Radioaktive Bakterien im Kampf gegen Metastasen

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1 Radioaktive Bakterien im Kampf gegen Metastasen Sabrina Jung und Sergej Franz Fragen Sie Ihren Arzt oder Apotheker Aber was würden Sie sagen, wenn diese Ihnen plötzlich radioaktive Bakterien verschreiben würden, die eigentlich eine Infektionskrankheit auslösen könnten? Das soll zumindest gerade die Zukunft zur Behandlung von metastasierendem Pankreas-Krebs sein. Kleine Bakterien - Große Wirkung Bei diesen ominösen Bakterien handelt es sich um Vertreter der krankheitsauslösenden Art Listeria monocytogenes, die nahezu überall in der Natur vorkommen. Die Infektionskrankheit Listeriose, die nach ihrem Erreger benannt wurde, kann durch die Aufnahme kontaminierter Nahrung ausgelöst werden. So kann man Listerien beispielsweise in roher Milch, rohem Fleisch (Huhn), Salaten oder generell in nicht zuvor erhitzten Lebensmitteln finden. Dagegen weisen Speisen, die vor dem Abfüllen erhitzt wurden, wie pasteurisierte Milch oder aber auch rohe Karotten und Tomaten, keine Listerien-Kontamination auf. [1] Listerien tolerieren die unterschiedlichsten Wachstumsbedingungen und können sich schon bei Kühlschrank-Temperaturen vermehren. Da Listerien invasiv sind, können sie leicht in Gewebe eindringen und durch den Transport über den Blutstrom sogar bis ins Gehirn gelangen. Besonders Menschen mit geschwächtem Immunsystem sind betroffen, und die Listerien-Infektion kann nicht nur zu Fieber, Übelkeit und starken Kopfschmerzen sondern, auch zu Blutvergiftung und Hirnhautentzündung führen. Vom Krankheitserreger zur Krebstherapie Schon in früheren Arbeiten wurden Listerien zum Transport eingesetzt, um tumorassoziierte Antigene in Antigen-präsentierende Zellen, wie phagozytierende Monozyten einzuschleusen. Dies resultierte in der Prozessierung und Präsentation des Antigens, was eine adaptive Immunantwort gegen das betreffende Antigen auslöste. [2] Für ihren möglichen Einsatz als Therapiemittel werden die Listerien ungiftig gemacht, das heißt in ihrer Wirkung als Krankheitserreger abgeschwächt. Diese sogenannten attenuated Listera monocytogenes (Listera at ) behalten dabei ihre Fähigkeit zur Zellinvasion bei, verlieren aber ihre Pathogenität, die krankheitsauslösende Wirkung auf Menschen. Im hier vorgestellten Beispiel sollen die gleichen Bakterien mit einem radioaktiven Stoff beladen werden. Diesen transportieren sie zu ihrem Zielort, den Metastasen, so dass er direkt im Gewebe dem Wachstum der Krebszellen entgegenwirkt. So ausgestattet sollen die Listerien Metastasen bekämpfen, denn vor allem das Streuen der bösartigen Zellen in andere Gewebe erschwert die Heilung einer Krebserkrankung. [3] Bauchspeicheldrüsenkrebs als Zielscheibe Das Pankreaskarzinom, das mit dieser Methode behandelt werden soll, ist die zehnthäufigste Tumorart, die vierthäufigste Krebstodesursache und weist die niedrigste Überlebensrate aller Krebserkrankungen auf, weshalb viele Wissenschaftler auf der Suche

2 nach einer erfolgreichen Behandlungsmethode sind. Da in den frühen Stadien der Erkrankung meist noch keine oder nur unspezifische Symptome auftreten, wird der Krebs erst spät erkannt, und die maligne Veränderung an der Bauchspeicheldrüse kann schwerwiegende Folgen nach sich ziehen. Als Behandlungsmöglichkeit steht an erster Stelle die operative Entfernung des Tumors und auch teilweise des umliegenden Gewebes, wenn noch keine Metastasen vorhanden sind. Nach einer Operation wird meist eine Chemotherapie begonnen, um das Rückfallrisiko zu minimieren. Liegen Metastasen vor, kann auch eine Strahlentherapie zum Einsatz kommen, bei der das befallene Gewebe, aber auch gesundes Gewebe, direkt bestrahlt wird. [4] Unter normalen Bedingungen werden Listeria at bereits nach drei bis fünf Tagen vom Immunsystem abgetötet. [2] Immunsuppressive Eigenschaften der Metastasen schützen diese jedoch vor dem humanen Immunsystem. Die Immunzellen können nicht in die Mikroumgebung der Pankreas-Metastasen vordringen, Listerien werden daher nicht bekämpft und befallen die Metastasen. So erweist sich die Stärke der immunsupprimierenden Metastasen im Zusammenhang mit einer Listerieninfektion als Schwäche, was als Grundlage für Behandlungsstrategien dient. Vorbereitung der Listerien für ihren Einsatz Zunächst muss das Humanpathogen Listeria monocytogenes zu Therapiezwecken modifiziert werden. Ein wichtiges pathogenitätsrelevantes Gen ist zum einen das hly-gen, das für Listeriolysin O kodiert, da es als porenbildendes Protein dem internalisierten Bakterium ermöglicht, das Phagosom zu verlassen, ehe es darin verdaut wird. [5],[6] Durch Ausschalten dieser Pathogenitätsfaktoren wird das Infektionsrisiko vermindert oder ganz unterbunden. Zum einen kann die kodierende Region des C-terminalen Endes von Listeriolysin O, das für die Bindung von Cholesterol in der Zellmembran benötigt wird, deletiert werden. Zum anderen können Mutationen in das episomale Regulator-Gen prfa und in weitere Sequenzbereiche des Listeriolysin O-Gens eingebracht werden. Die dabei entstandene Variante Listeria at kann nun für Behandlungszwecke verwendet werden. Um die Effizienz der Therapie zu erhöhen, wurden Antikörper gegen Listeria at hergestellt, die über einen Komplexbildner 188 Rhenium binden und damit zur Beladung von Listerien mit dem radioaktiven Isotop verwendet werden können. Als β-strahler mit einer kurzen Halbwertszeit von 16,9 Stunden wurde 188 Rhenium bisher als Tracer in der Nuklearmedizin verwendet, wobei es gebunden an ein Molekül aus dem Metabolismus am Stoffwechsel des Patienten teilnimmt und anhand der Strahlung verfolgt werden kann. Die ionisierende Eigenschaft der β-strahlung könnte bei Anreicherung zu zytotoxischen Effekten in den Metastasen als auch in gesundem Gewebe führen. [3] Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit der radioaktiven Listeria at Für den weiteren Einsatz der Listeria at als Therapeutikum müssen sicherheits- und funktionsrelevante Aspekte überprüft werden und gewährleistet sein. Zum einen muss nachgeprüft werden, dass Listeria at nur in den Zielzellen, den Metastasen der Pankreaskrebszellen, vorzufinden sind und sich nur dort vermehren. Zur Untersuchung eignet sich die stark tumorigene murine Panc-02-Zelllinie aus der Bauchspeicheldrüse, welche für ihre ausgeprägte Metastasierung bekannt ist. Nach Injektion der Panc-02- Zellen in Mäuse konnte festgestellt werden, dass die Krebszellen vor allem das Pankreasgewebe sowie den Bereich um die Pfortader der Leber infiltrierten. Die Mäuse entwickelten Tumore, die anschließend auch metastasierten. Dieses Maus-Modell wurde anschließend mit Listeria at infiziert. Nach drei Tagen wurden Gewebeproben und

3 Metastasen auf Listerien untersucht, um festzustellen, ob sich die Bakterien am potentiellen Wirkungsort, also den Metastasen, anreicherten. Eine mikroskopische Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Gewebe aus der Milz zeigte, dass sich kaum Bakterien in gesunden Zellen befanden (Abbildung 1). Die Milz ist für Listerieninfektionen besonders anfällig, da sie als Organ des lymphatischen Systems zahlreiche Monozyten besitzt, welche aufgrund ihrer phagozytierenden Eigenschaft von den Bakterien befallen werden können. Auch Tumorzellen beinhalteten wenige Bakterien. Im Gegensatz dazu befanden sich zahlreiche Listerien innerhalb der Metastasen, was die erfolgreiche Selektion durch die Immunsuppression bestätigte. Abbildung 1: Anwesenheit von Listeria in vivo in verschiedenen Geweben (Milz, Metastasen und Tumor) drei Tage nach der Injektion von Listeriaat. Listerien sind rot fluoreszenzmarkiert (Cy-3), die Zellkerne blau (DAPI) und das Zytoplasma grün (Alexa Fluor 488 Phallod). (aus [3] mit freundlicher Genehmigung der National Academy of Sciences (USA)) Die Testergebnisse von homogenisiertem Gewebe (Milz, Metastasen, Tumor) der infizierten Mäuse, welches auf Nährböden ausgestrichen wurde, um die Zahl der koloniebildenden Einheiten (KbE) der Listerien zu bestimmen, entsprachen den Ergebnissen der mikroskopischen Aufnahmen. Dadurch ist gewährleistet, dass radioaktives Material mittels Listerien vorwiegend zu den Metastasen transportiert wird. Neben den gesundheitlichen Risiken kann die Radioaktivität allerdings auch das verwendete System stören. Die Strahlung kann unter anderem den Vektor mit dem Regulatorgen prfa beschädigen, der für die Mobilität der Listerien nötig ist. Entsprechende Kontrollversuche ergaben, dass eine Aktivität von 200 µci (= 7,4x10 6 Becquerel) kaum einen Einfluss auf die Viabilität der Bakterien hatte und nur zu einer geringen Verminderung der Stabilität des Vektors führte. Die Infektionsrate stieg bei höherer Aktivität an. Wichtig für Therapiezwecke ist, dass der Antikörper-Radionuklid-Komplex lange genug am Bakterium gebunden bleibt, um seine Wirkung zu erzielen. Die Werte der Aktivität im bakterienfreien Überstand lagen bei dieser Methode im Bereich der Hintergrundstrahlung, was auf die hohe Affinität des Antikörpers zum Bakterium und eine feste Verankerung des 188 Rhenium zurückzuführen ist. Die Hypothese, dass sich mit radioaktiven Listeria at (RL) Pankreaskrebs-Metastasen gezielt abtöten lassen, wurde in einem weiteren Versuch getestet, dessen Schema in 2 dargestellt ist. Dafür wurden Mäuse zuerst mit Panc-02-Zellen infiziert, um metastasierende Tumore auszubilden. Nach 72 h wurden tägliche (Tag 3-9) Injektionen durchgeführt, welche jeweils radioaktiv markierte Listerien (Gruppe 1), unmarkierte Listerien (Gruppe 2), 188 Re ohne Listerien (Gruppe 3) und nur Salzlösung (Gruppe 4) enthielten. Nach einer Behandlungspause (Tag 10-15) erfolgte eine Wiederholung der Injektionen (Tag 16-21). Im Anschluss wurden die Mäuse eingeschläfert und deren Gewebe auf den Einfluss der Injektionen untersucht. Die Ergebnisse des Experimentes zeigten, dass im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Gruppe 3 und 4) die Anzahl der Metastasen bei Mäusen, die mit

4 Abbildung 2: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Wirkung radioaktiver Listeriaat auf Pankreaskrebs-Metastasen (Panc-02). A: Injektion von Panc-02-Zellen an Tag 0. B: Tägliche Injektion (Tag 3-9) von 10 4 KbE RL/ 500 µl Salzlösung (Gruppe 1); 10 4 KbE Listeria at / 500 µl Salzlösung (Gruppe 2); 200 µci 188 Re/ 500 µl Salzlösung (Gruppe 3) und 500 µl Salzlösung (Gruppe 4) mit anschließender Behandlungspause (Tag 10-15). C: Wiederholung der täglichen Injektion (Tag 16-19) wie in B. D: Einschläferung der Mäuse und Isolation von Gewebe und Metastasen zur Analyse. Listeria at behandelt werden, um ca. 50 % sinkt. Mit radioaktiven Listerien (RL) verringert sich die Anzahl um 90 %. Ein ähnliches Bild zeichnet sich sogar beim Tumorgewebe ab, wobei dessen Gewicht durch Listeria at um 20 % und durch RL um 64 % herabgesetzt wird. Der toxische Effekt beruht höchstwahrscheinlich auf dem Einfluss reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), welche sowohl durch die Infektion mit Listeria at als auch durch die Strahlung induziert werden. Listerien können auch extrazellulär durch ausgeschüttetes Listeriolysin O die Bildung von ROS innerhalb der Zelle induzieren. Reaktive Sauerstoffspezies oxidieren sämtliche Moleküle in einer Zelle, wie DNA, Proteine und Lipide, was zur Beeinträchtigung oder Neutralisation ihrer Funktion führt und den Zelltod zur Folge haben kann. Ein weiteres Experiment bestätigte die höhere Anfälligkeit von stark proliferierenden Metastasen auf ROS im Vergleich zu ruhenden Tumorzellen. Der letale Effekt auf Metastasen und der Unterschied zwischen Listeria at und RL sind zwar eindeutig, allerdings wurde auch Radioaktivität in Leber und Nieren nachgewiesen. Da der RL-Komplex eine große Stabilität aufweist, musste die erhöhte Radioaktivität auf der Anreicherung von Fragmenten abgetöteter Bakterien beruhen. Jedoch war kein Schaden an Leber und Nieren pathologisch nachweisbar. Ebenso fand keine Beeinflussung der Enzymaktivitäten in Leber und Nieren statt. [3] Diese Resultate bilden die Grundlage für klinische Studien in Hinblick auf die Behandlung von Pankreas-Metastasen. Und wie würden Sie jetzt reagieren, wenn Ihr Arzt zu einer auf Bakterien- und Radioaktivität-basierten Therapie rät? Durch die attenuated-form der Listerien lässt sich das Risiko des Krankheitserregers deutlich reduzieren, und durch die Kopplung an die Bakterien lässt sich auch die Radioaktivität gezielt zu den Metastasen transportieren, ohne gesundes Gewebe zu gefährden. Sicherheit auf mehreren Ebenen und die hohe Effizienz dieser Methode stellen eine klare Alternative zur herkömmlichen und weitaus unspezifischeren und toxischeren Chemotherapie dar und ermöglichen einen Ausblick auf eine wirkungsvolle Behandlung der lebensbedrohlichen Pankreaskrebs-Metastasen.

5 Take-Home-Messages: Pankreaskrebs stellt die vierthäufigste Krebsart dar, ist besonders durch die Metastasen-bildung sehr gefährlich und bedarf einer neuen effektiven Behandlungsmethode. Die immunsuppressiven Eigenschaften der Metastasen erlauben eine selektive Offensive mit invasiven Listerien. Abgeschwächte und damit nicht-pathogene Listerien Listeria at - reichern sich in Metastasen, nicht aber in gesundem Gewebe an. Mit radioaktiven Isotopen beladene Listeria at weisen eine hohe Effizienz bei der Bekämpfung von Pankreaskrebs-Metastasen auf, ohne dabei Nebenwirkungen aufzuzeigen. Kontakt: Der Artikel wurde im Rahmen des Studienprojektes HighChem des Fachbereichs Chemie der Technischen Universität Darmstadt verfasst (s. Woche 2). Die Autoren, Sabrina Jung und Sergej Franz, sind Studierende des Masterstudiengangs Technische Biologie an der TU Darmstadt ( sabrina.jung@gmail.com und sergej.franz@stud.tu-darmstadt.de). Schlauer Fuchs Unsere Schlaue-Fuchs-Frage zu diesem Beitrag lautete: Welches Radioisotop wurde bei den hier geschilderten Versuchen verwendet? Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Katja Schmitz ( schmitz@biochemietud.de). Literatur: [1] Milde-Busch, A., et al. (2010). "Zur Situation bei wichtigen Infektionskrankheiten in Deutschland." Epidemiologisches Bulletin 34/2010. [2] Kim SH, Castro F, Paterson Y, Gravekamp C (2009) High efficacy of a Listeria-based vaccine against metastatic breast cancer reveals a dual mode of action; Cancer Res 69(14): [3] Quispe-Tintaya W, Chandra D, Jahangir A, Harris M, Casadevall A, Dadachova E, Gravekamp C (2013): Nontoxic radioactive Listeria at is a highly effective therapy against metastatic pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences 110 (21), S [4] Adler, G., et al. (2007). "[S3-Guidelines "Exocrine pancreatic cancer" 2007]." Z Gastroenterol 45 (6): [5] Cossart P, Pizarro-Cerdá J, Lecuit M (January 2003). "Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes: functional mimicry to subvert cellular functions". Trends in Cell Biology 13 (1): [6] Robbins JR, Barth AI, Marquis H, de Hostos EL, Nelson WJ, Theriot JA (1999). "Listeria monocytogenes Exploits Normal Host Cell Processes to Spread from Cell to Cell". J Cell Biol 146 (6):