B i o c h e m i s c h e s B l o c k p r a k t i k u m

Transkript

1 B i o c h e m i s c h e s B l o c k p r a k t i k u m N U K L E I N S Ä U R E N WiSe 2010/11 Vorlesung: Praktikumsbetreuer: Jens Peter Fürste Katja Behling, Frank Kuppler, Holger Sieg, Petra Römer

2 ALLGEMEINE HINWEISE... 2 GENERELLER AUFBAU VON PROTOKOLLEN IM PRAKTIKUM:... 3 SICHERHEITSHINWEISE... 5 FORMELSAMMLUNG... 6 HERSTELLEN EINER SO GENANNTEN "STAMMLÖSUNG"... 6 PUFFER UND LÖSUNGEN... 7 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI-ZELLEN... 8 EINLEITUNG... 8 ZIEL... 9 DURCHFÜHRUNG... 9 AUSWERTUNG: RESTRIKTIONSANALYSE UND AGAROSE-GELELEKTROPHORESE RESTRIKTIONSVERDAU AGAROSE-GELELEKTROPHORESE POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) ANALYSE DES VNTR LOCUS DIS EINLEITUNG AUFGABENSTELLUNG DURCHFÜHRUNG PCR AUS GENOMISCHER DNA AUSWERTUNG LITERATUR RIBONUKLEINSÄUREN ISOLIERUNG VON 70S RIBOSOMEN AUS ESCHERICHIA COLI DC AUFTRENNUNG DER 70S RIBOSOMEN IN IHRE 30S UND 50S UNTEREINHEITEN DURCH SACCHAROSE- DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION RNA-ISOLIERUNG DURCH PHENOLEXTRAKTION AGAROSEGELELEKTROPHORESE RIBOSOMALER RNA S HINWEISE ZUR AUSWERTUNG

3 Nukleinsäuren Allgemeine Hinweise Um eine erfolgreiche Teilnahme an diesem Praktikum zu gewährleisten, sollten Sie die folgenden Regeln beachten: 1) Während der gesamten Praktikumszeit besteht Anwesenheitspflicht. Von den Betreuern wird eine Anwesenheitsliste geführt. 2) An jedem Praktikumstag findet vor dem Versuchsbeginn ein Seminar zum Verständnis des experimentellen Teils und zur Sicherheitsbelehrung statt. Die Teilnahme ist unbedingte Voraussetzung für die Versuchsdurchführung. 3) Sie arbeiten während der gesamten Praktikumszeit in 2er Gruppen. Die Einteilung erfolgt am ersten Praktikumstag. 4) Die Mittagspause wird von den einzelnen Gruppen nach Rücksprache mit den Betreuern durchgeführt. 5) Ein USB-Stick pro Gruppe sind von den Praktikumsteilnehmern mitzubringen oder Laptop bzw. andere technische Utensilien, die zum Auswerten und Speichern von Daten dienen können. 6) Jeder Praktikumsteilnehmer führt sein eigenes Protokoll. 7) Der Protokollab- und Rückgabetermin muss eingehalten werden. Es werden nur Protokolle zusammen mit dem Testatheft angenommen. 2

4 Nukleinsäuren Genereller Aufbau von Protokollen im Praktikum: Name des Protokollanten und des Versuchspartners, sowie der Gruppennummer Datum der Versuchsdurchführung Titel des Versuches Einleitung: Hier bitte nur kurz das Ziel des Versuches formulieren. Durchführung: Der Ablauf des Versuches ist hier darzustellen. Dabei handelt es sich um die genaue Darstellung aller Einzelheiten, wie - Reihenfolge der verwendeten Methoden, - genaue Angabe der verwendeten Reagenzien mit Namen, Konzentration, evtl. kinet. Daten und Menge (oft reicht hierfür der Verweis auf das Skript) Wenn Abweichungen vom Skript auftraten oder es nicht angegeben war, muss die tatsächliche Durchführung exakt angegeben werden. Ergebnisse: Übersichtliche Anordnung aller erhaltenen Resultate. Daten sollten in Tabellen oder Kurven dargestellt werden, die mit einem Titel versehen werden. Bei graphischen Darstellungen ist daneben auf vernünftige Maßstäbe, Achsenbeschriftung und Angabe der Einheiten zu achten. Für Rechnungen reicht die Angabe der verwendeten Formel mit einem exemplarisch gerechneten Wert. Dabei ist darauf zu achten wie viele Stellen noch als signifikant angesehen werden können. Gelbilder werden graphisch eingefügt und erhalten ebenfalls einen Titel. Die Auftragung auf das Gel soll anhand einer genauen Beschriftung der Bahnen/Spuren erkennbar sein. An ausgewählte Markerbanden sollte die dazugehörige Länge/Masse geschrieben werden. Das am Ende erhaltene Ergebnis ist abschließend in einem Satz zu formulieren. Diskussion: Hier erfolgt die Interpretation und Beurteilung der Ergebnisse. Was für Aussagen kann ich über das untersuchte System treffen? Werden meine Erwartungen bestätigt? Stimmen die Ergebnisse mit bekannten Literaturwerten überein? Welche möglichen Gründe könnten ein Abweichen vom Literaturwert bzw. von der Erwartung erklären? 3

5 Nukleinsäuren Literatur: Bei der Verwendung von Literatur muss diese korrekt zitiert werden. Entweder geschieht dies im Text selbst oder gesondert am Ende des Protokolls. Dann muss allerdings im Text mit Fußnoten auf die Literaturangabe verwiesen werden. Zitiert wird im Allgemeinen folgendermaßen: Autor/-en, Titel des Artikels/des Buches, Verlag/Zeitschrift, Auflage/Ausgabe, Seiten, Erscheinungsjahr z.b. für einen Artikel: Watson, J.D.; Crick, F.H.C., Genetic Implications of the Structure of Deoxyribonucleic Acid, Nature 171, S , 1953 für ein Buch: Saenger, W., Principles of Nucleic Acid Structure, Berlin/Heidelberg/New York Springer, 1. Aufl., S. 122, 1984 Anhang: Generell gilt, dass ein Anhang möglichst zu vermeiden ist. Nur wenn es sich um eine sehr große Menge (einige Seiten) an tabellarischen Daten oder Datenbankausdrucke handelt, macht es Sinn sie aufgrund der Übersichtlichkeit in den Anhang zu verbannen. Auf den Anhang muss im eigentlichen Protokoll verwiesen werden, ansonsten gilt er als nicht vorhanden. Außerdem sind Punkte im Anhang besonders hervorzuheben, auf die an anderer Stelle eingegangen wird. Es sollte ein Rand freigelassen werden, und die Seiten nummeriert werden. Bei computergefertigten Protokollen ist ein Zeilenabstand von mindestens 1,5 Zeilen einzuhalten. Die Protokolle sind von jedem individuell anzufertigen. Dies gilt auch für Tabellen und graphische Darstellungen. Allgemein sollte ein Protokoll so kurz wie möglich aber so lang wie nötig sein und in einem wissenschaftlichen Wortstil verfasst sein. 4

6 Nukleinsäuren Sicherheitshinweise 1 Befolgen Sie die Anweisungen der Betreuer! 2 Kein Essen, Trinken, Rauchen, Schminken etc. im Labor! 3 Alle gesundheitsschädlichen Chemikalien wie Phenol, abs. Ethanol, Ethidiumbromid etc. werden unter dem Abzug benutzt! 4 Tragen Sie Kittel, Handschuhe! 5 Kittel verbleibt im Praktikumsraum. 6 Der Umgang mit Phenol nur mit Schutzbrille! 7 Achten Sie auf die Abfallentsorgung! 8 Agarosegele enthalten zur DNA-Färbung Ethidiumbromid (EtBr). EtBr ist giftig, kanzerogen und teratogen. Tragen Sie Nitril-Handschuhe! Kleckern Sie nicht! Fassen Sie mit kontaminierten Handschuhen nichts an! Denken Sie an Ihre Kollegen! Spitzenkästen sind selbständig aufzufüllen und den Betreuern zum Autoklavieren zu übergeben. Nach jedem Tag wird der Platz aufgeräumt. 5

7 Nukleinsäuren Formelsammlung Herstellen einer so genannten "Stammlösung" Prinzipielles Vorgehen und allgemeine Formeln 1. Zusammengeben sämtlicher Komponenten in den jew. Mengen 2. Auffüllen mit bidest. H 2 O bis fast auf das Endvolumen 3. Festsubstanzen lösen; Lsg. durchmischen. 4. Einstellen des jew. ph (falls erforderlich) 5. Auffüllen auf das betreffende Endvolumen der Lösung mit bidestilliertem Wasser M Molarität Masse m Molekul arg ewicht MW m g / l M MW Molarität = Stoffmengenkonzentration [mol/l] Masse [g] MW = Molekulargewicht [g/mol] Bei Flüssigkeiten (z. B. ß-Mercaptoethanol) muss die Dichte berücksichtigt werden: Masse m Dichte V Volumen V m Dichte Masse V [g/ml] [g] [ml] Herstellen eines Puffers aus Stammlösungen: V Stammlösung V M= Molarität [mol/l] SollPuffer M M SollPuffer Stammlösung Konzentrationserhöhung einer Komponente in einer Lösung: V x V 0 M M soll Stammlösung Mist M soll V x = hinzuzufügendes Volumen einer Stammlösung 6

8 Nukleinsäuren V 0 M soll M ist M Stammlösung = Ausgangsvolumen = Molarität der Lösung nach dem Einstellen der Konzentration = Molarität der Lösung vor dem Einstellen der Konzentration = Molarität der Stammlösung Puffer und Lösungen TE-Puffer 20 mm Tris-HCl, ph 8,0 1 mm EDTA Restriktionspuffer (einfach konzentriert) 50 mm Tris-HCl, ph 8,0 100 mm Natriumchlorid 10 mm Magnesiumchlorid DNA-Probenpuffer 70 % (v/v) Glycerin 2 x TAE, ph 8,3 0,1 % (w/v) BPB (Bromphenolblau) 10 x TAE 400 mm Tris-acetat, ph 8,3 10 mm EDTA 10 x TBE Puffer 1000 mm TrisBase 850 mm Borsäure 10 mm EDTA, ph 8,3 TBE DNA Probenpuffer 50 % (v/v) Glycerin 0,05 % (v/v) BPB (in TBE) TMA I 10 mm Tris-HCl, ph 7,8 bei Raumtemperatur 10 mm MgCl 2 30 mm NH 4 Cl 6 mm ß-Mercaptoethanol (21 µl in 50 ml) TMA II (wie TMA I, aber mit 0,3 mm MgCl 2 ) 7

9 Plasmidisolierung Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli-Zellen Einleitung Plasmide sind extrachromosomale, ringförmige DNA-Sequenzen bei Mikroorganismen, die keine essentielle Funktion haben. Allerdings nehmen sie eine bedeutende Stellung in der Biochemie ein, z.b. bei der Klonierung. Basis für eine Klonierung ist ein Plasmid, welches bestimmte Eigenschaften beherbergen muss. Diese wurden für die Wissenschaft künstlich zusammengestellt, so dass die wichtigsten genetischen Elemente, wie Antibiotikaresistenz, Multiple cloning site, Promotor usw. in einem ringförmigen DNA-Molekül vereint sind. Solche DNA-Konstrukte, die sich von Plasmiden ableiten, werden auch als Vektoren bezeichnet. Plasmide bzw. Vektoren können allerdings auch nur als shuttle benutzt werden, d.h. sie dienen lediglich der Vermehrung eines DNA-Moleküls. Hier werden zwei Verfahren gewählt, welche es ermöglichen, schnell und im analytischen Maßstab - Plasmid-DNA aus E.coli-Zellen zu gewinnen. Dabei wird die chromosomale DNA besonders schonend in einem Aussalzungsschritt möglichst quantitativ entfernt. Die darauffolgende Reinigung der Plasmid-DNA erfolgt einerseits über eine Ionenaustauschchromatographie und andererseits über verschiedene Fällungs- und Extraktionsschritte. Die resultierende hochreine Plasmid-DNA kann für Restriktions- Analysen, Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung verwendet werden. Beide Methoden der Plasmidaufarbeitung sind Gegenstand dieses Praktikums. Methode 1 Die Bakterienzellen werden mit Hilfe der alkalischen Lyse aufgeschlossen, die Zellwand unter Mitwirkung des Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) solubilisiert und ihre Proteine denaturiert. Dazu werden die Zellen in einem Puffer resuspendiert, der leicht hypotonische Bedingungen im Vergleich zum Zellinneren gewährleistet. Hier soll die chromosomale DNA nicht isoliert, sondern möglichst quantitativ in einem Fällungsschritt entfernt werden. Dafür wird die Löslichkeit der chromosomalen DNA durch Erniedrigung des ph-wertes und Aussalzung herabgesetzt. Die vorhandene Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) dient dem Schutz der Plasmid-DNA vor DNasen. DNasen brauchen für die enzymatische Aktivität Magnesium-Ionen, die durch EDTA komplexiert werden. Die Reinigung der Plasmid-DNA erfolgt durch Bindung an einer Anionenaustauschermembran. Dies ist fertig gepackt in Minisäulen kommerziell von MACHERY-NAGEL erhältlich. Mittels Waschen der Membran, werden RNA und andere Verunreinigungen entfernt. Durch Erhöhung des ph-wertes kann die DNA von der Anionenaustauscher-Säule eluiert werden. Methode 2 Die Bakterien werden hier nicht durch alkalische Lyse aufgeschlossen, sondern durch einen Puffer der das Enzym, Lysozym enthält. Lysozym ist eine Glykosidase, welche die glykosidische Bindung im Murein, auch Peptidoglycan genannt, hydrolysiert. Weitere 8

10 Plasmidisolierung Komponenten in diesem Puffer sorgen für ein Platzen der Zelle und einer Solubilisierung der Membran. Die anschließende Zentrifugation sorgt für die Abtrennung von Zelltrümmern. Die Phenol/ Chloroform Extraktion separiert Proteine von Nukleinsäuren. Durch eine abschließende Fällung mit Salz und Alkohol wird die Plasmid DNA einerseits gereinigt und andererseits aufkonzentriert. Die resultierende DNA wird entweder in Wasser (bidest.) oder in einem Puffer aufgenommen und bei 20 C aufbewahrt. Ziel Plasmid-DNA soll aus E.coli Zellen auf zwei verschiedene Arten isoliert und aufgereinigt werden, so dass diese für den Restriktionsverdau eingesetzt werden kann. Dabei sollen beide Methoden gegenüber gestellt werden. Durchführung Methode 1 Materialien: A1 Puffer (Resuspensions-Puffer) 50 mm Tris / HCl ph 8,0 10 mm EDTA, RNasen A2 Puffer (Lysis Puffer) 200 mm NaOH 1,0 % SDS (w/v) A3 Neutralisationspuffer 3,2 M Kaliumacetat / Essigsäure ph 5,5 A4 Waschlösung Salz und 50% Ethanol AE Puffer (Elutionspuffer) 5 mm Tris/HCl ph 8,5 9

11 Plasmidisolierung Arbeitsanleitung Methode 1: Da nur wenige Tischzentrifugen für alle zur Verfügung stehen, sollte während der Plasmidisolierung parallel gearbeitet werden und die Zentrifugationsschritte von allen gemeinsam ausgeführt werden. 2 x 1,5 ml einer über Nacht in Ampicillin-haltigem Medium gewachsenen E.coli-JM109 Zellkultur wurden bereits nacheinander in ein Eppendorfgefäß überführt und zwecks Sedimentierung zentrifugiert (Tischzentrifuge, Höchstgeschwindigkeit für 1 min, 4 C) Der Überstand wurde mit einer Pipette sorgfältig abgenommen und verworfen Ab hier geht es los: das Zellpellet wird in 250 µl Resuspensions Puffer A1 (Lsg. 1) durch auf- und abpipettieren vollständig resuspendiert es werden 250 µl Lysis Puffer A2 (Lsg. 2) (Lysis der Zellen!) hinzupipettiert das geschlossene Eppendorfgefäß wird 6-8-mal über Kopf geschüttelt (mit Deckel nach unten und zurück, nicht vortexen!!!) man lässt das Lysat 5 min bei Raumtemperatur stehen, bis zur kompletten Lyse (es sollte klar werden) zu dem Lysat werden 300 µl Neutralisationslösung A3 hinzupipettiert und 6-8 mal über Kopf geschüttelt es folgt eine Zentrifugation zwecks Sedimentierung von Proteinen und chromosomaler DNA in der Tischzentrifuge bei: Höchstgeschwindigkeit ( rpm) für 10 min der klare Überstand (Plasmid-haltig) wird ohne feste Bestandteile auf die Säule aufgetragen es erfolgt eine Zentrifugation bei: Höchstgeschwindigkeit ( rpm) für 1 min. das Tube, in dem die Säule steckt wird entleert und die Säule erneut in das Tube platziert es werden 600 µl Waschlösung A4 auf die Säule gegeben und für 1 min bei rpm zentrifugiert wieder das Tube entleeren und nochmals 2 min bei rpm zentrifugieren, um den Restalkohol zu entfernen die Säule in ein neues Eppi stellen, 50 µl Elutionspuffer AE pipettieren, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren und 1 min bei rpm zentrifugieren. weiter siehe unten Analyse 10

12 Plasmidisolierung Methode 2 Material: STETL Puffer: 8 % Sucrose, 0,5 % Triton X-100, 50 mm Tris/HCl (ph 8), 50 mm EDTA (ph 8), 0,5 mg/ml Lysozym TE Puffer: 10 mm Tris/HCl ph 7,5, 1 mm EDTA, 1 mg/ml RNase Isopropanol Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) Chloroform 8 M Ammoniumacetat Ethanol absolut Bitte auf richtige Entsorgung der Abfälle achten! Betreuer befragen! Arbeitsanleitung Methode 2: das vorbereitete Zellpellet wird in 200 µl STETL Puffer vollständig resuspendiert Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 3-5 min das Tube wird für 30 sec. in kochendes Wasser ( C) gestellt anschließend, Zentrifugation in der Tischzentrifuge: rpm, 15 min, RT C; es ist sehr hilfreich, wenn man die Eppendorfgefäße so hineinstellt, dass die Deckelgelenke nach außen zeigen. Das Sediment setzt sich an dieser Außenseite ab. der Überstand wird in ein neues Eppendorfgefäß überführt und 200 µl Isopropanol zugegeben, kurz schwenken und sofort zentrifugieren: 15 min, rpm, 4 C, (das Pellet (Sediment) ist mitunter schwer zu sehen) der Überstand wird vorsichtig abgenommen und verworfen, das Pellet wird in 250 µl TE-Puffer aufgenommen, kurz auf- und abpipettieren, um das Pellet zu lösen ab hier unter dem Abzug arbeiten, mit Schutzbrille und Handschuhen es erfolgt die Extraktion mit 1 Vol. (ca. 250 µl) Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1), 1 min stark vortexen und 5 min bei Höchstgeschwindigkeit, RT C zentrifugieren die wässrige obere Phase wird sorgfältig abgenommen und in ein neues 1,5 ml Eppi überführt, die organische untere Phase kann verworfen werden 1 Vol. Chloroform (ca. 200 µl) zur wässrigen Phase geben und kurz vortexen und kurz anzentrifugieren (15 sec rpm) 11

13 Plasmidisolierung obere wässrige Phase wiederum abnehmen und mit 150 µl 8 M Ammoniumacetat und 1 ml Ethanol (absolut = 99%) versetzen, vortexen Inkubation 15 min auf Eis, danach Zentrifugieren: 20 min, rpm, 4 C der Überstand wird abgenommen das Pellet wird wiederum zentrifugiert: Höchstgeschwindigkeit 20 sek Ethanolreste werden mit einer 200 µl-pipette vollständig entfernt. Das Pellet wird bei offenem Eppi-Deckel kurz (!) luftgetrocknet. das Pellet wird durch mehrfaches Vortexen in 45 µl Bidest gelöst. Anschließend wird die Lösung kurz zentrifugiert. Analyse es werden 4 µl Probe mit 76 µl Bidest verdünnt (1:20 Verdünnung) und zur Konzentrationsbestimmung die Absorption bei 260 nm und 280 nm gemessen (Nukleinsäuren haben bei 260 nm ein Absorptionsmaximum, wobei doppelsträngige DNA unverdünnt A 260 = 1 einer DNA-Menge von 50 ng/µl entspricht. es wird das Verhältnis (Ratio) der Absorptionswerte von 260 nm zu 280 nm berechnet. Dieses gibt Auskunft über die Reinheit der erhaltenen Nukleinsäuren, da Proteine aufgrund der aromatischen Aminosäuren bei 280 nm absorbieren. Das Verhältnis 260 nm/280 nm sollte daher im Bereich von 1,7 bis 1,9 liegen. es werden 7 Eppendorfgefäße mit 1 bis 7 beschriftet (Vorbereitung für den Restriktionsverdau) es werden sechs ng-portionen einer Isolationsmethode der Wahl in die vorbereiteten Eppendorfgefäße aufgeteilt (1 bis 6) und mit Wasser (bidest) auf 17 µl ergänzt. Ein entsprechendes Aliquot der anderen Methode wird in das 7. Tube pipettiert. Die Proben werden bis zur anschließenden Restriktionsanalyse auf Eis gehalten. Auswertung: Vergleichen Sie beide Methoden in Reinheit, Menge, eventuell Vor- und Nachteile! 12

14 Restriktionsanalyse Restriktionsanalyse und Agarose-Gelelektrophorese Restriktion, ist das Schneiden von DNA-Molekülen mit Enzymen. Diese Enzyme bezeichnet man als Restriktionsenzyme oder auch als Restriktionsendonukleasen. Sie spalten die 3'-Zucker-Phosphatbindung in beiden Polynukleotidketten der doppelsträngigen DNA- Moleküle. Man unterscheidet aufgrund des Spaltverhaltens drei Klassen, von denen nur die Restriktionsenzyme der Klasse II eine spezifische Sequenz auf einem doppelsträngigen DNA- Molekül erkennen und auch an dieser Stelle schneiden. So entstehen spezifische DNA- Fragmente von definierter Länge und Basensequenz. Je häufiger eine Erkennungssequenz für ein Enzym vorhanden ist, desto mehr Fragmente entstehen. Restriktionsenzyme sind wichtige Hilfsmittel des Molekularbiologen, vor allem bei der Klonierung und zur Gen-Kartierung. Weiterhin finden sie Anwendungen beim RFLP (Restriktions-Fragment-Längen- Polymorphismus) und beim Southern Blot. Bei allen Anwendungen entstehen entsprechende Fragmente, die mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden können. Restriktionsverdau Ziel: Das zuvor isolierte Plasmid wird mit verschiedenen Restriktionsenzymen bzw. - gemischen in Fragmente definierter Länge geschnitten. Die unterschiedlichen Fragmente erlauben es, ein Modell einer Restriktionskarte für dieses Plasmid zu erstellen. zu den auf Eis gehaltenen Proben 1 7 werden jeweils 2 µl Restriktionspuffer hinzugegeben, kurz vortexen schließlich wird von den Betreuern je 1 µl der vorbereiteten Restriktionsenzym- Gemische der folgenden Kombinationen pipettiert: 1: HindIII und ScaI 2: PvuII und ScaI 3: PvuII und HindIII 4: HindIII, PvuII und ScaI 5: HindIII 6: ungeschnittenes Plasmid Methode 1 (keine Zugabe von Enzym) 7: ungeschnittenes Plasmid Methode 2 (keine Zugabe von Enzym) die Spaltungsansätze sind zwecks Sammlung kurz zu zentrifugieren sie werden 60 min im 37 C-Heizblock oder -Wasserbad inkubiert danach wird die Inkubation mit je 2 µl DNA-Probenpuffer ( DNA-PP ) gestoppt Agarose-Gelelektrophorese Die Elektrophorese findet unter nicht denaturierenden Bedingungen statt. Ein Gel ist ein komplexes Netzwerk aus polymeren Molekülen. DNA-Moleküle sind negativ geladene Moleküle und wandern unter Einfluss eines elektrischen Feldes durch das Gel. Dabei hängt 13

15 Restriktionsanalyse die Wanderungsgeschwindigkeit von der Größe der Moleküle ab. Ein kleines DNA-Molekül kann seinen Weg durch das Gel leichter finden und wandert daher schneller als ein großes Molekül. Die Geschwindigkeitsraten von DNA-Molekülen sind umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer relativen Molekülmasse M r. Stellt man die Mobilität graphisch dar, so erhält man eine Gerade, wenn man die Fragmentlängen oder die M r gegen das Reziproke der Beweglichkeit halblogarithmisch aufträgt. Mit Hilfe eines Größenstandards können die Längen der Fragmente ermittelt werden. Mit dieser Methode können nicht nur die DNA- Fragmente verschiedener Längen, sondern auch die verschiedenen molekularen Formen eines DNA-Moleküls aufgetrennt werden. Die superhelikale und relaxierte zirkuläre Form sowie die linearisierte Form eines DNA-Moleküls besitzen verschiedene Wanderungsgeschwindigkeiten. Die Agarose besteht aus linearen Polymerketten mit der sich wiederholenden Disaccharid- Grundeinheit D-Galactose/ 3,6-Anhydro-L-Galactose. Bei der Gelformung kommt es zu Wasserstoff-brückenbindungen zwischen den Ketten. Ethidiumbromid ist kanzerogen! Deshalb beim Umgang mit der Ethidiumbromidlösung und dem Ethidiumbromid-haltigen Gel Nitril-Handschuhe tragen. Die Gele werden unter dem Abzug gegossen. Die Abfälle werden gesondert gesammelt. Wendet Euch bitte an die Betreuer, wenn Gele und Flüssigkeiten entsorgt werden müssen. Zubehör für eine Gruppe: 1 Gelformer ( Schlitten, 6,5 cm x 10 cm) 2 ca. 15 cm lange Klebeband-Streifen 1 Halterung mit Taschenformer ( Kamm mit acht Taschen, 1 Zahn ist 1 mm dick und 5 mm breit) 1 kleiner Erlenmeyer-Kolben 1 horizontale Flachgel-Elektrophoresekammer mit Elektrophoresekabeln 1 Netzgerät, welches mit einer weiteren Gruppe gemeinsam benutzt wird Jede Gruppe setzt 350 ml 1 x TBE an beide Seiten des Schlittens werden mit Tesaband sorgfältig gemäß Anleitung abgeklebt der Schlitten wird auf eine ebene Fläche gelegt und die Kammhalterung mit Kamm gemäß Anleitung aufgesetzt 14

16 Restriktionsanalyse jede Gruppe stellt 50 ml 1,0 %iges (w/v) Agarosegel in einem 100 ml- oder 250 ml- Erlenmeyerkolben her: 0,5 g Agarose in 50 ml 1 x TBE den Flüssigkeitspegel am Erlenmeyerkolben markieren solange in der Mikrowelle erhitzen (kein Metall in die Mikrowelle!), bis eine klare, schlierenfreie Agaroselösung entstanden ist mit H 2 O bidest auf 50 ml auffüllen, wenn es nötig ist nochmals in der Mikrowelle zum Kochen bringen und den Betreuern präsentieren, die beurteilen, ob die Agarose schon vollständig gelöst ist nach kurzem Abkühlen, 2,0 µl der 10 mg/ml Ethidiumbromidlösung hinzupipettieren, welche durch Schwenken im Gel verteilt wird sofort wird das Agarosegel in den vorbereiteten Schlitten gegossen und der Kamm eingesteckt (evtl. entstandene Luftblasen werden mit einer Pipettenspitze an die Seiten geschoben) die Gellösung braucht ca. 20 min zum Erstarren dann wird der Kamm möglichst senkrecht gezogen und die Tesaband-Streifen entfernt (blaue Handschuhe tragen!) das Gel wird mit Schlitten in die Elektrophoresekammer gelegt und diese soweit mit 1 x TBE gefüllt, bis das Gel bedeckt ist es wird in folgender Weise aufgetragen: Probe Marker Volumen 5 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl keine Zugabe von DNA Probenpuffer nötig sind alle Proben aufgetragen, wird der Deckel der Kammer aufgesetzt und die Elektrophoresekammer an das Netzgerät angeschlossen (dabei muss das Netzgerät noch außer Betrieb sein!). Die DNA soll auf die Anode (also den +-Pol) zuwandern! die Elektrophorese wird gestartet, wenn beide Elektrophoresekammern angeschlossen sind; sie findet bei V pro Kammer statt und dauert ca h 15

17 Restriktionsanalyse sie ist zu beenden, kurz bevor der dunkelblaue Farbstoff (Bromphenolblau) aus dem Gel wandert. Dabei wird zuerst das Netzgerät abgeschaltet, dann die Kabel vom Netzgerät abgenommen der Schlitten wird aus der Kammer gehoben (Handschuhe tragen!) die Gele werden unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 302 nm fotografiert Anmerkungen Muss man noch weitere Elektrophoresen fahren (z.b. für PCR), so kann der Puffer in den Kammern aufgehoben und mehrfach wiederverwendet werden. Um sicher zu gehen, dass man nicht an die Kapazitätsgrenze des Puffers gerät, wird vor der nächsten Elektrophorese etwas (ca. ¼) Puffer in den vorgesehenen Becherglas unter dem Abzug dekantiert und mit frischem Puffer aufgefüllt. Nach der letzten Elektrophorese sollen Schlitten, Kammhalterungen mit Kämmen, Schaumstoffstopfen und Elektrophoresekammern unaufgefordert und sauber bei uns ankommen. Plastik- und Plexiglaszubehör darf nur mit Wasser, nicht mit organischen Lösungsmitteln und Säuren, gesäubert werden. Auch die Netzgeräte sind wieder zurück zu bringen. Zur Auswertung Erkundigen Sie sich, aus welchen Bakterien die Enzyme isoliert werden, wie sie schneiden (Art, Sequenz)! Es soll mit Hilfe des Standard Markers eine Eichgerade erstellt werden. Für die Eichgerade werden die Logarithmen der Standard-Fragmentlängen gegen ihre Laufstrecken, die von den Taschen aus zu messen sind, aufgetragen. Aus der Eicherade sind die resultierenden Fragmentlängen jeder Plasmid-Restriktion zu ermitteln. Sie müssten innerhalb eines Ansatzes in der Summe die Gesamtlänge des Plasmids ergeben. Aus den fünf ermittelten Plasmid- Gesamtlängen soll der Durchschnittswert errechnet und mit dem Literaturwert des Plasmids pbr322 (4361 bp) verglichen werden. Durch die vergleichende Auswertung der Fragmentlängen der vier Spaltungsansätze und ihrer Kombination kann die relative Lage 16

18 Restriktionsanalyse der Schnittstellen zueinander auf dem Plasmid ermittelt werden. Dazu sollte zu jedem Spaltungsansatz ein Plasmidmodell gezeichnet werden, welches die Lage der jeweiligen Schnittstellen beinhaltet. 17

19 Polymerasekettenreaktion Polymerasekettenreaktion (PCR) Die PCR erlaubt es beliebige DNA-Abschnitte zu vervielfältigen (amplifizieren). Dazu benötigt man zwei Oligonukleotide (Primer), die mit jeweils einem Strang des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes hybridisieren und eine hitzebeständige DNA-Polymerase. Ziel: Der Einfluss der MgCl 2 -Konzentration, Template-Ausgangskonzentration und der Annealingtemperatur auf das PCR-Ergebnis soll untersucht werden. Jede Gruppe setzt nach Absprache eine Variations-PCR an, wobei die Komponenten, die in allen Reaktionen gleich sind, in einem sog. Master-Mix für alle Reaktionen zusammen pipettiert werden und anschließend auf die in den PCR-Tubes vorgelegte variable Komponente (gilt nicht für Temperaturvariation ) verteilt werden. Die variable Komponente muss in allen Reaktionen das gleiche Volumen haben. Zunächst wird das Pipettierschema vervollständigt, d.h. die fehlenden Volumenangaben werden berechnet. Die Stammlösungen sind so zu verdünnen, dass sie mit den verfügbaren Pipetten mit vertretbarer Genauigkeit zu pipettieren sind. Die Komponenten werden in der angegebenen Reihenfolge in spezielle 200 µl PCR- Reaktionsgefäße pipettiert. Die Taq Polymerase wird zuletzt von den Betreuern auf Eis zugegeben, der Ansatz vorsichtig gemischt (am besten durch mehrmaliges auf- und abpipettieren ohne zu schäumen), eventuell vorhandene Luftblasen durch Zentrifugation entfernen (sehr wichtig!). Die Proben werden den Betreuern übergeben. Für jede PCR- Reaktion werden zwecks Kontrolle der Kontaminationsfreiheit der Reagenzien so genannte Wasserspuren mitgeführt. Dabei handelt es sich um normale PCR-Ansätze, die alle Komponenten enthalten bis auf das Template. Wenn keine Kontaminationen vorliegen, ist auf der Wasserspur im Gel kein Amplifikat zu sehen. Temperaturvariation: 4 Ansätze (1x ohne Template), d.h. 5x Master Mix H 2 O ad 20 µl Stammlösungen Endkonzentrationen Volumen / µl Puffer 10 x 1 x MgCl 2 25 mm 2 mm Primer pmol / µl 0,4 µm Primer pmol / µl 0,4 µm dntps (Mix aus allen vier) je 10 mm je 200 µm DNA-Template paki-slh 10 ng/µl 1 ng / µl Taq DNA Polymerase 5 U / µl 2,5 U 0,5 µl Annealingtemperaturen bei 50 C, 65 C und 70 C. 18

20 Polymerasekettenreaktion MgCl 2 -Variation: 6 Ansätze (1x ohne Template), d.h. 7x Master Mix Stammlösungen Endkonzentrationen Volumen / µl H 2 O ad 20 µl Puffer ohne MgCl 2 10 x 1 x MgCl 2 25 mm 0 mm 2 mm 5 mm 7 mm 12 mm Primer pmol / µl 0,4 µm Primer pmol / µl 0,4 µm dntps (Mix aus allen vier) je 10 mm je 200 µm DNA Template paki-slh 10 ng/µl 1 ng / µl Taq DNA Polymerase 5 U / µl 2,5 U 0,5 Die Annealingtemperatur liegt bei 65 C. Template-Variation: 7 Ansätze (1x ohne Template), d.h. 8x Master Mix Stammlösungen Endkonzentrationen Volumen / µl H 2 O ad 20 µl Puffer ohne MgCl 2 10 x 1 x MgCl 2 25 mm 2 mm Primer pmol / µl 0,4 µm Primer pmol / µl 0,4 µm dntps (Mix aus allen vier) je 10 mm je 200 µm DNA Template paki-slh 10 ng/µl 1 ng / µl 0,5 ng / µl 50 pg / µl 5 pg / µl 0,5 pg / µl 50 fg/µl Taq DNA Polymerase 5 U / µl 2,5 U 0,5 19

21 Die Annealingtemperatur liegt bei 65 C. Polymerasekettenreaktion Während des PCR-Laufes wird für wird ein 1 %iges Agarosegel vorbereitet (siehe Restriktionsanalyse). Nach Beendigung des Laufes werden 5 µl des PCR-Produkts mit 1µl Probenpuffer versetzt und das gesamte Volumen (6 µl) auf das Gel aufgetragen. Es wird derselbe Marker benutzt, der auch schon im Versuch Restriktionsanalyse verwendet wurde. Wiederum werden 5 µl auf das Agarosegel aufgetragen. Zusammensetzung des 10-fach-PCR-Puffers: 200 mm Tris-HCl (ph 8,4) 500 mm KCl Primersequenzen: forward: reverse: ATA TAT GGT ACC TCT AGA AAG AAC CTC AAA TTA ATT GGT ACC TCT AGA TTA TGC AAC TT Thermo-Cycler-Programm : 1x 95 C 5 min Denaturierung 29x 95 C 25 sec Denaturierung 65 C 25 sec Annealing 72 C 50 sec Elongation 1x 72 C 5 min Nachsynthese 4 C Auswertung: Von den Variationen wird jeweils die aussagekräftigste aus jeder Gruppe ausgewählt und allen Studenten zur Auswertung zur Verfügung gestellt, so dass neben der eigenen auch alle anderen Variationen diskutiert werden können. Die Auswertung sollte neben der reinen Erfassung des Ergebnisses (eigene Fotos beschriften) auch einen Diskussionsteil enthalten. Hier sollen Mechanismen benannt werden, die für den Intensitätsverlauf verantwortlich sind. 20

22 Polymerasekettenreaktion Fragen und Aufgaben zur PCR, die im Protokoll zu beantworten sind: 1) Warum wird die Taq-Polymerase als letzte Komponente des PCR-Ansatzes zugegeben? 2) Warum werden "Wasserspuren" mitgeführt und was sagen diese aus? 3) Berechnen Sie die optimale Annealingtemperatur der verwendeten Primer anhand ihrer Sequenzen! 4) Warum liegen die Annealing-Temperaturen in der Regel zwischen 50 und 60 C? 5) Der eingesetzte Thermocycler hat einen heizbaren Deckel. Wozu dient er und was würde passieren, wenn kein Heizdeckel vorhanden wäre? 6) Bis zum ungefähr 17ten Zyklus der PCR wird das Produkt exponentiell amplifiziert. Ein Plateau der Amplifizierung wird nach etwa 30 Zyklen erreicht. Wie verändern sich die Reaktionsparameter (Enzym, Primer, Nukleotide, Puffer) im Verlauf der PCR? 7) Wie groß ist das amplifizierte PCR-Produkt? Führen Sie eine Abschätzung anhand der Migration während der Agarosegelelektrophorese durch (vgl. Restriktionsanalyse)! 8) Wie ist der ph-wert der PCR-Reaktion bei 94, 60 und 72 C? (Tris-Puffer ph = - 0,026 pro C, Pufferbedingungen siehe Beipackzettel) 21

23 VNTR Analyse des VNTR locus DIS80 Einleitung Nach Abschluss des Human-Genom-Projektes und der Veröffentlichung der Sequenz des menschlichen Erbgutes konnte man feststellen, dass nur ein sehr geringer Bereich für Proteine kodiert. Bei der Sequenzierung stieß man auch auf sich ständig wiederholende Abschnitte, deren Funktion noch weitgehend unbekannt ist. Hierbei unterscheidet man die Short Tandem Repeats (STR) und die Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), welche hier genauer betrachtet werden. Diese Bereiche kann man für die eindeutige Identifizierung eines Menschen verwenden. Hierbei ist zu beachten, dass diese Bereiche nach den Mendelschen Regeln vererbt werden, wodurch Verwandtschaftsanalysen ermöglicht werden. Es gibt im Wesentlichen zwei Methoden, mit denen man ein spezifisches Bandenmuster auf einem Polyacrylamidgel erreichen kann. Zum einen die restriction fragment length polymorphism (RFLP) und zum anderen die amplification fragment length polymorphism (AFLP). Im Folgenden soll die zweite Methode näher betrachtet werden. Die oben erwähnten Bereiche sind von konservierten Sequenzen eingeschlossen, so dass es möglich ist, mit Hilfe der PCR diese Loci zu amplifizieren. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass schon geringste Spuren an DNA ausreichen, um eine Analyse durchzuführen. Die Häufigkeit der Wiederholung ist von Mensch zu Mensch variabel, was zu unterschiedlich langen Fragmenten in der PCR führt. Diese verschiedenen Längen können durch die Verwendung von verschiedenen Gel-Systemen analysiert werden. Hierzu werden normalerweise Polyacrylamidgele verwendet. Zur Demonstration und zur Vereinfachung wird in diesem Versuch auf ein höherprozentiges Agarosegel zurückgegriffen. Aufgabenstellung In diesem Versuch soll genomische DNA aus einem Wangenabstrich isoliert werden. Aus der gewonnenen DNA soll der DIS80, ein VNTR Locus, über die PCR amplifiziert und mittels eines Agarosegels analysiert werden. Jeder isoliert seine eigene DNA! Des Weiteren erhält jede Gruppe eine unbekannte DNA- Probe. Bei dieser Probe handelt es sich um die genomische DNA der Betreuer. Diese Proben werden in die PCR eingesetzt und anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt. Zum Vergleich auf dem Agarosegel erhält jede Gruppe 3 Marker, die DIS80 Loci der Betreuer. Nach der Analyse über das Gel sollte jede Gruppe in der Lage sein, die erhaltene unbekannte DNA Probe zu identifizieren. 22

24 VNTR Hinweise zum Gefahrenpotential der verwendeten Agentien. Proteinase K: Proteasen zerstören Proteine. Die Haut enthält ebenfalls Proteine, die durch dieses Enzym geschädigt werden könnten, daher ist ein Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden. (Handschuhe) Durchführung Für die Extraktion von genomischer DNA wird das Invisorb Spin Swab Kit der Firma Invitek verwendet. Die Handhabung ist ähnlich der, die schon bei der Plasmidaufreinigung angewendet wurde. Es werden wieder kleine Säulen mit Glasfasermembranen verwendet, welche in der Lage sind, DNA zu binden. Bei diesem Versuch ist jedoch darauf zu achten, dass etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde vor Versuchsbeginn nichts mehr gegessen oder getrunken werden sollte; das erhöht die DNA-Ausbeute. Vorbereitung: Der Elutionspuffer D wird auf 65 C vorgewärmt. Lyse Zu den bereits vorliegenden 600 µl Lysispuffer G werden 20 µl Proteinase K in das Eppi pipettiert. (kurz vortexen) Für den Mundabstrich wird ein Wattestäbchen verwendet. Dieses wird ca. 30 Sekunden bis zu einer Minute an der Innenseite der Wange kräftig gerieben. Anschließend wird das Stäbchen in das vorbereitete Eppi überführt und über dem Wattebausch abgeschnitten, wobei darauf zu achten ist, dass es nicht zu lang ist, da das Reaktionsgefäß (Eppi) noch geschlossen werden muss. 15 Minuten bei 65 C im Thermo-Mixer schütteln Wattebausch an der Gefäßwand auswringen, anschließend verwerfen 300 µl Bindungspuffer T hinzufügen und gründlich, aber vorsichtig, durch Invertieren mischen Bindung an die Säule Eine Säule wird in ein 2 ml Sammeltube gesteckt. Die Lösung aus der Lyse wird auf die vorbereitete Säule gegeben, wobei die Membran der Säule nicht mit der Pipettenspitze berührt werden darf. Eine Minute bei rpm zentrifugieren 23

25 VNTR Der Durchfluss wird verworfen und die Säule wieder zusammengesetzt Waschen der Säule Zugabe von 700 µl Waschpuffer auf die Säule Zentrifugation: 30 Sekunden bei rpm Das Filtrat wird verworfen Waschschritt wiederholen Trocknen der Membran Die Säule wird wieder zusammengesetzt und 2 Minuten bei rmp zentrifugiert Elution der DNA von der Säule Säule wird auf ein neues Eppi gesteckt Zugabe von 50 µl vorgewärmtem Elutionspuffer D (Säule nicht schließen) Nach einer Minute wird die Säule geschlossen und das Eppi mit der Säule 1 min bei rpm zentrifugiert. Das Filtrat sollte die genomische DNA enthalten Es folgt die Konzentrationsbestimmung der DNA über eine photometrische Messung Es werden 80 µl einer 1:10 Verdünnung für die photometrische Messung angesetzt, und diese bei 260 und 280 nm vermessen. 24

26 VNTR PCR aus genomischer DNA Pipettierschema vervollständigen Stammlösungen Endkonzentrationen Volumen in µl Aqua dest. ad 25 µl Puffer 5x 1 x MgCl 2 50 mm 1 mm Primer D1S80 forw. 10 µm 0,2 µm Primer D1S80 back 10 µm 0,2 µm dntp je 2,5 mm je 200 µm Genomische DNA 2 ng/µl Phusion Polymerase 2 U/µl 0,25 Aus Puffer, MgCl 2, Primern, dntp's und Phusion (die Polymerase wird von den Betreuern pipettiert) einen Mix in vierfacher Menge herstellen. Die entsprechende Menge auf die Eppi's verteilen, DNA und entsprechende Menge Aqua dest. hinzufügen und mischen. Primersequenzen: 5 -GAA ACT GGC CTC CAA ACA CTG CCC GCC G-3 5 -GTC TTG TTG GAG ATG CAC GTG CCC CTT GC-3 Thermo-Cycler-Programm: 1 x 98 C 2 min 28 x 98 C 15 sec 69 C 15 sec 72 C 35 sec 1 x 72 C 3 min. 25

27 VNTR Nach Beendigung der PCR werden die Proben durch die Agarose Gelelektrophorese aufgetrennt. Hierzu muss ein 2%iges Agarosegel (50 ml) gegossen werden, welches mit TBE Puffer angesetzt wird. Die Herstellung ist analog zu der, die beim Restriktionsverdau angewendet wurde. 12 µl des PCR-Ansatzes werden mit 3 µl Probenpuffer (PP) versetzt. 12 µl werden auf das Gel aufgetragen. Spur Probe DNA Marker Eigene DNA I Eigene DNA II Unbekannte Probe Marker Andreas Marker Frank Marker Holger Volumen 4 µl 12 µl 12 µl 12 µl 15 µl 15 µl 15 µl Auswertung Wie im Experiment Restriktionsverdau werden die Markerfragmente gegen die Laufstrecke aufgetragen. Die Laufstrecke der einzelnen Repeats kann so ermittelt werden, wenn man zuvor deren Größe berechnet. Ein Repeat enthält in der Regel 16 Basenpaare der Sequenz 5 - GAA GAC CAC CGG AAA G-3, ausgenommen Repeat 1 mit 14 Basenpaaren. Individuelle Abweichungen wurden beobachtet. Die Länge eines Allels lässt sich wie folgt berechnen: 115 bp (Distanz des 5 - Primerende bis zum ersten Repeat) + 14 bp (Repeat 1) + (n-1) x (16 bp) + 32 bp (Ende des letzten Repeats bis zum Primerende auf der 3 -Seite), wobei n die Nummer des Repeats auf der Leiter ist. Im Protokoll sollen die Anzahl der Repeats der eigenen Probe berechnet werden. Darüber hinaus ist zu diskutieren welche DNA sich hinter der unbekannten Probe verbirgt. Die Probennummer der unbekannten Probe ist unbedingt zu dokumentieren. Das Ergebnis sollte also eine Zuordnung und Berechnung der Fragmentlängen aller Probanden und die Zuordnung der unbekannten Probe enthalten. Literatur Nakamura Y. et al Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) Markers for Human Gene Mapping. Science ol. 235, Budowle B et al Analysis of the VNTR Locus DIS80 by the PCR followed by High-Resolution PAGE. Am.J.pHum.Genet. Vol. 48,

28 Ribonukleinsäuren Ribonukleinsäuren Isolierung von 70S Ribosomen aus Escherichia coli DC 10 Einleitung Ribosomen sind der Ort der Translation, also der Übersetzung der mrna in Protein. Ribosomen bestehen grundsätzlich aus einer kleinen und einer großen Untereinheit. Jedoch unterscheiden sich die Ribosomen von Prokaryoten und Eukaryoten in ihrer Größe und Komplexität. Gekennzeichnet werden Ribosomen über ihre Sedimentationsgeschwindigkeit, welche in der Maßeinheit Svedberg (S) angegeben wird. Ein eukaryotisches Ribosom sedimentiert bei 80S und wird daher auch vereinfacht als 80S- Ribosom bezeichnet. Es setzt sich aus einer 60S- und einer 40S-Untereinheit zusammen. Bei dem prokaryotischen Ribosom, welches im Mittelpunkt dieses Versuches stehen soll, handelt es sich um ein 70S-Ribosom, welches aus einer 50S- und einer 30S- Untereinheit besteht. Die 50S Untereinheit beinhaltet insgesamt 36 verschiedene Proteine, welche von L1 bis L34 durchnummeriert sind (die Proteine L7 und L12 sind doppelt vorhanden), sowie zwei RNA-Moleküle, die 23S-rRNA und die 5S-rRNA. Die kleine Untereinheit setzt sich aus 21 Proteinen (S1 bis S21) und einer 16S-rRNA zusammen. Abbildung 1: Aufbau eines 70S-Ribosoms 1 Der RNA-Anteil des Ribosoms macht fast zwei Drittel der Gesamtmolekülmasse aus. Lange Zeit wurde davon ausgegangen, dass es sich hierbei vor allem um eine Art Stützgerüst handelt, während die Proteine den eigentlichen Vorgang der Proteinbiosynthese katalysieren. Nach aufwändigen Strukturaufklärungen wurde jedoch deutlich, dass die katalytisch aktiven Bereiche aus RNA bestehen, während die Proteine hierzu fast keinen Beitrag leisten. Damit wird deutlich, dass es sich bei dem Ribosom um ein Ribozym, also eine Ribonukleinsäure mit katalytischer Aktivität, handelt. Die Strukturaufklärung des Ribosoms ist inzwischen sehr weit fortgeschritten. Besonders hervorzuheben ist hierbei Ada Yonath, die ersten Forscherin, der es gelang, Ribosomen zu kristallisieren. (Nobelpreis 2009)

29 Ribonukleinsäuren Die Translation findet nun wie folgt statt: Zu Beginn der Proteinsynthese assoziieren die beiden Untereinheiten. Als Startsignal fungieren eine purinreichende Sequenz (auch Shine- Dalgarno-Sequenz) auf der mrna, welche sich durch Watson-Crick-Basenpaarungen an einen Bereich der 16S-rRNA anlagern kann, sowie ein Startcodon (in Prokaryonten meist AUG). Die Translation startet mit der Paarung einer Initiator-tRNA an das Startcodon. An diese ist die Aminosäure Methionin gekoppelt. Es folgt die Elongation der Peptidkette. Das Ribosom verfügt über drei Bindungsstellen, an denen die trna-moleküle mit der mrna in Kontakt treten können: die A-Site (Aminoacyl-Stelle), P-Site (Peptidyl-Stelle) und E-Site (Exit-Stelle). Diese Bindungsstellen liegen im Bereich der 30S-Untereinheit des Ribosoms, während die anderen Enden der trna-moleküle in die 50S-Untereinheit hineinragen, wo sich das Peptidyltransferasezentrum befindet. Die zu verlängernde Peptidkette sitzt an einer trna auf der P-Site, eine weitere AminoacyltRNA kann an die A-Site binden. Sind beide Stellen besetzt, bildet sich eine neue Peptidbindung aus. Es folgt eine Verschiebung der trnas und mrna, bei der die deacetylierte trna zur E-Site wandert von wo aus sie dissoziieren und das Ribosom verlassen kann. Neben den beiden Unterheiten sind Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren an der Proteinbiosynthese beteiligt. Die Fehlerhäufigkeit bei der Proteinsynthese liegt bei etwa 10-4, was den Einbau von bis zu 1000 Aminosäuren mit einer hohen Zuverlässigkeit garantiert. Die Isolierung von Ribosomen ist die Grundlage verschiedener Untersuchungen. Neben den Funktions- und Strukturuntersuchungen am Ribosom, seiner Untereinheiten oder deren Komponenten, für die eine hohe Reinheit erforderlich ist, wird in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. V. A. Erdmann mit sogenannten Proteinbioreaktoren gearbeitet. Hierbei handelt es sich um eine in vitro Synthese von Proteinen. Nötig sind hierfür neben den isolierten Ribosomen alle Komponenten, welche für eine Proteinbiosynthese notwendig sind, wie beispielsweise Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren, trnas, Aminosäuren, AminoacyltRNA-Synthetasen usw. Des Weiteren ist eine genaue Optimierung vieler Parameter (z. B. ph-wert oder Salzkonzentrationen) erforderlich. Ist die Einstellung dieses Systems gelungen, ist es möglich, durch Zugabe einer für ein Proteinprodukt spezifische mrna dieses Protein herzustellen. Dabei wird das Problem der Herstellung gentechnisch veränderter Mikroorganismen umgangen. Zusätzlich bietet das System den Vorteil, dass Proteine hergestellt werden können, welche für Mikroorganismen negative Auswirkungen haben, wie beispielsweise Antibiotika. Auch der Einbau von modifizierten oder isotopen-markierten Aminosäuren ist möglich. Aufgabenstellung: Ausgehend von einem Zellaufschluss des E.coli Stammes DC 10 (RNase-defizient) werden die Ribosomen mittels differentieller Zentrifugation isoliert, anschließend die Untereinheiten 28

30 Ribonukleinsäuren in einem Sucrose-Dichtegradienten abgetrennt und die enthaltene RNA über eine Phenol/Chloroform-Extraktion isoliert. Die nachfolgend beschriebene Isolierung der 70S Ribosomen orientiert sich an den in G. Spedding 1990 (Ribosomes and Protein Synthesis a practical Approach, IRL Press, Oxford) beschriebenen Methoden. Es ist zu beachten, dass RNA sehr empfindlich gegenüber dem Abbau durch ubiquitär vorkommende RNasen ist. Es müssen daher spezielle Vorkehrungen zum Schutz der RNA getroffen werden. Informieren Sie sich zu Maßnahmen zum Schutz der Ribonukleinsäuren vor enzymatischer Degradierung und vermerken Sie diese im Protokoll! Materialien und Geräte: auf Eis vorgekühlter Mörser mit Pistill steril! Alcoa 305 (Aluminiumoxid einer definierten Körnchengröße und Oberflächenbeschaffenheit) - steril! TMA I und II sind von jeder Gruppe aus den Stammlösungen herzustellen. Stammlösungen sind steril filtriert! ca. 1-2 g Escherichia coli DC 10-Zellen 2 x 12 ml PPCO-Röhrchen steril verpackt 1 Polycarbonatröhrchen (10.8-ml-Volumen) mit Verschlußstopfen, Schraubdeckel und O-Ring 4 µl DNase I (10 U/ µl; RNase-frei) Zentrifuge: Beckman mit Rotor JA-17 für die niedrigtourige Zentrifugation (14 Plätze) mit Adaptoren Rotor 70.1 Ti sowie SW28 für die hochtourige Zentrifugation (12 Plätze) UV-Spektrometer mit Quarzküvetten (Hellma 104-QS oder 6040-UV, d = 1 cm, Fassungsvermögen: 1400 µl, Mindestvolumen: 800 µl) Unbedingt beachten: Sich gegenüber befindende Röhrchen müssen auf 0,1 g genau gleiches Gewicht haben (beim Sucrosegradient noch genauer, 0,01 g)! Der Rotor muss richtig auf der Achse sitzen! Der Rotordeckel muss handfest verschraubt werden! 29

31 Ribonukleinsäuren Arbeitsanleitung: 1. Tag Zuerst werden die Lösungen TMA I und II aus den Stammlösungen und DEPC behandeltem Wasser hergestellt: TMA I : 50 ml in sterilem Falcon Tube ansetzen TMA II: 100 ml in ausgeheizter Schottflasche ansetzen Stammlösung Endkonzentration 1 M Tris/HCl ph 7,8 10 mm 1 M MgCl 2 10 mm bzw. für TMA II 0,3 mm 2 M NH 4 Cl 30 mm 2-Mercaptoethanol 6 mm (21 µl für TMA I bzw. 42 µl für TMA II) Ab jetzt auf Eis arbeiten! genaues Gewicht der Zellen notieren und in gefrorenem Zustand in den vorgekühlten Mörser geben doppelte Menge Alcoa 305 dazu (ca. 3g, vorher abwiegen), 4 min oder länger kräftig zermahlen, denn dieser Schritt ist entscheidend für die Ausbeute! Missachtung führt zu schlechten Ergebnissen! Röhrchen werden nicht beschriftet, der Rotorplatz ist nummeriert! es werden 3 ml TMA I pro g Zellen sukzessiv in 1 ml Schritten dazugegeben, jeweils gut suspendieren, gesamten Inhalt in ein PPCO-Röhrchen überführen, mit 3 ml Puffer den Mörser gut spülen und ebenfalls in das PPCO-Röhrchen geben. Partner mit etwa gleichem Volumen suchen und mit TMA I austarieren zentrifugieren: 30 min, 4 C, x g mindestens 2/3 vom Überstand mit einer Pasteurpipette abnehmen, aber darauf achten, nicht die DNA-haltige Schicht über dem Alcoa-Pellet mitzureißen, Überstand in ein neues PPCO-Röhrchen zur weiteren Zentrifugation geben und gegebenenfalls auf 8 ml mit TMA I ergänzen, Alcoa-haltiges Pellet mit Einmalspatel aus dem Röhrchen kratzen, in Haushaltsfolie einwickeln und im Biohazard-Müllbeutel entsorgen zentrifugieren: 45 min, 4 C, x g Röhrchen werden nicht beschriftet, nummerierten Rotorplatz auf Zentrifugenblatt! 30

32 Ribonukleinsäuren 6,5 ml des Überstandes (S30) in ein Polycarbonatröhrchen pipettieren, mit 4 µl DNase versetzen und mischen, anschließend 500 µl abnehmen und in ein Eppi geben UV-Absorptionsmessung bei 260 nm von S30: Verdünnung 1:1000 (zuerst eine 1:10 Verdünnung anfertigen und dann davon eine 1:100 Verdünnung), Rest des Eppi- Inhalts für die RNA- Isolierung bei 20 C einfrieren (S30) zentrifugieren des S30-Überstandes: 16 h, 4 C, rpm Hinweis zur Messung der Extinktion = A 260 -Einheiten: Nullabgleich mit Aqua dest. Verdünnungen mit H 2 O dest.bidest ansetzen, bei großen Verdünnungen in Schritten verdünnen, Verdünnung sollte so gewählt sein, dass die Extinktion zwischen 0,15 und 1.0 liegt (linearer Bereich für Lambert-Beer sches Gesetz), Küvettenfenster müssen sauber sein. Vorbereitung: Für den folgenden Tag sollten die Gradientenmischer und Schläuche sorgfältig mit 1 % SDS-Lösung und anschließend mit Aqua dest. gespült werden, um anhaftende RNasen zu entfernen und das Material für den Gebrauch trocken zu haben (besonders nasse Schläuche und das Verbindungsrohr am Gradientenmischer könnten zu Luftblasen im System führen). 31

33 Ribonukleinsäuren 2. Tag Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette abnehmen (S100) UV- Absorptionsmessung bei 260 nm von S100: Verdünnung 1:100, 500 µl für die RNA- Isolierung aufbewahren. Pellet (70S) vorsichtig mit ca. 1 ml TMA II-Puffer spülen, ohne das Pellet zu lösen, Puffer entfernen nochmals TMA II-Puffer (700 µl) dazu, mit einem Einmalspatel lösen, gegebenenfalls mit einer 1 ml Pipette mehrmals vorsichtig auf- und abpipettieren, Inhalt in Eppendorfgefäß überführen und 30 sec zentrifugieren. Dies dient der Kontrolle, ob sich alles gelöst hat Volumen bestimmen (erfahrungsgemäß etwas mehr nach dem Lösen), UV- Absorptionsmessung bei 260 nm von 70S: Verdünnung 1:1000 (siehe oben) ein 300 Absorptionseinheiten (mind. 200 AE) entsprechendes Volumen wird für die Auftrennung im Dichtegradienten aufbewahrt Die genaue Anzahl an vorhandenen AE wird den Betreuern mitgeteilt. Gruppen mit weniger als 200 AE bekommen Probenmaterial von anderen Gruppen zugeteilt. restliche Ribosomensuspension wird mit der MgCl 2 -Stammlösung auf die Mg- Konzentration des TMA I-Puffers eingestellt für die RNA-Isolierung bei 20 C aufbewahren; zur Berechnung des Volumens siehe Formelsammlung Seite 3) 32

34 Ribonukleinsäuren E.coli Zellen (~ 1-2 g) + 2 g Alcoa pro 1 g Zellen (= 3-4g) gründlich zerreiben 3 x 1 ml TMA I pro 1 g Zellen, nach jeder Pufferzugabe gründlich verreiben mit 3 ml TMA I Puffer spülen Suspension in 12 ml PPCO-Röhrchen überführen, austarieren, zentrifugieren Zentrifugation: 30 min, 4 C, x g Überstand I (ÜS I) Ribosomen DNA RNA Enzyme etc. Überstand vorsichtig abnehmen und in ein neues 12 ml PPCO-Röhrchen geben austarieren, zentrifugieren Pellet I Alcoa Zellwände Aggregate (Ribosomen) verwerfen Zentrifugation: 45 min, 4 C, x g Pellet II Überstand II (S30, Rohextrakt) aus 12 ml PPCO Röhrchen 6 ml Überstand abnehmen und in Polycarbonatröhrchen überführen 4 µl DNase I zugeben, mischen, 500 µl S30 Analytik austarieren und zentrifugieren: Analytik 500 µl S30 abnehmen und zur weiteren Analytik wegfrieren photometrische Messung verwerfen Zentrifugation: 16 h, 4 C, rpm Pellet III (70S) 70S Ribosomen Waschen mit TMA II in 700 µl TMA II resuspendieren Überstand III (S100) Analytik Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation µl S100 abnehmen und zur weiteren Analytik wegfrieren photometrische Messung