Feinwerktechnische Fertigung. Lichtmikroskopie

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1 Feinwerktechnische Fertigung Lichtmikroskopie

2 Inhaltsangabe 1. Vorwort 2. Mikroskopaufbau 3. Vergrößerung 4. Auflösungsvermögen 5. Kennzeichnung der Objektive 6. Kennzeichnung der Okulare 7. Kondensoren 8. Lichtfilter 9. Köhler sches Beleuchtungsprinzip 10. Kontrastierungsmethoden 11. Videomikroskopie 12. Wartung des Mikroskops 13. Literaturverzeichnis

3 1. Vorwort Das Auge kann jedes Objekt zwischen 20 cm und unendlich fokussieren. Näher als etwa 20 cm können wir an ein Objekt nicht herangehen. Die Folge ist ein verschwindend kleiner Sehwinkel, dadurch können wir keine Details erkennen. Die Situation ist ähnlich, wenn wir einen Kirchturm aus einer Entfernung von 300 Meter betrachten: die feinen Arbeiten der Steinmetze können wir aus einer so großen Entfernung nicht erkennen, weil die zugehörigen Sehwinkel zu klein sind. Die erste Hilfe zur Vergrößerung ist die Lupe. Der Effekt ist aber begrenzt. Mehr als eine 8 bis 10fache Vergrößerung lässt sich mit einer einzelnen Linse nicht realisieren. Wer noch mehr sehen will muss sich des Mikroskops bedienen. Die Mikroskopie liefert bei relativ geringem apparativem sowie zeitlichem Aufwand Informationen und Messwerte zur Lösung einer großen Anzahl von Problemen der Struktur-Eigenschaftskorrelation an Werkstoffen.

4 2. Mikroskopaufbau 1. Mikroskopstativ 2. Netzschalter und Lichtregler 3. Einbauleuchte 4. Einstellbare Leuchtfeldblende 5. Kondensorträger mit Höhenverstellung 6. Durchlichtkondensor mit Aperturblende 7. Präparattisch mit Objektführer 8. Objektiv 9. Objektivrevolver 10. Filterplätze im Durchlicht auf der Beobachtungsseite 11.Beleuchtungseinrichtung für die Auflichtfluoreszenz 12. Leuchte für die Auflichtfluoreszenz 13. Filterscheibe für die Auflichtfluoreszenz 14. Leuchtfeldblende für Auflichtfluoreszenz 15. Reflektorschieber für Auflichtfluoreszenz 16 Binokulartubus 17. Foto/TV Ausgang 18. Okulare 19. Fokussiertrieb 1. Einbauleuchte mit Kollektor 2. Leuchtfeldblende für Durchlicht 3. Aperturblende im Durchlichtkondensor 4. Durchlichtkondensor 5. Präparatebene 6. Objektiv 7. Pupillenebene des Objektivs 8. Tubuslinse 9. Okular 10. Höchstdruckleuchte mit Kollektor 11. Wärmeschutzfilter 12. Filter-/Absperrschieber 13. Leuchtfeldblende für Auflichtfluoreszenz 14. Filter Kombination mit Strahlteiler für Fluoreszenz 15. Foto-/TV-Anschluß Die mikroskopische Abbildung wird durch das optische System des Mikroskops vermittelt. Bei der Konstruktion wird darauf geachtet, dass die Lichtstrahlen sauber durch das Instrument geführt werden. Das Durchlichtmikroskop und das in der Handhabung einfachere Auflichtmikroskop werden im folgendem dargelegt. Im Mikroskop sind 2 verschiedene Gruppen von optischen Ebenen zu finden, die zusammengehören. Die erste Gruppe besteht aus:

5 1 = Lampenwendel 2 = Aperturblende 3 = Objektivpupille 4 = Pupille des Beobachtungsauges Sie definiert den Pupillenstrahlengang und ist für die Auflösung des Mikroskops bestimmend. Zur anderen Gruppe gehören A = Leuchtfeldblende B = Präparatebene C = Zwischenbild im Okular D = Netzhaut im Beobachterauge Dies sind die wichtigen optischen Ebenen im sogenannten Lukenstrahlgang. Hier wird das Bild sichtbar und die Bildbegrenzungen werden eingestellt. Innerhalb einer Gruppe werden die Ebenen stets ineinander abgebildet. 3. Vergrößerung Bei den modernen Mikroskopen verwendet man das ICS-Prinzip (Infinity Color-corrected System). Bei dieser Unendlichoptik wird eine Zwischenstufe verwendet. Das Objektiv entwirft ein Abbild in eine unendliche Entfernung, die Tubuslinse mit ihrer Brennweite formt aus

6 diesen parallelen Strahlen dann das Zwischenbild. Das Okular vergrößert wie eine Lupe das Zwischenbild. Da das Okular so angeordnet ist, dass das Endbild ebenfalls im Unendlichen entsteht, ist stets mit entspanntem, auf unendlich akkomodiertem Auge zu beobachten Es können bis zu 2000fache Vergrößerungen erreicht werden. Wir geben die Vergrößerung mit (x mal) an. Und berechnen sie mittels folgender Formel. V Mikroskop = V Objektiv * F Tubus * V Okular V Mikroskop - Gesamtvergrößerung des Mikroskops V Objektiv - Lupenvergrößerung des Objektivs F Tubus - Tubusfaktor (bei den meisten Geräten = 1) V Okular - Lupenvergrößerung des Okulars

7 4. Auflösungsvermögen Das Auflösungsvermögen des Mikroskops wird daran gemessen, bis zu welcher Grenze 2 kleine Objekte noch als getrennt gesehen werden. Das Auflösungsvermögen eines Objektives ist abhängig von der Wellenlänge des benutzten Lichtes und von der Objektivapertur. d= λ * 1,22 / A d - Abstand zweier getrennt wiedergegebener Bildpunkte λ - Wellenlänge des benutzten Lichtes A Apertur des verwendeten Objektivs Die Apertur ist der Sinus des halben Öffnungswinkels des Objektivs, multipliziert mit der Brechzahl n. A = n * sin α n - Brechzahl α - halber Öffnungswinkel des Objektivs Für Trockensysteme erreicht die Apertur maximal den Wert 0,95. Durch Anwenden eines Immersionsöls kann die Apertur auf 1,4 gesteigert werden. Bewährt hat sich Öl mit dem Brechungsindex n = 1,51, das genau an den Brechungsindex von Glas angepasst ist.

8 5. Kennzeichnung der Objektive Achromate: Apochromate: Planoptik: Für gelb bis grünen Spektralbereich korrigiert für alle Farben korrigiert Bildfeldwölbung beseitigt

9 6. Kennzeichnung der Okulare - Okulartypen Huygen sches Okular verändert den Korrektionszustand des vom Objektiv entworfenen Zwischenbildes nicht. Man verwendet sie zusammen mit Achromaten. Kompensationsokular verändert den Korrektionszustand, d. h. sie beheben die Restfehler der Apochromate. Man verwendet sie zusammen mit Apochromaten oder starken Achromaten. Orthoskopisches Okular ist ein verzeichnungsfreies Okular mit großem Bildfeld, dessen Feldblende vor dem optischen System liegt. - Kennzeichnung Korrektion A AK PK Allgemeinokulare ohne chromatische Vergrößerungsdifferenz Allgemeinokulare mit Kompensationswirkung. Sie haben chromatische Vergrößerungsdifferenz, die der Kompensierung der chromatischen Vergrößerungsdifferenz von Objektiven dient. Planokulare mit Kompensationswirkung in Verbindung mit Planobjektiven. Okularvergrößerung Feldzahl Die Feldzahl des Okulars gibt den Durchmesser des mit ihm überschaubaren Zwischenbildes in mm an. Dividiert man diese Zahl durch die Maßstabszahl des Mikroskop-Objektives, so erhält man die Größe des objektivseitigen Sehfeldes. Die errechnete Zahl muss zuvor noch durch den Tubusfaktor dividiert werden.

10 7. Kondensoren Der Kondensor ist das optische System(Sammellinsen), das in der Nähe des mikroskopischen Präparates angeordnet ist und zur Erzeugung eines beleuchteten Objektfelds mit einer der Apertur der Objektive angepasste Beleuchtungsapertur dient. Die Beleuchtung erfolgt nach dem Köhler schen Prinzip. 8. Lichtfilter Das zur Beleuchtung und Abbildung des mikroskopischen Objekts dienende Licht wird in seiner spektralen Zusammensetzung mit Hilfe von Lichtfiltern verändert und lässt sich damit den gegebenen Verhältnissen anpassen. So lassen sich unbefriedigende Bildwiedergabe und mangelhafte Bildkontraste durch Lichtfilter der verschiedensten Eigenschaften wesentlich verbessern. Über die Anwendung entscheiden die Filterfunktion und die Art der Erzeugung des gefilterten Lichtes. Die Kenntnis folgender Filtereigenschaften ist zur Auswahl von Lichtfiltern für den beabsichtigten Zweck erforderlich: - Wellenlänge, bei der der Transmissionsgrad des Filters sein Maximum erreicht - Bandbreite der durchgelassenen Strahlung - Filterfaktor, der die Verlängerung der Belichtungszeit nach Einschalten des Filters angibt. Sie ist abhängig vom Lichtverlust im Filter, der Verteilungstemperatur der Lichtquelle und der spektralen Empfindlichkeit des Aufnahmematerials Ausgewählte, für die messende Mikroskopie wichtige Wellenlängen Extremes Violett H 396,8nm Violett h 410,2nm Violettblau G 430,8nm Blau F 468,1nm Grün E 527,0nm Gelb D 589,3nm Rotorange C 656,3nm Rot A 760,0nm

11 9. Köhler sches Beleuchtungsprinip An die Beleuchtungsanordnung sind folgende Forderungen zu richten: - Die Leuchtdichte des Objekts muss hinreichend groß und gleichmäßig sein. - Der Beleuchtungslichtstrom muss so geführt werden, dass eine unnötige Erwärmung des Objekts und eine Störung des Bildes durch Reflexe nach Möglichkeit vermieden werden. - Die Aperatur und die Einfallsrichtung müssen verändert werden können, so dass für alle in Betracht kommenden Objekte die optimalen Beleuchtungsbedingungen hergestellt werden können. 10. Kontrastierungsmethode a) Wirkung der Blenden Die Aperturblende begrenzt den Öffnungswinkel des vom axialen Objektpunkt ausgehenden Strahlkegels. Wird die Blende etwas geschlossen, so verringert sich das Auflösungsvermögen des Gesamtsystems, aber der Kontrast der Probe wird stärker. Wird sie zu weit geschlossen, so treten an den Objekträndern Beugungserscheinungen auf. Die Leuchtfeldblende sollte immer so weit geöffnet werden, dass ihr Bild gerade am Sehfeldrand verschwindet. Ein weiteres Zuziehen bewirkt einen stärkeren Kontrast, aber das Mikroskopsehfeld wird nicht mehr ausgeleuchtet. b) Schräglichtbeleuchtung Durch diese Anwendung lässt sich die Auflösung des Mikroskops steigern und eine Kontraststeigerung wird erreicht. Durch Azimutfehler werden jedoch besonders im Grenzbereich zur Dunkelfeldbeleuchtung Strukturen vorgetäuscht, welche in Wirklichkeit nicht vorhanden sind. Der Azimut (Winkelausschnitt) beträgt für runde Blenden 90, halbrunde 180 und Zentralblenden 360.

12 c) Dunkelfeldbeleuchtung Für die Dunkelfeldbilderzeugung wird ausschließlich das vom Objektiv abgelenkte Licht verwendet. Diese Ablenkung kann durch Brechung, Beugung oder Reflexion erfolgen. Da bei mikroskopischen Objekten die Beugung die ausschlaggebende Rolle spielt, leuchten alle feinen Strukturen und Kanten flächenhafter Objekte auf dunklem Grund hell auf. Bei der Auflichtdunkelfeldbeleuchtung erscheinen die natürlichen Farben der Gefügebestandteile, während sie bei der Hellfeldbeleuchtung durch Reflexe und Absorption verfälscht werden. d) Polarisationsmikroskopie Werden optisch anisotrope Stoffe außerhalb ihrer optischen Achsen mit linear polarisierten Licht bei gekreuzten Polaren durchstrahlt, so ergeben sich bei einer Probendrehung entweder Aufhellung oder Abdunklung oder sie erscheint trotz exakt gekreuzter Polare diffus mehr oder weniger hell. Diese durch Doppelbrechung hervorgerufene Erscheinung kann durch die unterschiedlichen Brechungsindizes, in den einzelnen Raumrichtungen im Werkstoff erklärt werden. e) Phasenkontrastmikroskope Unterscheiden sich die zu untersuchenden Proben nur durch ihre Dicke oder ihre Brechzahl so spricht man von Phasenobjekten. Die in der Probe entstandenen Phasenunterschiede muss man für das Auge in sichtbare Amplitudenunterschiede umwandeln. Dies erreicht man durch Phasenplättchen, die dann die Probe kontrastreich sichtbar machen. f) Differentieller Interferenzkontrast Die durch ein Phasenobjekt deformierte Wellenfront wird in 2 gleiche, kohärente Teilstrahlen aufgespaltet. Die Teilwellen erhalten einen kleinen, kontinuierlich einstellbaren Gangunterschied, der zu einer veränderbaren Kontrastierung führt. Die Bildinterpretation ist schwieriger als beim Phasenkontrast. e) Fluoreszenzmikroskopie Viele organische Stoffe weisen eine Primärfluoreszenz auf. Zur Kontrastierung müssen diesen Werkstoffen Fluorochrome zugemischt werden. Als sehr nützlich bewährte sich für die Untersuchung die Quecksilberhöchstdrucklampe (λ=465 nm).

13 11. Videomikroskopie Bei der Videomikroskopie sollte man als erstes eine Referenzmessung mittels eines Objektmikrometers machen, um so die genaue Vergrößerung zu bestimmen. In einem großen Umfang werden CCD- Kameras mit Videoprintern verbunden, weil diese Kombination eine schnelle und saubere Alternative zur Sofortbildfotografie bietet. Es können zudem beim Mikroskop-Fehrnsehen mehrere Zuschauer mitbeobachten. 12. Wartung des Mikroskops - Die Objektive dürfen niemals mit Alkohol gereinigt werden, da dieser die Linsenverkittung angreift. Die Reinigung erfolgt mit Toluol. - Objektive nur an dem äußeren gerändelten Revolverring anfassen - Die Mikroskopstative können mit Waschbenzin gereinigt werden - Alle Mikroskopöffnungen sind durch Staubschutzkappen oder Schieber zu schließen - Zubehörteile immer in die dafür vorgesehenen Kästen zurücklegen oder auf ein weiches Tuch ablegen - Bei längerer Nichtbenutzung mit einer Staubschutzhülle bedecken. - Niemals Gewalt anwenden 13. Literaturverzeichnis - Metallographie, Schumann ISBN Präparative und mikroskopische Verfahren in der Materialprüfung, F. Jörg, ecomed ISBN Mikroskopieren von Anfang an, H. G. Kapitza, Zeiss - Lichtmikroskopie, Dr. Jörg Trempler, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg