Untersuchungen zum Expressionsverhalten der Alpha- und Beta-Untereinheiten des Maxi K + - Kanals im Innenohr der Ratte

Transkript

1 Aus der Universitätsklinik für Hals- Nasen- Ohrenheilkunde Tübingen Abteilung Allgemeine Hals- Nasen- Ohrenheilkunde mit Poliklinik Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Zenner Sektion Sensorische Biophysik Kommisarischer Leiter: Professor Dr. J. P. Ruppersberg Untersuchungen zum Expressionsverhalten der Alpha- und Beta-Untereinheiten des Maxi K + - Kanals im Innenohr der Ratte Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität zu Tübingen vorgelegt von Thomas R. Krieger aus Karlsruhe 2001

2 Dekan: Professor Dr. C. D. Claussen 1. Berichterstatter: Professor Dr. J. P. Ruppersberg 2. Berichterstatter: Professor Dr. Dr. h. c. H. P. Zenner 2

3 Danksagung für die Unterstützung im Labor An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die zum Gelingen dieser Doktorarbeit beigetragen haben. Alle Mitarbeiter waren sehr aufgeschlossen und hilfsbereit. Ihre Unterstützung hat geholfen, sich schnell in neue Arbeitsweisen einzuarbeiten. Ohne die folgenden Personen wäre eine Bewältigung der Doktorarbeit wohl unmöglich gewesen. Vielen Dank an Dr. Uwe Brändle für die Betreuung im Labor. Er lehrte mich die molekularen Grundlagen. Hyun- Soon Geißler, Claudia Irrle, Corina König und Andrea Müller zeigten mir die korrekte molekularbiologische Arbeitsweise. Für die vielen wertvollen Tips bin ich ihnen sehr dankbar. Bei Stefan Gründer bedanke ich mich, die Laborräume mitbenutzen zu dürfen. Mein spezieller Dank geht an: Dr. Marcus Maassen, der diese Arbeit mitbetreute und tatkräftig zum Gelingen beigetragen hat, und an meinen Doktorvater Herrn Professor J. P. Ruppersberg, der sich bereit erklärte, die Doktorarbeit anzunehmen. 3

4 So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig. Man muß sie für fertighalten, wenn man nach Zeit und Umständen das Mögliche getan hat. - Johann Wolfgang von Goethe 4

5 MEINEN ELTERN 5

6 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Allgemeine Einführung und Fragestellung Tierexperimentelle Untersuchungsmethoden Haarsinneszellen Kaliumionenkanäle in Haarsinneszellen Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle Das genetische Korrelat des Maxi K + -Kanals Die Beta-Untereinheit des Maxi K + -Kanals Ziele der vorliegenden Arbeit Bisher veröffentlichte Ergebnisse Funktionsweise des Innenohrs Die Cochlea Das Vestibularorgan Ionenströme in Haarsinneszellen Die Elektrische Resonanz Efferente Innervation von Haarsinneszellen Der Kaliumionenkreislauf im Corti-Organ Die funktionelle Beeinflussung von Maxi K + -Kanälen Alternatives Spleißen des Slo-Gens Elektrophysiologische Messungen von Slo-Ionenkanälen Messungen von Spleiß-Varianten Slo-Ionenkanäle verschiedener Spezies Einzelne Slo-Inserts Koexpression von Alpha- und Beta-Untereinheit Zusammenwirken von Alpha- und Beta-Untereinheit 37 6

7 2 Material und Methoden Vorbemerkungen Bezugsnachweis Plasmidklone Molekularbiologische Standardmethoden Versuchstiere und Gewebeentnahme RNA-Isolierung aus Geweben Gesamt-RNA (trna) Boten-RNA (mrna) Polymerasekettenreaktion (PCR) Ablauf einer PCR ReverseTranskriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) Reverse Transkription (RT) Oligonukleotidprimer Amplifikation von DNA-Sequenzen Agarose-Gelelektrophorese Fragment-Aufreinigung Klonierung von PCR-Fragmenten Einführung Verwendete Klonierungssysteme DNA Isolierung Herstellung von Einzelstrang-DNA DNA-Sequenzierung nach Sanger Prinzip der Sanger-Methode Durchführung der Sequenzierung Polyacrylamid-Gelelektrophorese C-Lanes-Sequenzierung Dokumentation und Analyse 56 7

8 2.10 Southern-Blot-Hybridisierung Southern-Transfer Hybridisierung Dokumentation und Analyse Appendix Abkürzungen Bakterienmedien Puffer und Lösungen Aminosäuren der Proteine 61 3 Ergebnisse Vorbemerkung Alpha-Slo-Untereinheit Entwicklungsabhängige Expression der Slo-Spleiß-Varianten Die Wahl der Primer Amplifikation von Slo-Spleiß-Varianten Bestätigung durch Hybridisierung Zusammenfassung der Alpha-Slo-Ergebnisse Reproduzierbarkeit Beta-Slo-Untereinheit Nachweis durch Polymerasekettenreaktion Die Lage der Primer Die amplifizierten DNA-Banden Nachweis durch Hybridisierung Reproduzierbarkeit Zusammenfassung der Ergebnisse 80 8

9 4 Diskussion Die molekularbiologischen Methoden Die Innenohrgewebe Die rslo-spleiß-stellen Nachweis von Alpha-Slo in Innenohrgeweben Das entwicklungsabhängige Expressionsmuster von rslo-alpha Koexpression der beiden rslo-untereinheiten im Cortischen Organ Eine mögliche Funktion von Slo-Untereinheiten in Haarsinneszellen Aussichten für die Zukunft 93 5 Zusammenfassung 94 6 Literaturverzeichnis 95 7 Lebenslauf 104 9

10 1 Einleitung 1.1 Allgemeine Einführung und Fragestellung Tierexperimentelle Untersuchungsmethoden Durch die Weiterentwicklungen der Molekularbiologie wird es der Forschung ermöglicht, immer kleinere Bausteine einer Zelle zu untersuchen. So kann man der Funktionsweise des Innenohrs immer näher kommen und damit Neue Zivilisationskrankheiten, z.b. Tinnitus oder Lärmschwerhörigkeit, besser verstehen ( Walkmangeneration, Hudspeth, 1989). Mit Tierexperimenten versucht man, Einblicke in die physiologischen Abläufe zu bekommen. Durch das Zusammentragen von verschiedenen Forschungsergebnissen können mögliche Funktionstheorien z.b. des Hörens aufgestellt werden. Das Innenohr von Nagetieren bietet sich für Forschungszwecke besonders an, da sich das Hörvermögen vermutlich erst nach der Geburt entwickelt (Rubel, 1978). Bei der Ratte wird der Hörbeginn etwa um den 12. postnatalen Tag angenommen, daran schließt sich die Reifung des Gehörs bis ca. Tag 28 an Haarsinneszellen Haarsinneszellen (HZ) spielen eine zentrale Rolle beim Hören und beim Erhalt des Gleichgewichtes. Im Innenohr des Menschen kommen sie in allen sechs Rezeptororganen vor. Man schätzt ihr Vorkommen in der Cochlea auf ca , im Gleichgewichtsorgan auf ca (Hudspeth, 1989). Auf ihrer Zelloberfläche besitzen sie ein Haarbündel, das aus etwa steifen Sinneshärchen (Stereozilien) besteht und fest mit der Zelloberfläche verwurzelt ist (Abbildung 1.1). Die Stereozilien funktionieren wie ein Hebel (Tilney et al., 1980) und stehen untereinander durch Filamente (Tip-Links) in Verbindung (Hudspeth, 1989). 10

11 Bei den Säugern sind verschiedene Haarsinneszellen bekannt. Sie unterscheiden sich in Form, Größe, Anordnung und Funktion. Allen gemeinsam ist die Fähigkeit der mechano-elektrischen Transduktion, d. h. sie können mechanische Energie in elektrische umwandeln (Hudspeth, 1989; Denk et al., 1995) und so einen Effekt der Haarsinneszelle auslösen: Äußere Haarsinneszellen besitzen die Fähigkeit, sich zu kontrahieren (Brownell et al., 1985; Zenner und Ernst, 1993). Innere Haarsinneszellen leiten die Signale an das Zentralnervensystem weiter, indem sie Transmitter (Botenstoffe) frei setzen (Hudspeth, 1997). Neben diesen bekannten afferenten Nervenfasern (zum Gehirn) innerer Haarsinneszellen wurden auch Efferenzen (vom Gehirn) zu äußeren (Plinkert et al., 1993; Glowatzki et al., 1995) und inneren Haarsinneszellen beschrieben (Hashimoto et al., 1990; Yamashita et al., 1993; Sobkowicz und Slapinck, 1994; Glowatzki et al., 1995). Innere und äußere Haarsinneszellen unterscheiden sich folglich nicht nur in ihrer Funktion, sondern auch in ihrem neuronalen Muster (Eybalin, 1993). Vermutlich müssen alle Haarsinneszellen der Wirbeltiere (Vertebraten), um ihre physiologische Funktion ausüben zu können, mindestens drei Membranleitfähigkeiten haben (Kros, 1996), die durch unterschiedliche Familien von Ionenkanälen erzeugt werden (Abbildung 1.1): einen Transduktionsstrom (I T ), der an der basolateralen Zellmembran ein Rezeptorpotential hervorbringt, einen Kaliumionenstrom (I K ), der die Eingangsleitfähigkeit und das Ruhemembranpotential der Zelle wiederherstellt, und einen Kalziumionenstrom (I Ca ), der den gewünschten Effekt der Zelle auslöst. 11

12 Abb. 1.1 Schematische Darstellung einer Haarsinneszelle mit den minimalen Membranleitfähigkeiten für Kaliumionen (I T ), Kalziumionen (I Ca ) und einen Transduktionsstrom (I T ) Kaliumionenkanäle in Haarsinneszellen Allgemein spielen Kaliumionenkanäle eine wichtige Rolle, verschiedene Funktionen von Zellarten zu ermöglichen (Rudy, 1998; Hille, 1993). Sie regulieren das Membranpotential sowohl in elektrisch erregbaren Zellen (Nerven, Muskeln) als auch in unerregbaren (Lymphozyten; Hille 1993). 12

13 Zu den wichtigsten Kaliumionenkanälen in Haarsinneszellen gehören die folgenden Familien (Eatock und Rüsch, 1997): 1.) Einwärtsgleichrichtende Kaliumionenkanäle (Inward Rectifiers). Ihre Hauptfunktion liegt vermutlich in der Repolarisierung und anschließenden Stabilisierung des Ruhemembranpotentials. Ihr Funktionsbereich befindet sich nahe an dem Gleichgewichtspotential für Kaliumionen, ca. -85 mv. 2.) Auswärtsgleichrichtende Kaliumionenkanäle (Kv-Kanäle, Delayed Rectifiers) sind spannungsabhängig und unterscheiden sich durch eine unterschiedliche Ionenkanalkinetik. Sie sind ebenfalls an der Repolarisation der Zellmembran nach Aktionspotentialen beteiligt. 3.) KCNQ-Kaliumionenkanäle bilden eine eigenständige Untergruppe der Kv- Kanäle. Bisher konnten vier Ionenkanäle, KCNQ 1 bis 4, isoliert werden, die sich nur wenig in ihrer Aminosäuresequenz ähneln (Kubisch et al., 1999). Interessant ist, daß Mutationen auf jedem bekannten KCNQ-Gen menschliche Erbkrankheiten nach sich ziehen: Veränderungen an KCNQ 1 resultieren in einer Verlängerung der QT-Zeit (Long QT-Syndrom), welche zu Herzrhythmusstörungen und plötzlichem Herztod führen kann (Wang et al., 1996). Der Erbmodus ist autosomal dominant. Sind beide Allele des Gens betroffen (autosomal rezessiv), so resultiert das Jervell-Lange-Nielsen- Syndrom (Neyroud et al., 1997). Dies zeichnet sich dadurch aus, daß der Verlauf schwerwiegender ist als bei autosomal rezessivem Erbgang: die Patienten sind von Geburt an zusätzlich taub. Mutationen von KCNQ 4 resultieren ebenfalls in Ertaubung. Sie werden autosomal dominant vererbt. Verglichen mit KCNQ 1 ist es aber ein reiner Hörverlust (nicht syndromatisch) von weniger schwerwiegendem Verlauf, der aber mit zunehmendem Patientenalter zunimmt. KCNQ-4-Ionenkanäle wurden in äußeren Haarsinneszellen nachgewiesen (Kubisch et al., 1999), KCNQ 1 in der Stria vascularis (Neyroud et al., 1997). 13

14 KCNQ 2 und 3 Ionenkanäle werden hauptsächlich im ZNS exprimiert (Schroeder et al., 1998). Mutationen können zu benigner familiärer Neugeborenenepilepsie führen (Biervert et al., 1998; Charlier et al., 1998; Singh et al., 1998). 4.) Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle (K (Ca) -Kanäle) Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle (K (Ca) -Kanäle) K (Ca) -Kanäle sind in der Zellphysiologie weit verbreitet. Man findet sie bei der Entladung von Neuronen (Meech, 1978), bei der Sekretion von endokrinen und exokrinen Zellen (Peterson und Maruyana, 1984; Ferrer et al., 1996) oder bei der Aktivierung von T-Zellen (Calahan et al., 1991). Untereinander gibt es Unterschiede in der Leitfähigkeit, der Regulation und der Sensitivität gegenüber Kalziumionen und der Spannung (Latorre et al.,1989). Bezogen auf ihre Einzelkanalleitfähigkeit kann man sie in zwei Gruppen einteilen (Rudy, 1988; Hille, 1992): K (Ca) -Kanäle niederer Leitfähigkeit, auch als SK-Kanäle (Blatz und Magleby, 1986), slow AHP K (Ca) (Rudy et al., 1988) oder apamin-sensitive K (Ca) bezeichnet (Hugues et al., 1982), besitzen eine Einzelkanalleitfähigkeit < 80 ps und keine Spannungsabhängigkeit. In erregbaren Zellen sind sie für eine langsame Nachhyperpolarisierung verantwortlich (Rudy, 1988; Hille, 1992). SK-Kanäle sind heteromere Komplexe, die aus SK-α Untereinheiten und Calmodulin zusammengesetzt sind. Eine Bindung von freien intrazellurären Kalziumionen an Calmodulin verursacht Konformationsänderungen, die zur Kanalaktivierung führt (Xia et al., 1998). SK-Kanäle kommen sowohl in inneren (Glowatzki und Fuchs, 2000) als auch äußeren Haarsinneszellen vor (Oliver et al., 2000). In Kombination mit anderen Ionenkanälen (Siehe ) bilden sie eine schnelle inhibitorische Synapse, d.h. ein hyperpolarisierender Ionenstrom verhindert das Auslösen von Aktionspotentialen und hemmt damit eine Reizentstehung. Damit sind sie maßgeblich an der Entstehung inhibitorischer postsynaptischer Ionenströme beteiligt. 14

15 K (Ca) -Kanäle hoher Leitfähigkeit bezeichnet man auch als Maxi K + -Kanäle (Latorre und Miller, 1983) oder BK-Kanäle (Marty et al., 1984). Im Gegensatz zu SK-Kanälen (Blatz und Magleby, 1986) zeichnen sie sich neben einer hohen Leitfähigkeit für Kaliumionen von mehr als 100 ps dadurch aus, daß sie von der Spannung und von der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration abhängig sind. Durch ihre Ca 2+ -Sensitivität können sie elektrische Signale mit chemischen koppeln (Latorre et al., 1989; McManus, 1991). Ein Effekt, der bei der Transmitterfreisetzung niederer Vertebraten existiert (Siehe Abschnitt elektrische Resonanz ). Außerdem sind Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle hoher Leitfähigkeit an der Repolarisation einer Zelle nach Aktionspotentialen beteiligt (Adams et al., 1982) und bestimmen durch ihr Mitwirken an der Einstellung des Ruhepotentials die Depolarisationsrate erregbarer Zellen (Gorman und Thomas, 1978) Das genetische Korrelat des Maxi K + -Kanals Durch eine Expression des Slowpoke-Proteins in Xenopus-Oozyten gelang der Beweis, daß der Slowpoke Gen-Locus, kurz Slo, (Atkinson et al., 1991) der Taufliege Drosophila melanogaster für einen kalziumabhängigen Kaliumionenkanal hoher Leitfähigkeit codiert (Adelman et al., 1992). Dies war die erste molekularbiologische Struktur eines Maxi K + -Kanals. Strukturelle Vergleiche mit bekannten Ionenkanälen zeigten Ähnlichkeiten mit spannugsabhängigen Kaliumionenkanälen, Delayed Rectifiers (Adelman et al., 1992). Sie besitzen sechs Transmembran-Domänen (S1-S6) mit einer Porenregion zwischen S5/S6. Daran schließt sich ein langer intrazellulärer C-Terminus mit weiteren vier potentiellen Transmembranregionen (S7-S10) an, der vermutlich für die Kalziumabhängigkeit verantwortlich ist (Wei et al., 1994). Als ein möglicher Spannungssensor kommt Domäne S4 in Frage (Miller, 1990; Papazin et al., 1991; Jan und Jan, 1992; Pongs, 1992; Durell und Guy, 1992). 15

16 Abb. 1.2 Mögliches Aussehen eines Slo-Ionenkanals: Sieben Transmembrandomänen (S0- S6), vier hydrophobe Segmente (S7-S10). S4 als Spannungssensor. N-Terminus extrazellulär. Die Stellen des alternativen-spleißes sind mit 1-7 nummeriert. Neue Untersuchungen zeigten, daß das Slo-Protein aus elf hydrophoben Segmenten besteht (Rosenblatt et al., 1997; Meera et al., 1997). Eine mögliche Struktur des über 1,1 kb großen Maxi K + -Kanals zeigt Abbildung 1.2. Die Artenvielfalt des Slo-Gens kommt durch alternatives RNA-Spleißen zustande (Adelman et al., 1992). Dies wurde durch weitere Slo-Homologe, die in anderen Spezies gefunden wurden, bestätigt (Butler et al., 1993; Dworetzky et al., 1994; 16

17 Tseng- Crank et al., 1994; Jiang et al., 1997; Navaratnan et al., 1997; Rosenblatt et al., 1997; Saito et al., 1997;). Es stellte sich heraus, daß die Spleiß-Region A (Terminologie nach Butler) die Region mit den meisten Spleiß-Varianten ist Die Beta-Untereinheit des Maxi K + -Kanals Basierend auf pharmakologischen Untersuchungen von Maxi K + -Kanälen (Miller et al.,1985; Hille, 1992; Shen et al., 1994) wurde mit radioaktivem Iberiotoxin (IbTX) aus der glatten Muskulatur von Rinderaorten eine kurze, 191 Aminosäuren lange Struktur des Maxi K + -Kanals isoliert (Abbildung 1.3). Abb. 1.3 Ein mögliches Aussehen der Beta-Untereinheit des Maxi K + -Kanals. Zwei Transmembrandomänen T1 und T2, eine extrazelluläre Schleifenregion, beide Enden intrazellulär. Die weißen Kreise stellen Proteinreste dar, die mit der Alpha-Untereinheit interagieren könnten. 17

18 Sie hat keine Strukturhomologien zur bereits bekannten Alpha-Kette noch ähnelt sie anderen Untereinheiten. Man bezeichnete sie auch als Beta-Untereinheit, Charybdotoxinrezeptor (Knaus et al., 1994a und b) oder (K V,CA ß) (Meera et al., 1996). Es war die erste klonierte Beta-Untereinheit eines Kaliumionenkanals Ziele der vorliegenden Arbeit Maxi K + -Kanäle wurden elektrophysiologisch in Haarsinneszellen beschrieben (Ashmore und Meech, 1986, Gitter et al., 1986; Zenner und Gitter, 1989; Kros und Crawford, 1990). Basierend auf der ersten Säugetiersequenz eines Maxi K + -Kanals (Butler, 1993) konnte ein molekularbiologischer Nachweis eines Rattenhomologes für mslo im Innenohr gefunden werden. Ebenfalls wurde an der entsprechenden Spleiß-Stelle A (Terminologie nach Butler, 1993) eine neue Spleiß-Variante isoliert (Stefan Frohnmayer, 1998). Die vorliegende Arbeit versucht, durch weiterführende molekularbiologische Experimente an Innenohrgeweben von Ratten, neue Aspekte und Funktionen der beiden Untereinheiten des Maxi K + -Kanals herauszufinden. Dabei wurden folgende Fragestellungen untersucht: 1.) Gibt es eine Beziehung zwischen rslo-spleiß-varianten an Spleiß-Stelle A (Terminologie nach Butler, 1993) und der Entwicklung von Innenohrgeweben? Von Interesse ist hier besonders die entwicklungsabhängige Expression der Spleiß- Varianten bei der Reifung des Cortischen Organs. Innenohrgewebe aus Ratten unterschiedlichen Alters sollen durch PCR und Hybridisierung untersucht werden, um damit ein mögliches Expressionsmuster zu erfassen. Beide Methoden sind, wegen ihrer Sensitivität, auch zum Auffinden von neuen Spleiß-Varianten geeignet, weshalb sich folgende Frage anschließt: 2.) Gibt es an dieser Stelle noch weitere unbekannte rslo- Spleiß-Varianten, die vielleicht nur im Innenohr exprimiert werden? Weitere Varianten wären aufgrund der Slo-Vielfalt des alternativen RNA-Spleißens an dieser Stelle (Adelman et al., 1992) durchaus denkbar. 18

19 Da der Maxi K + -Kanal aus einer Alpha- und einer regulatorischen Beta-Untereinheit besteht (Knaus et al., 1994; McManus et al., 1995; Dworetzky et al., 1996), stellt sich deshalb folgende weitere Frage: 3.) Wird eine Beta-Untereinheit des Maxi K + -Kanals im Innenohr der Ratte exprimiert, und in welchem Gewebe kommt sie vor? Es soll ein molekularbiologischer Nachweis der Beta-Untereinheit im Säuger- Innenohr erfolgen. 19

20 1.2 Bisher veröffentlichte Ergebnisse Funktionsweise des Innenohrs Die Cochlea Das Innenohr von Säugetieren besitzt drei wichtige Strukturen: Hörorgan (Cochlea), Gleichgewichtsorgan (Vestibularorgan) und Hörnerven. Das Sinnesepithel besteht aus Haarsinneszellen. Sie befinden sich im Gleichgewichtsorgan auf den Maculae und Cristae und in der Hörschnecke im Cortischen Organ (Corti, 1822). Vergleicht man den zellulären Aufbau von Gleichgewichtsorgan und Hörorgan (Abb. 1.4), so läßt sich die komplexe Struktur der Cochlea feststellen. Abb. 1.4 Übersichtszeichnung des menschlichen Innenohrs. A Endolymphe, B Haarsinneszellen des Gleichgewichtsorgans, C Statolithenmembran, D innere Haarsinneszelle, E drei äußere Haarsinneszellen, F Tektorialmembran, G Hörnerv, H Basalmembran, I Deiters-Zellen. Das Sternchen zeigt die Lage der Stria vascularis. Das Gleichgewichtsorgan besteht aus Vorhof (Sacculus und Utriculus) und drei Bogengängen. 20

21 Luft- und Knochenschall werden im Mittelohr durch eine Schalldrucktransformation über das ovale Fenster auf das Innenohr übertragen. In der Cochlea wird die Schallenergie auf das schwingungsfähige System der Tektorialmembran (TM) und Basilarmembran (BM) weitergeleitet. Durch die horizontalen Bewegungen der Tektorialmembran werden die längsten Stereozilien der äußeren Haarsinneszellen, die in Kontakt mit ihr stehen, ausgelenkt. Diese Scherbewegung spannt die Tip-Links (Abb. 1.1) zwischen den Stereozilien (Denk et al., 1995) und öffnet mechanische Kationenkanäle, die sich am Ende der Tip-Links befinden. Auch bei der geringsten Stereozilienauslenkung werden die Filamente gespannt, der Kationenkanal geöffnet und Kaliumionen (Pickles und Corey, 1992) fließen aus der Endolymphe in die äußere Haarsinneszelle ein, getrieben durch die hohe elektrische Potentialdifferenz von ca mv. Sie setzt sich zusammen aus -70 mv Membranpotential der äußeren Haarsinneszellen (Dallos, 1985 a) und dem Endolymphpotential von +85 mv. Der Kaliumionengehalt der Endolymphe beträgt etwa 140 mval/l. Eine Auslenkung der Stereozilien in die entgegengesetzte Richtung entspannt die Filamente, der Ionenkanal wird geschlossen und die Zelle hyperpolarisiert (Denk et al., 1989). Durch die einströmenden Kaliumionen entsteht ein Transduktionsstrom (I T ), der sich entlang der Zellmembran ausbreitet und die Zelle depolarisiert (Hudspeth, 1989, Pickles und Grey, 1992). Auf diesen Reiz hin kontrahieren sich die äußeren Haarsinneszellen (Brownell et al., 1985; Zenner und Ernst, 1993) und es kommt zu einer Aufwärtsbewegung der Basilarmembran, der sie aufsitzen. Durch die Bewegung der Basilarmembran entsteht eine Trägheitsströmung der Endolymphe, welche die Stereozilien der inneren Haarsinneszellen auslenkt. Innere Haarsinneszellen sind die eigentlichen Rezeptoren. Sie leiten die Impulse an das Gehirn weiter, indem sie den Neurotransmitter Glutamat in dem synaptischen Spalt freisetzen (Hudspeth, 1997). Die Theorie des kochleären Verstärkers versucht, das Zusammenspiel der beiden Arten von Haarsinneszellen zu erklären. Weil Tektorialmembran und Basilarmembran zueinander versetzt schwingen (Gummer et. al., 1996), entsteht ein Bereich auf der Basalmembran, auf dem die äußeren Haarsinneszellen mit ihrer Kontraktion Energie in die Wanderwelle pumpen und diese aktiv verstärken. Im Bereich außerhalb der sogenannten Resonanzfrequenzen wirken die äußeren Haarsinneszellen als Bremse, vergleichbar 21

22 mit einem Stoßdämpfer am Auto. Mit dieser Theorie ließen sich das tatsächlich um den Faktor 100 (etwa 40 db) höher gemessene Resonanzmaximum und die schärfere Frequenzabstimmung der ursprünglichen Wanderwelle nach Békésy erklären. Abb. 1.5 Diagramm der Wanderwelle mit und ohne Verstärkung durch äußere Haarsinneszellen Das Vestibularorgan Für die Orientierung im Raum ist das Gleichgewichtsorgan verantwortlich (Abb. 1.4). Es besteht aus den Otholithen für lineare Beschleunigung und den Bogengängen für Drehbeschleunigung. Beide Strukturen besitzen als Sinnesepithel ebenfalls Haarsinneszellen. Die Reizentstehung erfolgt nach dem gleichen Prinzip der Haarsinneszellen im Cortischen Organ, nur daß im Gleichgewichtsorgan keine kontrahierenden äußeren Haarsinneszellen vorkommen. Die Abscherbewegung der Stereozilien erfolgt im Otolithenapparat durch Parallelverschiebung einer den Stereozilien aufliegenden Statolithenmembran gegenüber den festsitzenden Zellkörpern. In den Bogengängen wird die cupula durch eine Trägheitsströmung der Endolymphe ausgelenkt. Eine exzitatorische Stereozilienauslenkung verursacht auch hier einen Transduktionsstrom, der sich entlang der Zellmembran ausbreitet. Im 22

23 weiteren Verlauf werden basolaterale Ionenkanäle aktiviert, um das Membranruhepotential wieder herzustellen und den Reiz durch Änderung der Aktionspotentialfrequenz an das Gehirn weiter zu leiten. Die komplexen Impulse aus Cochlea und Gleichgewichtsorgan werden in den Nervenfasern des Hörnervs an das Gehirn weitergeleitet. In ihnen werden auch Informationen aus dem Gehirn an das Innenohr (Plinkert et al., 1993; Glowatzki et al., 1995) geleitet Ionenströme in Haarsinneszellen Transduktionsströme (I T ) beinflussen die basolateralen Ionenströme von Haarsinneszellen. Dadurch entsteht ein Rezeptorpotential und ein Kaliumionenstrom (I K ), der das Ruhemembranpotential und die Eingangsleitfähigkeit der Zelle wieder herstellt. Das Rezeptorpotential wird in Form und Größe u.a. von zeit- und spannungsabhängigen oder ligandgesteuerten Ionenkanälen beeinflußt (Hudspeth und Corey, 1977; Fettiplace und Crawford, 1978). Bereits 1975 konnten Corey und Hudspeth die ersten Messungen von zeit- und spannungsabhängigen Kaliumionenströmen der basolateralen Haarzellmembran an Amphibien durchführen. Durch weiterführende Untersuchungen an inneren Haarsinneszellen des Meerschweinchens konnten diese zeit- und spannungsabhängigen Kaliumionenströme genauer untersucht und charakterisiert werden (Kros und Crawford, 1988, 1985, 1990). Durch Tetraethylammonium (TEA) und 4-Aminopyridin (4 AP) wurden sie in einen schnellen (I K,f ) und einen langsamen (I K,s ) Einzelstrom aufgetrennt (Tabelle 1.1). 23

24 Langsame Komponente (I K,s ) Schnelle Komponente (I K,f ) 4-AP-sensitiv TEA-sensitiv fehlende Inaktivierbarkeit fehlende Inaktivierbarkeit geringe Einzelkanalleitfähigkeit große Einzelkanalleitfähigkeit < 120 ps fast linear spontaner Strom- starke Auswärtsgleichrichtung Spannungskurvenverlauf (keine des spontanen Strom-Spannungs- Änderung der Einzelkanalleit- kurvenverlaufs (starke Abhängigkeit fähigkeit durch die treibenden Kraft) der Einzelkanalleitfähigkeit von der treibenden Kraft) Kinetik: sigmoidale Aktivierung und exponentielle Deaktivierung Tab. 1.1 Vergleich zwischen der schnellen und langsamen Komponente des basolateralen Kaliumionenstroms, gemessen an inneren Haarsinneszellen des Meerschweinchens. Weitere Untersuchungen mit Pharmaka (Blatz und Magleby, 1987) zeigten Ähnlichkeiten von I K,s mit einem Delayed-Rectifier-Kaliumionenkanal. I K,f glich der Charakteristik Kalzium-abhängiger Kaliumionenströme (I K(Ca) ). Durch Inside- out- Patch- Versuche an inneren Haarsinneszellen von Meerschweinchen konnte bewiesen werden, daß K (Ca) -Kanäle großer Leitfähigkeit (auch Maxi K + -Kanäle, Latorre et al., 1989) für den schnellen Kaliumionenauswärtsstrom (I K,f ) verantwortlich sind. Basolaterale Ionenströme äußerer Haarsinneszellen wurden ebenfalls charakterisiert. Es konnten zwei Hauptströme identifiziert werden (Housley und Ashmore, 1992; Mammano et al., 1995). Einer der beiden Ströme wird von Kalziumabhängigen Kaliumionenkanälen verursacht. Beide Untergruppen von Kalzium-abhängigen Kaliumionenkanälen, sowohl niederer als auch hoher Leitfähigkeit, wurden bisher in äußeren Haarsinneszellen beschrieben (Ashmore und Meech, 1986; Gitter et al., 1986; Zenner und Gitter, 1989). 24

25 Auch in Haarsinneszellen des Vestibularorgans kommen Kaliumionenströme vor (Rennie und Correia, 1994; Rüsch und Eatock, 1996; Rennie et al., 1996). Auch hier beeinflussen sie das Rezeptorpotential und stellen das Membranruhepotential ein (Eatok und Rüsch, 1997; Rüsch und Eatock, 1996; Rennie und Correia, 1996) Die Elektrische Resonanz 1981 entdeckten Crawford und Fettiplace, daß Haarsinneszellen auf einer bestimmten Position der Schildkröten-Cochlea für eine bestimmte Frequenz besonders empfindlich sind (Tonotopie). Die Haarsinneszellen von einigen niederen Wirbeltieren (Amphibien, Reptilien, Vögel) besitzen zusätzlich zur Tonotopie der Cochlea eine für diese Frequenz charakteristische elektrische Feinabstimmung. Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle können durch ihre Kalziumsensitivität elektrische Signale mit einer Transmitterfreisetzung koppeln (Latorre et al., 1989; McManus, 1991). Durch einströmende Kalziumionen wird an basolateralen präsynaptisch aktiven Zonen ein Neurotransmitter freigesetzt (Hudspeth, 1997). Ein Transduktionsstrom (I T ) depolarisiert die Haarsinneszelle. Es kommt zu einem intrazellulären Kalziumionenanstieg, der Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle als Feedback-Regulatoren aktiviert (Robitaille und Charlton, 1992). Diese sorgen durch einen großen Kaliumionen-Auswärtsstrom für eine schnelle Membranrepolarisation; dadurch werden die Kalziumionenkanäle inaktiviert. Mit sinkender intrazellulärer Kalziumionenkonzentration werden auch schließlich die Kalzium-abhängigen Kaliumionenkanäle inaktiviert. Die Kombination von Dihydropyridin-L-Typ-Kalziumionenkanälen (Hille, 1992) mit Kalzium-abhängigen Kaliumionenkanälen hoher Leitfähigkeit sind für diese Feinabstimmung der Zelle auf eine bestimmte Tonfrequenz verantwortlich (Lewis und Hudspeth, 1983a, 1983b; Art und Fettiplace, 1987, Hudspeth und Lewis, 1988a, 1988b). Elektrische Resonanz sorgt für eine bessere Frequenzabstimmung und Trennschärfe (Crawford und Fettiplace, 1981). 25

26 Efferente Innervation von Haarsinneszellen Über den Effekt einer schnellen synaptischen Hemmung kann das Zentralnervensystem (ZNS) die Transmitterfreisetzung erregbarer Zellen modulieren. Dieser Mechanismus beruht auf einem hyperpolarisierenden Chloridioneneinstrom in postsynaptische Zellen, der durch präsynaptisch freigesetzte Transmitter, z.b. γ- Aminobuttersäure (GABA) oder Glycin, verursacht wird (Alger et al., 1991). Kochleäre Haarsinneszellen besitzen einen für sie charackteristischen Mechanismus der schnellen synaptischen Hemmung (Oliver et al., 2000; Glowatzki und Fuchs, 2000). Cholinerge Efferenzen aus dem Kerngebiet der oberen Oliven enden an inneren und äußeren Haarsinneszellen und setzen Transmitter in dem synaptischen Spalt frei. Dieser Transmitter aktiviert nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nachr), die u.a. aus der Alpha-9-Untereinheit bestehen (Glowatzki et al., 1995) und in Haarsinneszellmembranen liegen (subsynaptische Seite). Durch transmitteraktivierte nach-rezeptoren strömen freie Kalziumionen in die Haarsinneszelle ein und aktivieren benachbarte, an der basalen Zellmembran lokalisierte SK-Ionenkanäle (Oliver et al., 2000). Hieraus resultiert ein hemmender hyperpolarisierender Kaliumionenstrom aus der Zelle. Dieser hemmende postsynaptische Ionenstrom (IPSC) ist in seinem Verlauf charackteristisch für eine schnelle synaptische Hemmung (Alger, 1991), und er wird maßgeblich durch die Ionenkanalkinetik von SK-Kanälen beeinflußt (Oliver et al., 2000) Der Kaliumionenkreislauf im Corti-Organ Die Membranoberflächen von inneren und äußeren Haarsinneszellen werden von Endolymphe der Scala media umspült. Endolymphe besitzt eine hohe Kaliumionenkonzentration von ca. 140 mm. Werden die Haarsinneszellen gereizt, so kommt es durch die hohe elektrische Potentialdifferenz zu einem Kaliumioneneinstrom in die Zellen. Durch die in der basolateralen Zellmembran sitzenden Kaliumionenkanäle werden die eingeströmten K + -Ionen wieder abgegeben. Vermutlich werden die K + -Ionen von den unter den äußeren Haarsinneszellen sitzenden Deiters-Zellen (Abb. 1.4) aufgenommen und diffundieren von dort interzellulär durch Gap-Junctions (Zellverbindungen) in Richtung Stria vascularis, wo 26

27 sie erneut durch Marginalzellen in den Ductus endolymphaticus sezerniert und wiederverwendet werden (Spicer und Schulte, 1998). Mit diesem Modell lassen sich einige Krankheitsbilder erklären: Eine Störung in der basolateralen K + -Ionenabgabe aus Haarsinneszellen, z.b. durch einen mutierten KCNQ-4-Ionenkanal, der in ähz nachgewiesen wurde, (Kubisch et al., 1999), kann zu einer chronischen Kaliumionenbelastung der Zelle und einer damit verbundenen langsamen Degeneration führen. Eine mögliche Erklärung für langsamen progredienten Hörverlust. In der Stria vascularis werden KCNQ-1- und KCNE-1- (auch mink-) Ionenkanaluntereinheiten koexprimiert. Sie beeinflussen die hohe Kaliumionenkonzentration der Endolymphe (Neyroud et al., 1997). Bestimmte Mutationen von KCNQ 1 oder mink verursachen am Herzen durch eine verminderte elektrische Reizweiterleitung Rhythmusstörungen (Long QT-Syndrom, Wang et al., 1996). Werden KCNQ-1/minK-Ionenströme durch Mutationen weiter vermindert, so kommt es zu zusätzlichem Hörverlust (Jervel-Lange-Nielsen-Syndrom). Dieser wird wahrscheinlich durch einen Kollaps der Scala media (Ductus endolymphaticus) mit daraus resultierender Haarsinneszelldegeneration verursacht (Kubisch et al., 1999) Die funktionelle Beeinflussung von Maxi K + -Kanälen Kalzium-abhängige Kaliumionenkanäle können direkt von Botenstoffen beeinflusst werden. Hierzu zählen G-Proteine, zyklische Nukleotide, Fettsäuren und Lipide, aber auch Phosphatasen, Proteinkinasen und intrazelluläre Kalziumionen (Reinhart et al., 1991; Hinrichsen, 1993; Bielefeld und Jackson, 1994; Oberholtzer et al.,1988). In Maxi K + -Kanälen des Hühnchens wurde eine Spleiß-Variante gefunden, die durch eine Phosphokinase phosphoryliert werden kann (Rosenblatt et al., 1997). Die regulatorische Beta-Untereinheit (McManus et al., 1995; Dworetzky et al., 1996) des Maxi K + -Kanals kann ebenfalls phosphoryliert werden. In PC 12-Zellen von Ratten wurde eine cysteinreiche Sequenz gefunden (Saito et al., 1997), die eine mögliche Zinkfinger-Domäne darstellt. Zinkfinger-Domänen vermitteln die Beeinflussung durch Nukleinsäuren (Evans, 1988), Phospholipide (Nishizuka,1992) und andere Proteine (Diaz-Meco et al., 1996). 27

28 Der N-Terminus (Anfang des Proteins) und die erste Transmembrandomäne des Maxi K + -Kanals sind für Protein-Interaktionen verantwortlich (Abb1.2). Native Maxi K + -Kanäle formieren sich zu Tetrameren (Hinrichsen, 1993; Shen et al., 1994). Veränderungen in diesem Bereich, wie bei den Shaker-Ionenkanälen erforscht (Li et al., 1992; Shen et al., 1993; Babila et al., 1994), können nicht nur den Zusammenschluß zwischen Alpha- und Beta-Untereinheit des Maxi K + -Kanals beeinflussen (Wallner et al., 1996), sondern auch Heteromultimeren-Konstellationen mit verschiedenen Untereinheiten Kalzium-abhängiger Kaliumionenkanäle oder Konstellationen mit anderen Ionenkanalfamilien (Ruppersberg et al., 1990) ermöglichen. Veränderungen im C-Terminus von Slo-Ionenkanälen haben eine Änderung der Kalziumionensensitivität, der Leitfähigkeit und der Öffnungsgeschwindigkeit zur Folge (Lagrutta et al., 1994) Alternatives Spleißen des Slo-Gens Unter alternativem RNA-Spleißen versteht man die Kombination unterschiedlicher Exone einer primären Boten-Ribonukleinsäure (m-rna). Es stellt eine Möglichkeit der zellspezifischen und entwickungsabhängigen Regulierung dar. Besonders in der Taufliege Drosophila melanogaster wurde alternatives Spleißen untersucht, da es hier als Ein/Ausschalter in entscheidenden entwicklungsabhängigen Prozessen Verwendung findet (Baker, 1989). Für folgende Drosophila-Gene ist alternatives Spleißen bekannt. Für den Para Locus, einen Natriumionenkanal (Loughney et al., 1989), für den Shaker Locus, einen spannungsabhängigen Kaliumionenkanal, auch KV oder Delayed Rectifier genannt (Sutcliffe und Milner, 1988) und für den Slowpoke Locus (Atkinson et al.,1991; Adelman et al., 1992). Die Ionenkanalvielfalt des Slo-Gens aus Fliegen (Atkinson et al., 1991; Adelman et al; 1992), Säugern (Butler et al., 1993; Tseng Crank et al., 1994) und Vögeln (Rosenblatt et al., 1997; Navaratnan et al., 1997) entsteht durch alternatives Spleißen. Auf diese Weise kommen funktionell unterschiedliche Ionenkanal- Varianten zustande. Eine Übersicht der Einteilung gefundener Spleiß-Stellen von Slo-Ionenkanälen gibt Tabelle

29 Im Slo-Gen des Hühnchens wurden am Anfang des Proteins (N-terminales Ende) zwei Spleiß-Stellen, mit jeweils einer Sequenzvariante gefunden (Rosenblatt et al., 1997). Ob diese zwei zusätzlichen Spleiß-Stellen bei Säugern vorkommen, ist unbekannt (Abb.1.2). Tabelle 1.3 vergleicht die bekannte Slo-Sequenz der Fliege (Atkinson et al., 1991; Adelman et al; 1992) mit den Sequenzen, die in Säugervertebraten gefunden wurden (Butler et al., 1993, Tseng Crank et al., 1994). Anzahl der Spleiß-Regionen in: Terminologie / gefundene Exons ( ) Drosophila: 5 A C E G I (6) (2) Maus: 2 A B (4) (2) Ratte: 2 A B (4) (2) Mensch: (+ 2 potentielle) (3) (4) (2) (2) Tab. 1.2 Einteilung der Spleiß-Stellen aus Fliegen und Säugern. Alternativ gefundene Exons sind in Klammern gefaßt. Gleiche Regionen stehen untereinander. In Spleiß-Region G sind die meisten Spleiß-Varianten bekannt. Region 4 ist unter den Säugern konserviert und stellt wahrscheinlich eine phylogenetisch neue Region dar. Homologien mslo hslo rslo dslo < < 60 mslo hslo Tab.1.3 Sequenzübereinstimmung auf Nukleotidebene zwischen Slo-Genen aus Fliegen und Säugern; rslo ist das Rattenhomolog. Angaben in Prozent. 29

30 Die Slo-Aminosäuresequenz der Vögel, isoliert aus Hühnchen (cslo, Jiang et al., 1997) stimmt mit der beim Menschen beschriebenen (Tseng-Crank et al., 1994) zu mehr als 90 % überein Elektrophysiologische Messungen von Slo-Ionenkanälen Messungen von Spleiß-Varianten Durch alternatives Spleißen an den fünf bekannten Spleiß-Stellen von Drosophila Slo sind mindestens 144 verschiedene Exonkombinationen möglich (Adelman et al., 1992; Lagrutta et al., 1994). Daß dabei Ionenkanäle mit verschiedenen physiologischen Eigenschaften entstehen, wurde von Lagrutta und Kollegen (1994) systematisch untersucht. Sie bezeichneten die alternativen Regionen mit A, C, E, G, I. Die dazwischenliegenden konstanten Regionen mit B, D, F und H. Mit Hilfe von Restriktionsenzymen wurden verschiedene Regionen miteinander kombiniert, in einen konstanten Proteinrest eingebaut und anschließend in Xenopus Oozyten gemessen. Über die funktionellen Unterschiede konnten die folgenden Aussagen gemacht werden: Region A Variante A1 verglichen mit A3 im E1G3-Hintergrund Aminosäuresequenzen von: A1 AMFASSIPEIIELVGSGNKYGGELKREHGK A3 AI FASCIPEIIDLI GTRAKYGG TLKNEKGR Einzelkanalleitfähigkeit: 229 ± 3,6 ps 152 ± 5,8 ps Ca 2+ -Sensitivität: P 0 2 = 0,5 (Steady State) 50% Öffnungswahrscheinlichkeit 100 µm Ca 2+ keine Öffnung bei -40 mv Aktivierungszeitkonstante: 8,1 ± 1,4 ms 2,9 ± 0,4 ms (100 µm Ca 2+ /80 mv) Tab. 1.4 Messungen unterschiedlicher Spleiß-Varianten an der Region A. Die halbmaximale Öffnungswahrscheinlichkeit ist abhängig von Kalziumionen. A1 A3 30

31 Zusammennfassung: A1 verglichen mit A3 hat eine: 1.) höhere Einzelkanal-Leitfähigkeit, die nicht durch maximale Kalziumionenkonzentration beeinflußt wird 2.) deutlich höhere Kalziumionensensitivität bei kleineren Depolarisationswerten 3.) langsamere Aktivierungszeit Region E Variante E1 verglichen mit E3 im A1G5 oder A3G5 Hintergrund Aminosäuresequenzen von: E1 E2 SPDTQAWQNDYLQGTGCEMYTETLSPSFTGMTFPQAS SPDMQSWTNDYLRGTGMEMYTETLSPTF IG I PFAQAT E1 E2 Einzelkanal- Leitfähigkeit: Kombinationen mit A1 hatten höhere Werte als mit A3; keine Unterschiede zwischen zwischen E1 und E2 Ca 2+ -Sensitivität: ca. 30 µm Ca 2+ ca. 300 µm Ca 2+ 50% Öffnungswahrscheinlichkeit bei + 40mV bei A3G5 Hintergrund Aktivierungszeitkonstante: 8,1 ± 1,4 ms 2,9 ± 0,4 ms (100 µm Ca 2+ / 80 mv) Tab.1.5 Messungen unterschiedlicher Spleiß-Varianten an der Region E mit unterschiedlichem Hintergrund. Steady-State in Abhängigkeit von der Kalziumionenkonzentration. 31

32 Zusammenfassung: E1 verglichen mit E2 zeigt: 1.) je nach Kombination des AG Hintergrundes Unterschiede in der Einzelkanalleitfähigkeit. Kombinationen mit A3 haben geringere Leitfähigkeiten als mit A1 2,) eine höhere Ca 2+ -Affinität (sensitiver gegenüber Kalziumionen) als E2 und einen maximalen Kalziumioneneffekt 3.) eine langsamere Aktivierungszeit Region G Vergleich zwischen G3 und G5 im Hintergrund A3E3 und A1E2 Aminosäuresequenzen: G3 LTVQPRSKFDDL G5 LTVQPRSKFDDL GDITRDREDT G3 G5 Einzelkanalleitfähigkeit: Kalziumsensitivität: keine Unterschiede Aktivierungszeitkonstante: A3E1 ( 3 µm Ca 2+ / 80mV) 8,9 ± 1,5 ms 3,4 ± 0,4 ms A1E3 (100 µm Ca 2+ / 80 mv) 5,3 ± 0,5 ms 8,1 ± 1,4 ms Tab.1.6 Vergleich zwischen G3 und G5 der Spleiß-Region 5. Die Aktivierungszeitkonstante wurde bei unterschiedlichem Hintergrund gemessen. Zusammenfassung: G3 hat gegenüber G5 im Kalzium-sensitiveren Hintergrund A3E1 langsamere Aktivierungszeiten als A1E3. Abschließend läßt sich sagen, daß sich die jeweiligen Slo-Ionenkanäle in ihrer Kalziumsensitivität, Leitfähigkeit und Öffnungsgeschwindigkeit unterscheiden. 32

33 Slo-Ionenkanäle verschiedener Spezies Vergleicht man die Einzelkanalleitfähigkeiten von Drosophila Slo (Adelman et al., 1992) und Maus Slo (Butler et al., 1993), so fällt der doch beachtliche Unterschied von über 100 ps auf. Bei einer Sequenzhomologie von >60% zwischen beiden Spezies unterscheiden sich die beiden Klone nur durch einige Aminosäure-Reste in der angenommenen Porenregion zwischen S5 und S6 (Abb1.2). mbr 5 dslo Einzelkanalleitfähigkeit 272 ps 123 ± 6,6 ps Umkehrpotential -1,6 mv ± 0 mv Ca 2+ - Konzentration 100 µl 100 µl K + - Konzentration 156 mm 120 mm Tab. 1.7 Einzelkanalleitfähigkeiten von dslo und mslo. DSlo besteht aus den Regionen A1/C2/E2/G5/I0, mbr 5 (Gehirn) entspricht mslo. Offensichtlich können kleine Unterschiede in der Aminosäuresequenz von Kaliumionenkanälen signifikante Veränderungen ihrer Eigenschaften hervorrufen (Mac Kinnon und Miller, 1989). mslo dslo LTYWECVYLLMVTMSTVGYGDVY LSYWECVYLL I VTMSTVGYGDVY Tab. 1.8 Sequenz der Porenregionen von Maus und Drosophila Einzelne Slo-Inserts In chromaffinen PC-12-Zellen der Ratte ist an der Spleiß-Stelle 2 ein cysteinreiches +59 aa Insert gefunden worden, das eine mögliche Zinkfingerdomäne (Kationenbindungsstelle) darstellen könnte (Saito et al., 1997). Vergleichende Messungen zwischen Slo-zf incl. Zinkfingerdomäne (Saito et al., 1997) und mslo (Butler et al., 1993) zeigten, daß bei gegebener Kalziumionenkonzentration die Slo- 33

34 Ionenkanäle mit dem +59 aa Insert schneller aktivieren und eindeutig langsamer deaktivieren als ohne Insert. Außerdem wurden die Slo-zf-Ströme bei negativeren Spannungen aktiviert als bei mslo. Dieses +59 aa Insert verursacht einen negativen Shift, eine Linksverschiebung der Leitfähigkeits-Spannungskurve von ca. -30 bis -20 mv. Ca 2+ -Konzentration Spannung (mv) (µm) mslo Slo-zf ± Tab. 1.9 Vergleichende Messungen zwischen mslo und Slo-zf. Das +59 aa Insert wurde in mbr 5 (mslo) exprimiert und gemessen. (Steady State, halbmaximale Öffnungswahrscheinlichkeit). Einen Vergleich der Aktivierungszeitkonstanten zwischen mslo und Slo-zf gibt die folgende Tabelle wieder. Aktivierungszeitkonstante (ms) Potential (mv) mslo Slo-zf 20 1,5 0, ,5 60 0,7 0,4 80 0,5 0, ,3 0,25 Tab.1.10 Aktivierungszeitkonstanten von mslo und Slo-zf bei konstanter Kalziumionen- Konzentration von 100 µm. Ein ähnliches +60 aa Insert wurde in Inselzellen des menschlichen Pankreas isoliert (Ferrer et al., 1996). Die Aminosäuresequenz unterscheidet sich nur in zwei Aminosäuren und enthält ein zusätzliches Arginin. Dieses Insert wurde noch nicht gemessen. 34

35 Koexpression von Alpha- und Beta-Untereinheit Maxi K + -Kanäle bestehen aus zwei verschiedenen Untereinheiten (Garcia- Calvo et al., 1994; Knaus et al., 1994a und 1994b), wobei die Slo-Alpha-Untereinheit den Ionenkanal bildet (Adelman et al., 1992; McManus et al., 1995; Dworetzky et al., 1996). Um festzustellen, welchen Einfluß die Beta-Untereinheit auf die Ionenleitfähigkeit der Alpha-Untereinheit hat, wurden beide gemeinsam in Oozyten exprimiert und mit einer alleinigen Alpha-Untereinheit verglichen (McManus et al., 1995). Als Ergebnis kam heraus, daß Ionenkanäle, die mit Beta koexprimiert wurden, sensitiver gegenüber einer Kalziumionen- und Spannungsaktivierung sind als ohne Beta. Die Messungen der Alpha/Beta-Koexpression gleichen denen von nativen Maxi K + -Kanälen. Spannung (mv) Kalziumionenkonzentration (µm) mslo α mslo α mit bslo β Tab.1.11 Unterschiedliche Kalziumionensensitivität zwischen mslo-alpha und zusammen mit der Beta-Untereinheit des Rindes (b Slo β). Der mittlere Shift beträgt ca. -90 mv. Bei 0 mv Spannung unterscheidet sich die Ca 2+ -Konzentration um den Faktor 10. Es fiel außerdem auf, daß der Maxi K + -Kanal-Aktivator DHS I (Dehydrosoyasaponin I) nur einen Effekt bei gemeinsamer Alpha/Beta- Koexpression hat. Der DHS-I-Effekt wird also über die Beta-Untereinheit vermittelt. Expressionsgrad, Einzelkanalleitfähigkeit und Ionenselektivität bleiben dabei unverändert. 35

36 mslo α mslo α / bslo β Einzelkanalleitfähigkeit 272 ps 262 ps DHS-I-Effekt negativ positiv Tab.1.12 Der DHS-I-Effekt ist abhängig von der Beta-Untereinheit. Die Einzelkanalleitfähigkeiten bleiben dabei unverändert. Messungen einer Koexpression, bei der beide Untereinheiten aus einer Spezies stammen, konnten durchgeführt werden, als man die menschliche Beta- Untereinheit h (K V;Ca β) fand (Meera et al., 1996; McManus et al., 1996). Auch bei diesen Messungen zeigte sich, daß die Beta-Untereinheit die Kalziumionensensitivität bei gleichzeitiger Verlangsamung der Aktivierung und Relaxierung drastisch erhöht (Dworetzky et al., 1996). Durch diese Entdeckung wurde es ermöglicht, Parallelen mit nativ gemessenen Typ- I- und II-BK-Kanälen aus Rattengehirnen zu ziehen (Reinhart et al., 1989; Meera et al., 1996; Dworetzky et al., 1996). In der nachfolgenden Übersicht werden die Messungen miteinander verglichen. Tetrandine, ein Alkaloid, blockiert spezifisch Typ- II-BK-Kanäle (Wang und Lemos, 1992). BK Typ I hslo α BK Typ II hslo α / hslo β Öffnungskinetik schneller langsamer Toxinsensitivität weniger (ChTX, IbTX) sensitiv unsensitiv sensitiv Phosphorylierung Abnahme durch PKA (camp) Aktivierung der Aktivität Tetrandin-Block nein ja Tab Vergleichende Darstellung zwischen nativ gemessenen Typ-I-/Typ-II-BK-Kanälen aus Rattengehirnen und menschlichen Slo-Ionenkanälen mit und ohne hslo-beta- Untereinheit. (Zyklisches Adenosinmonophosphat aktiviert Phosphokinase A. ) 36

37 Zusammenwirken der Alpha- und Beta-Untereinheiten Der funktionelle Zusammenschluß zwischen Slo-α- und Slo-β-Untereinheit ist abhängig vom intrazellullären Kalziumionenspiegel (Meera et al., 1996). Unterhalb von 100 µm findet eine Aktivierung des Ionenkanals rein spannungsabhängig und unabhängig von Kalziumionen statt. Ab einer Kalziumionenkonzentration von 100 nm können beide Untereinheiten miteinander gekoppelt werden. Im mikromolaren Bereich verstärkt die Beta-Untereinheit die Kalziumionen- Sensitivität der Alpha-Untereinheit und bewirkt eine Aktivitätszunahme zu mehr hyperpolarisierten Werten (negativer Shift). Diese Umschaltung erfolgt in einem Kalziumionenbereich, der während einer zellulären Erregung vorkommt; ca M intrazellulärer Ca 2+ -Konzentration (Meera et al., 1996). 37

38 2 Materialien und Methoden 2.1 Vorbemerkungen Alle nachfolgenden Experimente wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, um Verunreinigungen (Kontaminationen) zu vermeiden. Das gilt besonders für die Schritte der Ribonukleinsäure-Gewinnung (RNA-Extraktion) aus Geweben, der Reversen Transkription (RT), der Polymerasekettenreaktion (PCR) und das Arbeiten mit Bakterien (Klonieren). Obligat waren ein weißer Schutzkittel, Latex-Einmalhandschuhe und ein speziell für den jeweiligen Arbeitsschritt vorgesehener Arbeitsplatz. Die verwendeten Ausgangssubstanzen waren neu oder wurden durch Autoklavieren kontaminationsfrei gemacht. Puffer und Lösungen wurden mit bidestilliertem Wasser angesetzt und autoklaviert bzw., falls dies wegen der Zusammensetzung nicht möglich war, durch einen 0,45 µ-filter steril filtriert. Verbrauchsmaterialien, wie z.b. Pipettenspitzen oder Reaktionsgefäße, wurden ebenfalls autoklaviert und ausschließlich einmalig gebraucht. 2.2 Bezugsnachweise für Arbeitsmaterialien Die im Labor verwendeten Chemikalien stammten hauptsächlich von der Firma Sigma-Aldrich (Deisenhofen) und Firma Roth (Karlsruhe). Oligonukleotide wurden ebenfalls von letztgenannter Firma geliefert. Radioaktiv markierte Oligonukleotide wurden bei DuPont NEN (Bad Homburg) bestellt. Es kam folgende Radioaktivität zum Einsatz: [α 35 S] datp mit einer spezifischen Aktivität von 1250 Ci/mMol und [α 32 P] dctp mit 3000 Ci/mMol. Reverse Transkriptase (RT) und Taq-DNA- Polymerase wurden von Life Technologies (Eggenstein) bezogen, die restlichen Enzyme von der Firma Boehringer (Mannheim). An Verbrauchsmaterial standen zur Verfügung: Gilson-Pipettenspitzen, Petrischalen und Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg), Polaroid- und Kodak-Filme, 3 M Whatman Papier, sowie Hybond-N Nylon Blotting- Membran der Firma Amersham-Buchler (Braunschweig). Die Bezugsquellen von industriellen Kits stehen jeweils in Klammern. 38

39 2.3 Plasmidklone Herrn Prof. Dr. Olaf Pongs, der freundlicherweise die Beta-Untereinheit des Kalziumabhängigen Kaliumionenkanals großer Leitfähigkeit (βrslo) zur Verfügung stellte, sei an dieser Stelle gedankt. Sie entstammt einer Rattenuterus-cDNA-Library. Das Insert wurde über EcoR I /Xba I in pcdna 3-Vektor subkloniert und ist 590 Basenpaare (bp) lang. 2.4 Molekularbiologische Standardmethoden Die im weiteren Verlauf beschriebenen allgemeinen molekularbiologischen Arbeitsweisen sind meist standardisierte Methoden. Sie sind unabkömmlich und bilden die Basis eines jeden molekularbiologischen Labors. Modifikationen eines Protokolls werden im jeweiligen Schritt erwähnt. Falls eine ausführliche Darstellung der molekularbiologischen Methoden gefordert wird, so sei auf entsprechende Nachschlagewerke, z.b. Ausubel et al.1995: Current Protocols In Molecular Biology, hingewiesen. Für einige Arbeitsschritte sind spezielle industrielle Kits erhältlich. Sie ermöglichen zeitsparendes Arbeiten bei sehr guten Ergebnissen. Ihre Handhabung ist einfach, da Anleitung und Reagenzien mitgeliefert werden. In der Appendix (2.11) sind häufig verwendete Abkürzungen, Puffer und Lösungen aufgelistet. 2.5 Versuchstiere und Gewebeentnahme Als Versuchstiere wurden Wistar-Ratten (Charles River Viga) mit unterschiedlichem Alter zwischen pn 1 (postnatalem Tag 1) und ausgewachsenen Tieren benutzt. Vor Gewebeentnahme wurden die Tiere zuerst mit CO 2 (Kohlendioxid) eingeschläfert und anschließend dekapitiert. Die Strukturen der Felsenbeine wurden gemäß der Methode nach Zenner et al., 1985 a und b, wie im folgenden kurz dargestellt, präpariert: Nach Eröffnung der Schädelkalotte wird zunächst das Gehirn entnommen, anschließend werden die Felsenbeine aufgesucht. Die Bulla wird mit einem Sicherheitsabstand aus der 39