungen lassen sich an wenigen Standardphasen realisieren Vielzahl unterschiedlicher Handelsnamen für weitgehend identische Materialien Phasen mit speziellen (maßgeschneiderten) Selektivitäten für bestimmte Trennaufgaben ( PCB s, Dioxine usw.) aber ohne Angabe der chemischen Zusammensetzung

8 Flüssige stationäre Phase Polysiloxan-Gerüst O Si O Si O Anteil an Bezeichnung 2) Methyl Phenyl CP 1) TFP 2) ;100; ,50, ; ; 275 1) CP Cyanopropyl 2) TFP Trifluoropropyl In den modernern Polysiloxanphasen sind die funktionellen Gruppen symmetrisch an ein Siliziumatom gebunden (z.b. Diphenyl, Biscyanopropyl) 3.) In Verbindung mit der betreffenden Firmenbezeichnung (z.b. OV-1, DB-5)

9 Firmenbezeichnung für stationäre Phasen Hersteller von stat. Phasen oder Kapillarsäulen Siloxane Kodierung PEG Agilent Technologies 1. Hewlett Packard 2. J&W HP DB Ultra DB-XLB HP- 20 M InnoWax DB-Wax Alltech AT, Heliflex AT-Wax General Elektric Macherey-Nagel SE,XE MN, Optima Permabond CW 20M Nordion NB NB-20M Ohio Valley OV Carbowax 20M Phenomenex ZB (Zebron) ZB-Wax Quadrex CW Restek Rtx MXT Stabilwax SGE BP,BPX, HT BP 20 Supelco SPB Meridian (MDN) Supelcowax Omegawax Varian (Chrompack) CP SIL CB CP Wax CB

10 Fettsäuremethylester (FAME)

11 Getreide-Fettsäuremethylester-Mischung

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14 Kapillar-Säulen 1. Dünnfilm-Kapillare 2. Dünnschicht-Kapillare gepackte Säule Dünnfilm Kapillarsäule innerer Durchmesser 1-10 mm 0,1-1 mm Länge 1-10 m m Länge bei gleichem Druckabfall 1,8 m 120 m Dünnschicht lineare Geschwindigkeit 6,8 cm/s 9,1 cm/s 13,5 cm/s Vergleich der k-werte Auflösung* 1,53 6,70 3,92 Analysenzeit* 30,2 min 29,1 min 15,5 min Trennstufenzahl < Trennstufenhöhe* 0,71 mm 0,46 mm 0,55 mm Belastbarkeit < 10 l 1 nl nl * für das Stoffpaar Methyloleat/Methylstearat

15 Retentionsindex (nach Kovats) Retentionsindex I x und y: C-Zahlen von n-alkanen mit kürzerer und längerer Retentionszeit als die Substanz A Für den Retentionsindex nach Kovats gelten vier Regeln 1. Retentionsindices setzen sich für beliebige Moleküle additiv aus den Inkrementen für funktionelle Gruppen und für die Art der Bindung zusammen (je CH 2 -Gruppe: Zunahme um 100). 2. Bei Unterschieden in den Siedepunkten zweier Isomerer ist der Unterschied zwischen ihren Retentionsindices an einer apolaren stationären Phase fünfmal der Siedepunktsdifferenz. 3. Retentionsindex einer apolaren Verbindung bleibt für beliebige stationäre Phasen nahezu konstant. 4. Funktionelle Gruppen und andere Bindungen als Einfachbindungen gehen in Form von Indexinkrementen in den Retentionsindex ein. Erlaubt keine Angaben über die Trennbarkeit von Substanzen

16 Voraussage der Trennmöglichkeit Für die Selektivität sind folgende vier Kräfte von Bedeutung: 1. London-Kräfte zwischenmolekulare Kräfte zwischen zwei nicht polaren Stoffen 2. Kesson-Kräfte Orientierungskräfte aus dem Zusammenwirken permanenter Dipole (z.b. H-Brückenbindung) 3. Debye-Kräfte induzierte Dipole 4. Chemische Bindungskräfte z.b. charge-transfer-komplexbindungen Mit zunehmender Summe aller dieser Kräfte nimmt auch die Retentionszeit eines Stoffes zu Berücksichtigung dieser Kräfte liegt den Rohrschneider- Konstanten zugrunde: zur Charakterisierung gas-chromatographischer Trennflüssigkeiten zur Vorausberechnung von Retentionsdaten beliebiger Stoffe auf beliebigen Trennflüssigkeiten

17 Verfahren nach Rohrschneider erlaubt die Charakterisierung von Trennflüssigkeiten ermöglicht die Berechnung von Retentionsdaten beliebiger Stoffe auf beliebigen Trennflüssigkeiten Grundlagen Additivität zwischenmolekularer Kräfte Angabe der Retentionswerte in Form von Retentionsindex- Differenzen Beziehung aller Werte auf eine unpolare Standardsäule Standardsubstanzen Benzol, Ethanol, Butanon, Nitromethan und Pyridin Betrachtet wird die Retentionsindexdifferenz I (Bezug auf unpolare Trennflüssigkeit) substanzspezifische Konstanten a (Benzol), b (Ethanol), c (Butanon), d (Nitromethan) und e (Pyridin) jede Substanz und jede Trennflüssigkeit durch 5 Konstanten charakterisiert I RX = a RX x p + b RX y p + c RX z p + d RX u p + e RX s p x,y,z,u,s Rohrschneider-Konstanten, säulen(trennflüssigkeits)-spezifische Faktoren Definition Die jeweiligen Konstanten der Standardsubstanzen werden für jede stationäre Flüssigkeit gleich 100 gesetzt (z.b. I für Benzol für jede gleich 100 x p )

18 Rohrschneider-Konstanten: Praktisches Beispiel Problem: Trennung von 1- und 2-Propanol Welches ist die beste Trennflüssigkeit? Stoffspezifische Konstanten Konstanten a b c d e 1-Propanol -9,42 106,26 0,25 6,63-7,49 2-Propanol -18,15 95,89 15,76-6,53 2,09 Rohrschneider-Konstanten x y z u s 1. Polyphenylether a 1,75 2,27 2,34 3,26 2,84 2. Quadrol b 2,00 5,62 3,47 4,94 4,15 3. O-(2-Cyanethyl)-sucrose 5,40 8,71 7,34 10,4 8 8,69 4. Silicon XE-60 2,08 3,85 3,62 5,13 3,45 a Bis(4-phenoxyphenoxy)benzol, b N,N,N,N -Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylendiamin Trennflüssigkeiten Propanol 207,4 533,7 852,4 362,2 1-Propanol 223,4 575,3 872,4 394,7 Differenz 16,0 41,6 19,6 32,5 Optimale Trennung mit Quadrol

19 Gas-Fest-Chromatographie (GSC) (gas-solid-chromatography; Adsorptions-GC) Adsorbentien Kohlenstoffadsorbentien Graphitierte Ruße Kohlenstoff-Molekularsiebe Aluminiumoxid Zeolithe Poröse organische Poymere Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymere Oberflächenmodifizierte Adsorbentien (GLSC) Säulen gepackte Säulen Dünnschicht-Kapillarsäulen (PLOT-Säulen, porous layer open tubular) Besonderheiten geringe Substanzbelastbarkeit T Säule > Siedepunkt Anwendungen Analyse von Gasen, leichtflüchtigen und niedermolekularen Verbindungen Isomerentrennung Spurenanalyse

20 Typische GC-Kapillarsäulen WCOT wall-coated open tubular (column) dünner Film auf der Innenwand SCOT support-coated open tubular (column) inertes Trägermaterial das mit stationärer Phase imprägniert ist höherer Anteil an stationärer Phase daher höhere Probenkapazität aber niedrigere Effizienz as WCOT und höhere Effizienz als gepackte Säule FSOT Fused silica open tubular (column) Quarzkapillare Außenwand mit Polyimid-Beschichtung sehr flexibel, können als Spule eingesetzt werden typischer ID von 320 oder 200 m

21 PLOT-Säulen Stationäre Phase Dünne Schicht eines feinkörnigen Adsorbens an der Innenwand Molekularsieb 4,5, 10 oder 13 Å (Ionenaustauscher) Aluminiumoxid (nach Desaktivierung mit KCI oder Na 2 SO 4 ) Kohlenstoff-Molekularsieb Poröse Polymere, z.b. Copolymere aus Styrol - Divinylbenzol (DVB) DVB - Vinylpyridin DVB - Ethylenglycol - Dimethacrylat Dimensionen Länge 5 bis 50 m Innendurchmesser 530, 320 oder 250 m Schichtdicke 5 bis 50 m Partikeldurchmesser < 1 m Material Fused Silica (FS) oder Metall Anwendungen Permanentgase, anorganische und organische Gase Leichtflüchtige Kohlenwasserstoffe ( C 1 -C 10 ) Leichtflüchtige polare organische Verbindungen (Alkohole, Glykole, Alkylamine) Besonderheiten Trennung an Al 2 O 3 wird stark durch Feuchtigkeit beeinflusst (Retentionszeitverschiebungen) Überladung zeigt sich durch Tailing (WCOT: Fronting) Partikelfalle zur Vermeidung von Detektor-Störungen (Verstopfungen, Spikes) infolge abgelöster Partikel: kurze Nachsäule mit niedrigviskoser flüssiger Polymerphase

22 Molekularsiebe Beispiel: 2 m lange mit 5 Å-Material gepackte Säule Gemisch aus Helium, Sauerstoff, Stickstoff, Methan und Kohlenmonoxid wird in dieser Reihenfolge getrennt Moleküle, die kleiner sind dringen in das Innere der Partikel ein, wo dann die Adsorption stattfindet Typische GC-Trennungen an festen Phasen a: 1,5 m lang, ID = 0,3 cm, Molekularsieb b: 30 m lang, ID = 0,53 mm

23 Säulentemperatur und Retention Temperaturabhängigkeit des Retentionsfaktors k H V T C R C,a Molare Verdampfungswärme Säulentemperatur Gaskonstante Phasenverhältnis Konstanten Anwendung der Trouton schen Regel T b Siedetemperatur der Substanz (in K) E t Trouton sche Konstante (Molare Verdampfungsentropie: J/mol) Welche Temperaturerhöhung ist zur Halbierung von k erforderlich? T K Eine Erhöhung der Säulentemperatur um C bewirkt eine Halbierung von k

24 Isotherm (T C = const.) Säulentemperatur T C für Gemische mit nicht zu großem Siedebereich ( K P <100 K) GLC: T C < K P der Komponenten Ausnahme: Säulen mit sehr dicken Filme In t R ~ 1/T C Optimierung zw. Analysezeit und Auflösung GSC: T C > K P der Komponenten Temperaturprogrammierte GC (TPGC) für Gemische mit großem Siedebereich ( K p > 100 K) ist isotherme GC nicht zur Trennung aller Komponenten geeignet: Entweder nur Trennung der niedrigsiedenden oder der hochsiedenden Komponenten Dosierung der Probe bei niedriger Säulentemperatur T 0 ( gute Auflösung der niedrigsiedenden Komponenten) anschließend Erhöhung der Säulentemperatur meist lineares Temperaturprogramm Retentions- oder Elutionstemperatur T t T t = T 0 + r t r t Heizrate Aufheizzeit

25 Säulentemperatur in der GC Isotherme GC (konstante Säulentemperatur) Geeignet für Gemische mit nicht zu großem Siedebereich ( Kp < 100 K) Gemische mit großem Siedebereich Trennung aller Komponenten mit Isothermer GC nicht möglich Niedrige Säulentemperatur gute Trennung der niedrigsiedenden Komponenten aber hohe Retentionszeiten und breite Peaks für höhersiedende Komponenten

26 Hohe Säulentemperatur akzeptable Trennung und Peakform der höhersiedenden Komponenten aber zu geringe Retention und Trennung der niedriger siedenden Komponenten Temperaturprogrammierte GC (TPGC) Injektion der Probe bei niedriger Säulentemperatur Erhöhung der Säulentemperatur während der Trennung

27 Bedingungen der TPGC Anfangstemperatur T gute Auflösung der niedrigsiedenden Komponenten und Abtrennung vom Lösungsmittel-Peak gegebenenfalls isotherme Vorlaufzeit günstig spezielle Forderungen bei splitless-, on-column-dosierung und Thermodesorption zur Refokussierung der Substanzzonen am Säulenanfang Heizrate r und Aufheizzeit t Lineares Temperaturprogramm: T t =T 0 +r t T Retentions- oder Elutionstemperatur Optimum (Kompromiss) zwischen Analysenzeit, Peakform und Auflösung finden Faustregel: r 12 K/t M (Giddings) Je länger die Säule, umso geringer die Heizrate Mehrstufige und nicht-lineare Temperaturprogramme möglich Endtemperatur T E Akzeptable Elution und Auflösung der hochsiedenden Komponenten Gegebenenfalls isotherme mit Endtemperatur (isotherme Nachlaufzeit) Theorie der TPGC nicht sehr kompliziert, aber wenig praktikabel optimale Trennbedingungen werden experimentell in Testläufen ermittelt (Optimierungsprogramme)

28 Qualitative Analyse Identifizierung der getrennten Komponenten Ziele der Identifizierung Wiedererkennung ( Wiederfindung, recognition) von Verbindungen zielgerichtete Suche nach ausgewählten Verbindungen in der Probe (target analysis) Prüfung auf An-/Abwesenheit, Grenzwertkontrolle Vergleich der Retentionswerte mit Referenzverbindungen Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen Strukturaufklärung der Inhaltsstoffe in unbekannten Proben (non-target analysis) Kopplung mit spektroskopischen Methoden Feststellung der Identität oder Ähnlichkeit komplexer Gemische Vergleich der Peakmuster (Position und Intensität der Peaks) ohne Identifizierung der Einzelverbindungen ( Fingerprint-Analyse ) Erkennung der biologischen Aktivität Einbeziehung von Wirkungstests z.b. Enzymreaktionen

29 Identifizierung einzelner Komponenten mittels GC Vergleich von Retentionswerten Addition von Vergleichssubstanzen bzw. Retentionszeitvergleich Vergleich der gemessenen mit tabellierten Retentionswerten Relative Retention Retentionsindices (isotherm, temperaturprogrammiert) Struktur-Retentions-Beziehungen Ableitung von Retentionsinkrementen Vorhersage der Elutionsreihenfolge Abschätzung von Retentionswerten Selektive Detektion Elementspezifische Detektoren Reaktionen vor bzw. nach der Säule Derivatisierung (pre-column, post-column) selektive Abbaureaktionen Kopplungstechniken Direkte Kopplung der GC ( on-line coupling ) mit spektroskopischen Methoden Fouriertransform-Infrarotspektroskopie (GC-FTIR) Atomemissionsspektroskopie (GC-AES) Massenspektrometrie (GC-MS)

30 Retentionsdaten zur Identifizierung Retentionszeiten t R Aufenthaltszeit in der stationären Phase Systemeigenschaft (Verteilungsgleichgewicht) Struktur der Substanz Struktur der stationären Phase Säulentemperatur Hängt auch von Säulenparametern und Messbedingungen ab Eignet sich zur Charakterisierung der Substanz nur wenn folgende Parameter konstant gehalten werden: Art und Menge der stationären Phase Säulentemperatur Länge und ID der Säule Filmdicke Art (Viskosität) des Trägergases Vordruck und Gasfluss Vergleich der Analysenergebnisse sehr schwierig

31 Absolute Retentionswerte Eliminierung verschiedener Einflussgrößen Bezug auf standardisierte Bedingungen Spezifisches Retentionsvolumen V g T bei Säulentemperatur T [ml/g] (isotherme GC) j Kompressibilitäts-Korrekturfaktor (abhängig von p i /p 0 ) p i, p 0 Säuleneingangs- und Säulenausgangsdruck (absolut) F Gasfluss am Säulenausgang bei Säulentemperatur T Masse der (wirksamen) stationären Phase in der Säule w L GSC: absolutes Retentionsvolumen V s V s = V g /s s: spezifische Oberfläche Relative Retentionswerte Bezug der Retention auf Standardsubstanzen (identische chromatographische Bedigungen) Relative Retentionswerte lassen sich einfacher und reproduzierbarer bestimmen als absolute Retentionswerte Unterschiedliche Referenzsubstanzen möglich z.b. Retentionsindexkonzept nach Kovats

32 Kopplungstechniken Direkte Kombination zweier (verschiedener) Analysenmethoden on-line Kopplung (direkte Verbindung) off-line Kopplung (Transfer) Beispiele Gaschromatographie mit Gaschromatographie GC-GC on-line Massenspektrometrie GC-MS on-line Infrarotspektroskopie GC-IR on-line Kernresonanzspektroskopie GC-NMR off-line Dünnschichtchromatographie GC-DC on-line Flüssigkeitschromatographie mit Flüssigkeitschromatographie LC-LC Massenspektrometrie LC-MS on-line, off-line Infrarotspektroskopie LC-IR on-line Kernresonanzspektroskopie LC-NMR off-line Dünnschichtchromatographie LC-DC on-line Atomabsorptionsspektroskopie LC-AAS on-line

33 Georg Schwedt, Chromatographische Trennmethoden

34 Georg Schwedt, Chromatographische Trennmethoden

35 Georg Schwedt, Chromatographische Trennmethoden Kopplung von GC und DC zur Trennung von Steroiden: kontinuierliche lineare Bewegung der DC-Platte vom vom Start in Richtung GC. 1. GC (b) und 2. DC (a)

36 GC-MS-Kopplung MS= Massenspektrometrie (Massenspektrometer) MS als universeller oder massenselektiver Detektor Kopplung Eluat der GC wird kontinuierlich in die Ionenquelle des MS eingeleitet Kapillar-GC wegen geringem Gasfluss (Hochvakuum im MS) oder Flusssplit vor MS-Quelle MS Erzeugung und Trennung von Ionen in der Gasphase nach dem Verhältnis Masse/Ladung (m/z) Ionisierung: meist durch Elektronenstoß (El) Massenanalysatoren Quadrupol oder Ionenfalle nur Ionen mit bestimmten m/z Verhältnis gelangen auf stabilen Bahnen zum Detektor Massenspektren durch scannen eines m/z-bereichs können auch komplexe oder unbekannte Proben analysiert werden Fragmentierung (Zerfall) der Molekülionen enthält Informationen über seine Struktur

37 MS als universeller Detektor nur ionisierbare Verbindungen können erfasst werden kontinuierliche Masseninformation innerhalb des eingestellten Massenbereichs variable Scanzeit (bis zu 10 Hz) Addition der Intensität aller Signale im aufgenommenen m/z- Bereich ergibt ein Totalionenstrom-Chromatogramm (TIC) Identifizierung einer Verbindung über m/z der Molekülionenen und Fragmentionen (Spektrenbibliotheken) Strukturaufklärung MS als massenselektiver Detektor Registrierung des Chromatogramms nur für eine oder einige wenige charakteristische Massenzahlen Im Chromatogramm werden nur die Verbindungen registriert, deren Massenspektren die eingestellten m/z-werte aufweisen Single-Ion-Monitoring (SIM-Modus) Suche nach bestimmten Strukturen (target analysis) Vorteile der GC/MS-Kopplung beide Methoden sind kompatibel Gleicher Aggregatzustand, geringer Substanzbedarf, schnelle Registrierung der Massenspektren Hoher Informationsgehalt der Massenspektren Spektrenbibliotheken

38 Quantitative Analyse Hängt von der Art des Chromatogramms ab 1. Inneres Chromatogramm Dünnschicht- und Papierchromatographie Auswertung: photometrisch, fluorimetrisch, radiometrisch auf der Trennstrecke oder nach der Elution der Substanz A. Vergleichsmethode Fleckengröße ermitteln halbquantitative Bestimmungsmethode lineare Beziehung: F: Fleckenfläche M: aufgetragene Substanzmenge a,b individuelle Konstanten (abhängig vom chromat. System) Vergleich bzw. Interpolation mit Werten bekannter Substanzmengen B. Optische und radiometrische Methoden kontinuierliche Messung der Absorption, Fluoreszenz oder Radioaktivität in Abhängigkeit vom Ort z.b. Platte an einer Photozelle vorbeiführen höchste Konzentration im Flecken-Mittelpunkt, am Rand die geringste innere Chromatogramme werden dadurch wie äußere Chromatogramme mit Verteilungsbanden dargestellt

39 Photometrische Messungen Transmissionsmessungen: entspricht einer photometrischen Messung in Lösung aber: Sorbensschicht streut Messlicht daher: Lambert-Beersches Gesetz nicht gültig Eichkurve erstellen Remissionsmessungen: Veränderung der diffusen Lichtstreuung (Remission) auf dem Plattengrund durch Substanzflecken durch Absorption Erfasst werden können: gefärbte Substanzen Substanzen, die die Untergrundfluoreszenz des Trägermaterials schwächen Substanzen mit Eigenfluoreszenz Substanzen die mit geeigneten Reagenzien in gefärbte oder fluoreszierende Derivate überführt werden können radioaktiv-markierte Verbindungen C. Bestimmung nach der Elution Substanzen mit UV-Licht detektiert Spot auskratzen und Probe herauslösen Quantitative Analyse mit beliebigen Methoden möglich sehr genaue Ergebnisse

40 Äußeres Chromatogramm Peakfläche ~ Menge einer Komponente Ermittlung der Peakfläche Umrechnung der Peakfläche in eine Konzentration Vermeidung bzw. Minimierung der Fehlerquellen in allen Arbeitsschritten einer Analyse: Probenahme, Probenvorbereitung, Dosierung, Trennung, Auswertung Ermittlung der Peakfläche Fläche unter der Gauss-Kurve kann durch Integration der berechnet werden: mit 1. Näherungsmethode Höhe mal Breite in halber Höhe Grundlage: näherungsweise Ausmessung der Gauss-Kurve durch ein Dreieck Berechnete Fläche 6% kleiner als die korrekte Fläche

41 2. Näherungsmethode: Höhe mal Gesamtretentionszeit t R Grundlage: Zwischen der Gesamtretentionszeit t R und und der Peakbreite in halber Höhe wh besteht ein fast linearer Zusammenhang t R = a b 0,5 Konstante a nimmt mit zunehmender RT zu gut geeignet für dicht nebeneinander liegende Peaks ungenügend getrennte Peaks 3. Methode nach Condal-Bosch Zur Auswertung unsymmetrischer Peaks und bei starkem Tailing Gauss: F I =h w h Beispiel h = 60 mm w h = 21 mm w 0,15 = 41 mm w 0,85 = 10 mm F I = 1260 mm²; F II = 1530 mm² 90er Jahre: heute: Integrator Computer

42 Reproduzierbarkeit der Auswertung Chromatographie relative Standardabweichung Gas-Chromatographie 0,1% Dünnschicht-Chromatographie a) Elution 2-5% b) photometrisch: Absorption 1-3% Fluoreszenz 1-2% Säulen-Chromatographie (HPLC) 0,2-0,5 %

43 Standardsubstanzen Externer Standard Herstellung von Kalibrierlösung mit der zu bestimmenden Substanz Chromatographie der zu bestimmenden Substanz in verschiedenen Mengen Ermittlung eines Kalibrierfaktors bzw. einer Kalibriergerade Analyse der Probe unter gleichen experimentellen Bedingungen Interner Standard Definierte Zugabe eines internen Standards zur Probe- und Kalibrierlösung Standardsubstanz darf nicht in der Probe enthalten sein Chromatographie von Standard und Probe Vergleich von Signalverhältnis und Mengenverhältnis Standardaddition Chromatographie der Probe Definierte Zugabe einer bekannten Menge der zu bestimmenden Substanz der Probe Analyse und Vergleich der Peakfläche mit der Substanzmenge Abhängigkeit des Detektorsignals von Stoffeigenschaften beachten (linearer Messbereich)