Molekulare Ökologie/ Populationsgenetik. SoSe 2009

Transkript

1 Molekulare Ökologie/ Populationsgenetik SoSe 2009

2 Hinweise zum Praktikum

3 Formales Tagesablauf Gruppenaufteilung, Teilnahmeliste Sicherheitsbelehrung Laborverantwortliche Protokollbögen Labortagebuch Hinweise zur Auswertung, Bewertung Literatur

4 Themen

5 Molekulare Ökologie: Themen Molekulare Identifikation: Arten, Individuen, Geschlecht, DNA- Barcoding Verhaltensbiologie: Fortpflanzungserfolg, Elternschaft, Nahrungswahl, Ausbreitung Populationsgenetik: Populationsgröße, Populationsstruktur, Fragmentierung, Wachstum, Mortalität, Migration Phylogeographie: Verbreitungsgeschichte, Verbreitungsgebiet, Hybridisierung, Herkunftsbestimmung Genetik im Artenschutz: genetische Diversität, Inzuchtdepression, Auszuchtdepression, Warenkontrolle Genetische Ökotoxikologie: Umweltselektion, Anpassung, Bioindikation Genetische Mikrobiologie: mikrobielle Gemeinschaften, Identifikation von Arten Genetisch modifizierte Organismen: Vertikaler Gentransfer, Horizontaler Gentransfer

6 Genetik im Artenschutz (Conservation Genetics): Zielsetzungen Reduzierung des Aussterberisikos durch Reduzierung von Inzucht und Verlust genetischer Diversität Identifikation von Risikopopulationen Beschreibung der Struktur einer Population Klärung des taxonomischen Status Ableitung von Managementeinheiten Entdeckung von Hybridisierungen Nicht-invasive Beprobung Beschreibung geeigneter Wiederansiedlungsgebiete Auswahl geeigneten Besatzmaterials Identifikation einer Art anhand geringer Probenmengen Besseres Verständnis der Biologie einer Art (Populationsgröße, Geschlechterverhältnis, Paarungssystem, Ausbreitung...)

7 Taxonomic uncertainties Evolutionary genetics Introgression Understanding species biology Forensics Conservation Genetics Small populations population structure/ fragmentation Outbreeding Inbreeding Loss of genetic diversity Mutational accumulation Reproductive fitness Genetic management Extinction Identify management unit wild reintroduction captive Genetic adaptation to captivity Nach Frankham et al. 2003

8 Nein Ist die Taxonomie eindeutig? Ja Genetischer Vergleich der Populationen Chromosomen in identischer Zahl und Form? Nein Ja vermutlich eine Art Unterschiede zwischen Populationen? Ja unterschiedliche Art Nein Ist Introgression ein Problem? Unterschiede innerhalb Populationen? Ja Nein Unbekannt Nein Ja Polymorphismen innerhalb Art Einsatz genetischer Marker Einsatz weiterer Marker Nach Frankham et al. 2003

9 Nein Ist die Taxonomie eindeutig? Ja Kleine Population? Ja Nein Probleme durch Inzucht oder geringe genetische Diversität? Ja Population zur Kreuzung vorhanden? Ja Nein Fragmentierung der Population? Nein Populationstruktur? Ausreichender Genfluß? Ja Nein Unbekannt Nach Frankham et al Einsatz genetischer Marker

10 Sind bei der Art alle relevanten Aspekte der Biologie bekannt? Unterliegt die Art illegaler Jagd oder Handel? Ja Nein Abstammung? ja nein Paarungssystem? ja nein Genfluss? ja nein Populationsgröße? ja nein Bottlenecks? ja nein Falls nein, können genetische Marker hierzu Informationen liefern? Falls ja, können genetische Marker genutzt werden, um diese zu entdecken? Nach Frankham et al. 2003

11 Organisation der DNA

12 Art DNA im Zellkern Größe des Genoms [bp] Chromosomen Hefe 14 x Fadenwurm 80 x Taufliege 165 x Krallenfrosch 3000 x Maus 3000 x Mensch 3000 x Mais 5000 x Zwiebel x Knippers 1997

13 Vergleich Prokaryoten / Eukaryoten Arten Organisation der DNA Mitochondrien, (Chloroplasten) Endoplasmatisches Reticulum Prokaryot Bakterien, blaugrüne Algen als dichtes Knäuel in der Zelle (Nucleoid) nicht vorhanden nicht vorhanden Eukaryot Tiere, Pflanzen, Pilze, Protisten im Zellkern eingeschlossen, Protein-DNA-Komplex (Chromatin) vorhanden vorhanden

14 Organisation des Eukaryoten-Genoms Gene Kodierungssequenzen (Exons) Nichtkodiderungssequenzen (Introns) Repetitive DNA-Elemente Satelliten-DNA Centromer-DNA Telomer-DNA Minisatelliten Mikrosatelliten andere repetitive Elemete SINE-DNA (short interspersed repetitive elements) LINE-DNA (long interspersed repetitive elements)

15 Organisation des Eukaryoten-Genoms Minisatelliten: Kopien von DNA-Abschnitten aus Basenpaaren (bp) Mikrosatelliten: 10 bis 50 Kopien von einfachen Sequenzen aus 2 bis 4 bp SINE-DNA (short interspersed repetitive elements): Abschnitte von 100 bis 500 bp LINE-DNA (long interspersed repetitive elements): 6000 bis 7000 bp

16 Alu-Element-Polymorphismus PV92 Alu-Elements: Short INterspersed Elements (SINE) Erkennungsstelle für Alu Transposon / jumping gene (Alu mrna DNA Insertion) Nur bei höheren Primaten (Entstehung vor 60. Mio. Jahren) ) PV92: für Menschen spez. Insertion eines Alu-Elements auf Chromosom 16 2 Allele (715 bp = + Allel; 415 bp = - Allel)

17 Alu-Element PV92 Interview mit Prof. Dr. Lynn Jorde, Eccles Institute of Human Genetics, Utah: Vererbung von Alu-Elementen und Verwendung im Studium der menschlichen Abstammung Hinweise auf fortlaufende Insertionen und Entstehungsrate

18 DNA-Code?

19 Wobble-Hypothese (engl. to wobble = wackeln, schaukeln, schwanken) durch Kombination der vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) bzw. Uracil (U) lassen sich 64 verschiedene Tripletts bilden Drei Tripletts werden als Stopp-Signal interpretiert, die übrigen 61 codieren Aminosäuren da nur 21 Aminosäuren (einschließlich Selenocystein) vorkommen, kann eine Aminosäure durch verschiedene Codon-Tripletts (Synonyma) codiert werden: Arginin, Leucin 6 synonyme Tripletts übrigen Aminosäuren 4, 2 oder eins (Methionin) (Wikipedia)

20 Wobbles in der Primersequenz R = A+G Y = C+T M = A+C K = G+T S = G+C W = A+T H = A+T+C B = G+T+C D = G+A+T V = G+A+C N = G+A+T+C

21 Fragestellung 1: Wo sind die Ursprünge des modernen Menschen?

22 Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen Vertreter der Art Homo erectus wanderten vor 1,5 Mill. aus Afrika aus und bildeten Populationen in Europa und angrenzenden Gebieten ( Homo neanderthalensis). Jüngste Funde sind ca Jahre alt bis Jahre alte Fossilfunde des modernen Menschen Homo sapiens sind aus Afrika, Europa und Asien bekannt.

23 Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen Theorie 1 - Multiregionale (polyphyletische) Abstammung: Der moderne Mensch entwickelte sich aus den regionalen Populationen des Homo erectus. Theorie 2 Monophyletische (Out-of-Africa) Abstammung: Der moderne Mensch entwickelte sich in Afrika, erreichte von dort die übrigen Kontinente und verdrängte Homo erectus.

24 Methoden DNA-Extraktion mit Chelex Elektrophoretischer Nachweis des Alu-Element- Polymorphismus PV92 Sequenzanalyse eines mitochondriellen Genabschnitts

25 Auswertung Allelhäufigkeit Genotypenhäufigkeit Heterozygotiegrad Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Vergleich mit anderen Gruppen Links:

26 Fragestellung 2: Wirken Querbauwerke im Verlauf der Haardtrandbäche als Wanderungshindernisse für Gammariden (Gammarus fossarum)?

27 Probestellen Gewässer (Probestelle) Triefenbach (oberhalb Hilschweiher) Modenbach (unterhalb Buschmühle) Hainbach (unterhalb Walddusche) Schwelterbach (bei Grillhütte) Mündung Speyerbach Speyerbach Speyerbach Queich

28 Probestellen Triefbach Modenbach Hainbach Schwelterbach

29 Gewässergüte Triefbach Modenbach Schwelterbach Hainbach

30 Strukturgüte

31 Querbauwerke

32 Hypothesen?

33 Methoden DNA-Extraktion Allozymanalyse RAPD, ISSR PCR-RFLP

34 DNA-Extraktion Konzentrationsbestimmung mittels Agarosegel

35 Allozymanalyse

36 Allozymanalyse negative anode Well Protein migrates positive anode

37 Wie variable sind Proteine? Anteil polymorpher Proteine (häufigstes Allel < 99 %): Säugetiere 15% Vögel 22% Insekten 33% Pflanzen 25%

38 Allozymanalyse Vorteile: kostengünstig; Marker sind co-dominant Nachteile: erfasst nur kleinen Anteil von DNA-Variationen. Viele DNA Varianten führen nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz (z.b. synonyme Substitutionen) bzw einer Änderung der Mobilität im Gel. Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung

39 Interpretation des Bandenmusters Bandenmuster für a) ein monomeres Enzym, b) ein dimeres Enzym und c) ein tetrameres Enzym. Die Homozygoten werden durch 11 und 22 repräsentiert, die Heterozygoten durch 12.

40 Interpretation des Bandenmusters monomere Quartärstruktur 6 Alloenzyme

41 Interpretation des Bandenmusters 3 Genorte Isoenzyme dimere Quartärstrukrur

42 DNA-Variationen RFLP PCR-basierte Methoden

43 RFLP (restriction fragment length polymorphism)

44 Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme schneiden an spezifischen Erkennungssequenzen. Diese Sequenzen sind oft Palindrome: 6-cutter: GAATTC 4-cutter: TCGA CTTAAG AGCT

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46 RFLP-Analyse PCR-Analyse: 1) PCR-Reaktion 2) Restriktionsverdau 3) Gelelektrophorese Southern-Analyse: 1) Restriktionsverdau 2) Gelelektrophorese 3) Hybridiserung???

47 RFLP-Analyse Vorteile: Marker sind co-dominant. Genetische Variationen werden direkt auf Ebene der DNA- Sequenz festgestellt. Nachteile: hoher Arbeitsaufwand, benötigt viel Probenmaterial Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung

48 RFLP-Analyse Aufgabe: Fragmentgröße 1800 bp Schnittstellen: Allel A 400bp & 800bp Allel B 400bp Fragmentmuster für AA, AB, BB?

49 PCR-basierte Methoden RAPD AFLP VNTR Sequenzierung

50 PCR (polymerase chain reaction) e/index.html?id=1017

51 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)

52 Analyse der Fragmentmuster Fragmentlänge [bp] Monomorphe Bande Polymorphe Bande

53 Analyse der Fragmentmuster

54 RAPD Vorteile: schnell, kostengünstig, hochvariabel. Nachteile: Marker sind dominant. Geringe Reproduzierbarkeit. Anwendungen: Populationsstrukturierung, geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung

55 AFLP (amplified fragment length polymorphism) Digestion of DNA with two enzymes Ligation of adapters Primers complementary to adapters and to 3 region of some of the fragments

56 AFLP

57 AFLP Vorteile: schnell, kostengüstig, hochvariabel, gute Reproduzierbarkeit. Nachteile: Marker sind dominant. Anwendungen: Populationsstrukturierung, geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung

58 Minisatelliten / Mikrosatelliten (VNTR)

59 Mikrosatelliten

60 Mikrosatelliten 6cSQ_S0005.F11_ Z Größenmarker 212 bp-peak 216 bp-peak Dye Signal Size (nt) Fragmentlängenbestimmung mit Hilfe eines Sequencers

61 Mikrosatelliten Vorteile: hochvariabel, co-dominant Nachteile: kostenintensiv, lange Entwicklungszeit Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Forensik

62 Sequenzanalyse

63 Sequenzanalyse Sequenzierung nach Sanger (Anfang 1970er Jahre) Automatische Sequenzierung

64 Sequenzanalyse Vorteile: hochvariabel, co-dominant Nachteile: kostenintensiv Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung, Phylogenetik

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66 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem deutschen Arzt Wilhelm Weinberg. HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population: Sehr große Individuenzahl Panmixie Keine Selektion Keine Mutationen Keine Migration

67 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht p + q = 1 p 2 + 2pq + q 2 = 1 p: relative Häufigkeit des Auftretens des Allels A q: Allelfrequenz des (zu A komplementären) Allels a p² = h(aa) 2pq = h(aa) q² = h(aa)

68 H obs = H exp? AA BB AA AB AB BB AB AB p = 0,5; q = 0,5 p² = h(aa) = 0,25 2pq = h(aa) = 0,5 q² = h(aa) = 0,25

69 H obs = H exp? AA AA AB BB AA BB AB BB Wahlund-Effekt: Separation von Teilpopulationen führt zu einem Rückgang der Heterozygotie

70 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem deutschen Arzt Wilhelm Weinberg. HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population: Sehr große Individuenzahl Panmixie Keine Selektion Keine Mutationen Keine Migration

71 F Grundlagen der genetischen Vielfalt Inzucht: = H 0 H H F = Inzuchtkoeffizient H 0 = erwartete H H = beobachtete H 0 Conner & Hartl 2004

72 Grundlagen der genetischen Vielfalt Zunahme der genetischen Vielfalt durch: Mutation Migration 1. Generation 2. Generation ase/index.html?id=1073

73 Grundlagen der Populationsgenetik Mutation Conner & Hartl 2004

74 Grundlagen der Populationsgenetik Migration: Inselmodell des Genflusses p t = p t 1 (1 m) + pm p = p t p t 1 = m( p p t 1 )

75 Grundlagen der genetischen Vielfalt Migration Conner & Hartl 2004

76 Grundlagen der genetischen Vielfalt Selektion: wirkt über Unterschiede in der individuellen Überlebensrate und im Fortpflanzungserfolg 1. Generation 2. Generation

77 Grundlagen der genetischen Vielfalt Selektion (gerichtet) Conner & Hartl 2004

78 Grundlagen der genetischen Vielfalt Selektion (gerichtet) Conner & Hartl 2004

79 Grundlagen der genetischen Vielfalt Selektion (stabilisierend) Conner & Hartl 2004

80 Grundlagen der genetischen Vielfalt Genetische Drift: nur ein Teil der Population reproduziert sich erfolgreich; hierdurch können sich Merkmalshäufigkeiten zufällig ändern 1. Generation 2. Generation

81 Grundlagen der genetischen Vielfalt Genetische Drift: Inzuchtkoeffizient F = 1 / 2N e (Wright 1931) F t = 1 - (1-1/(1/2 N e ) t Primack 1995

82 Grundlagen der genetischen Vielfalt Migration vs. Drift F ST = N e m F ST = Fixierungsindex Conner & Hartl 2004

83 Grundlagen der genetischen Vielfalt Flaschenhals-Effekt (bottleneck effect) Gründer-Effekt (founder effect) 1. Generation 2. Generation 3. Generation 1. See 2. See 1. Generation 2. See 2. Generation

84 Grundlagen der genetischen Vielfalt Ebene der Variation Beobachtete Heterozygotie innerhalb von Teilpopulationen (H I ) Differenzierung zwischen Teilpopulationen (F ST ) Effekt auf all Loci? Mutation Nein Genfluss (Migration) Ja Gendrift Ja Selektion Nein

85 Grundlagen der genetischen Vielfalt Inzucht: Paarung nahverwandter Tiere kann zur Kombination von zwei defekten Genen an einem Genort führen Zunahme von Erbkrankheiten, verminderte Überlebens- und Fortpflanzungsrate (Inzuchtdepression)

86 Grundlagen der genetischen Vielfalt Hybridisierung: die Kreuzung bereits differenzierter Populationen oder (Unter-)Arten kann die genetische Vielfalt erhöhen oder zu einem Verlust der genetischen Identität führen (Auszuchtdpression) 1. See 2. See 3. See

87 Projekte Laufend/ abgeschlossen: Nicht-invasive Bestandsschätzung von Wildschweinen (Kolodziej, Thometzek, Eckert) Phylogenetik von Bachforellenpopulationen des Pfälzerwaldes (Holzhäuser) Erfolgskontrolle von Fischwanderhilfen (Wolf) Sozialstruktur bei Waschbären (Peter) Warenkontrolle von Heilpflanzen (Süß) Geplant: Phylogenetik von Edelkrebspopulationen Genfluss zwischen Fischbeständen der Rheinaltarme