Einführung in die Mikrobielle Ökologie

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1 Einführung in die Mikrobielle Ökologie 3 Artenvielfalt Who is there? How many? What are they doing? 1

2 Bakterien im obersten Zentimeter von Sandwatt Isolates Sediment depth (mm) Isolates Vergleich von amplifizierten 16 S rrna-banden von Reinkulturen und Sediment (0-10 mm) aus Schiermonnikoog durch DGGE Elze Wieringa Reinkultur -> Vereinzelung von Zellen -> Kolonien mehrfach erneut ausstreichen -> Reinkultur = Abkömmlinge einer Zelle = Klon (mit Stammbezeichnung) Cyanobakterien- und Algenkulturen oft nicht axenisch, d.h. sie enthalten Begleitbakterien 2

3 Mit wem haben wir es eigentlich zu tun? Systematik, Taxonomie Ziel: System mit Übereinstimmung zur natürlichen Verwandtschaft, der Phylogenie vgl. Stamm bei Tieren Was ist eine Art? Bei sexueller Fortpflanzung: Fortpflanzungemeinschaft, die fruchtbare Nachkommen erzeugt Bei Prokaryoten: Art anhand von diversen Merkmalen operationell definiert, heute zunehmend auf der Basis der 16 S rrna 3

4 Taxonomie Taxonomie ist ein wichtiger Bestandteil der 'Autökologie' der Organismen Sollwerte für die Übereinstimmung innerhalb einer Art 95 % 70 % 98 % Charakterisierung von Reinkulturen Physiologische Eigenschaften von Bakterien aus dem Stechlin-See (Henrik Sass) 4

5 DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Artenvielfalt Wann wurde der Elefant entdeckt? 5

6 Wieviele Prokaryoten-Arten gibt es? Prokaryoten Eukaryoten Beschrieben (2008): ~ Mio Geschätzt (2008): Millionen Mio Anzahl der Arten in 30 g Waldboden (Reassoziationskinetik von DNA) Torsvik V, Goksoyr J, Daae FL (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl. Env. Microbiol. 56: Dykhuizen DE (1998) Santa Rosalia revisited: Why are there so many species of bacteria? Antonie van Leeuwenhoek 73: : Sequenzen der 16 S-rRNA bestimmt Einige Arten global verbreitet, sehr viele sehr selten: Rare Biosphere (Analyse durch Pyrosequencing, s.u.) (Microbial diversity in the deep sea and the underexplored "rare biosphere", Sogin et al., PNAS 2006) Wann wurde das größte Bakterium der Welt entdeckt? 6

7 Mundschleimhautzelle einer gesunden Oldenburger Studentin - Oberfläche 7

8 Das am besten untersuchte Molekül der Welt Struktur der 16 S-rRNA zweidimensional Eignung der ribosomalen RNA für phylogenetische Analysen Ribosomen in jeder Zelle vorhanden (bis zu ), Einsatz von RNA-Sonden (Fluoreszenz-in situ-hybridisierung, FISH) Gen für rrna (rdna) 1x (manchmal mehrfach) vorhanden Elementare komplizierte Funktion erlaubt kaum grundlegende Mutationen. Andererseits wird durch einen Basenaustausch nicht eine Aminosäure eine Proteins verändert RNA lang genug für ausreichend Variationsmöglichkeiten, streng konservierte, variable und hypervariable Bereiche, erlaubt Analyse und Sondeneinsatz für weitläufig und näher verwandte Arten (diverse andere 'Fingerprint'-Techniken für sehr eng Verwandte) Langsame Evolution 'Molekulares Chronometer', je weniger Sequenzübereinstimmung, desto früher getrennte Entwicklung 8

9 Phylogenetischer Stammbaum aller Lebewesen Wikipedia Prinzip der Polymerase Chain Reaction DNA-Doppelstrang 94 C Denaturierung - Schmelzen der DNA C Annealing - Primeranlagerung Kary B. Mullis, C Elongation - Kettenverlängerung n 9

10 Ökologie? DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Nukleotid-Methode nach Sanger 10

11 PCR PCR-Maschine (Thermocycler) DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Nukleotid-Methode 11

12 Ökologie? Naive Fragen zu stellen ist überhaupt eine der erfolgreichsten Methoden voranzukommen. Craig Venter The man who led the private-sector effort to sequence the human genome is seeking exclusive commercial rights to the bare essentials for life in the hope of one day creating a living organism from scratch. It is not Craig Venter's first brush with controversy. His company Celera raced publicly-funded researchers to sequence the human genome. Now his research institute is trying to patent a "minimal genome", which could be used to make synthetic life forms Martin A. Schwartz The importance of stupidity in scientific research Journal of Cell Science 121, 1771 (2008) Synthetische Biologie Biochemische Systeme in Lebewesen integrieren - Hefe - Biotransformation: Spez. Umsetzung mit Hilfe von Organismen - Klonieren - Überproduktion, z.b. Labferment, Insulin - Minimalorganismus: Mycoplasma laboratorium - Organismus mit gewünschten Stoffwechselfähigkeiten designen Anti-Ökologie Vergl. Gentest für Arbeitnehmer und Ungeborene 12

13 Analyse von Umweltproben basierend auf rrna Statt zu klonieren kann man oft auch mit PCR amplifizieren Molekularbiologische Ansätze (Auswahl) 16 S-rRNA: Ribosomen (DGGE, FISH = Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung, CARF-FISH) oder Gen der rrna (-> PCR, evtl. nach Umsetzung mit reverser Transkriptase) Gene, die Schlüsselenzyme codieren: z.b. Sulfitreduktase von Sulfatreduzierern, Ammonium- Monooxygenase von Nitrifikanten etc. Metagenomik: Analyse des gesamten Genoms von einem Standort und Suche nach Schlüsselgenen und deren Nachbarn Messenger-RNA als Indikator für aktuell gebildete Enzyme Kombination mit Aktivitätsindikatoren: z.b. Stable-Isotope-Probing, Autoradiographie, NanoSIMS [s.u.] 13

14 Denaturierende Gradienten-Gel-Elektrophorese, DGGE Isolates Sediment depth (mm) Isolates Vergleich von amplifizierten 16 S rrna-banden von Reinkulturen und Sediment (0-10 mm) aus Schiermonnikoog durch DGGE Elze Wieringa DGGE trennt nach Unterschieden der Sequenz, ohne dass man die kennen muss DGGE TGGE nutzt thermischen Gradienten zum Denaturieren der DNA 14

15 FISH Fluoreszenzin situ- Hybridisierung Nevskia ramosa Anaerobes Methan-oxidierendes Konsortium aus methanogenen Archaeen (rot) und Sulfatreduzierenden Bakterien (grün) Boetius, A. et al.( 2000) A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature 407: FISH Fluoreszenz-in situ-hybridisierung 15

16 CARD-FISH Catalyzed Reporter Deposition- Fluorescence in situ Hybridisation HRP: Peroxidase aus Meerrettich Viele Tyramid-Moleküle fluoreszieren nach Reaktion mit HRP 1000-fache erhöhte Empfindlichkeit bei schwach leuchtenden Bakterien Pernthaler et al. (2002) Appl Environ Microbiol 16

17 NanoSIMS Dr. Peter Hoppe vom Mainzer Max-Planck-Institut für Chemie vor der Nanosims-Ionenmikrosonde, einem neuartigen Sekundärionenmassenspektrometer. Kombination von Identifizierung (Fluor-markierte RNA-Sonde) und Aktivitätsindikatoren ( 13 C- oder 15 N- markierte Substrate) bei einzelnen Zellen Die Bilder aus dem Nano- SIMS zeigen einzelne Zellen und ihre Stickstoff- und Kohlenstoffaufnahme. Hier eine Zelle von Chromatium okenii. Quelle: Niculina Musat, MPI Bremen 17

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