Medizinische Fakultät Auswertestrategien von Microarrays Einführung

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1 Medizinische Fakultät Auswertestrategien von Microarrays Einführung PD Dr. Knut Krohn IZKF Leipzig Dr. Markus Eszlinger Med. Klinik III Forschungslabor

2 DNA RNA Hintergrund Charakteristisches Muster der Genexpression Gendefekte Veränderte Genexpression Protein Charakteristisches Proteinmuster Verändertes Proteinmuster Ordnung Information Normale Physiologie Pathophysiologie

3 Der Genotyp, die Gesamtheit der Gene eines Organismus stellt den Bauplan dar. Der Phänotyp ist das fertige Gebäude. Die mrna Expression liefert kleine Teilpläne für einzelne Bauelemente. Veränderungen in diesen Teilplänen sind häufig Ursachen für Baufehler am Gebäude

4 RNA Extraktion Gewebe/Zellen gesamt RNA (mrna, trna, rrna) 2 Stufen-Reinigung - Phenol/Chloroform Säulenreinigung 28 S rrna 18 S rrna +

5 Gewebe Aufschließen/Homogenisieren Tiefgefrorenes Gewebe mörsern

6 Gewebe Aufschließen/Homogenisieren Gemörsertes Gewebe homogenisieren

7 RNA Extraktion (klassisch) Prinzip: Verteilungsgleichgewicht in Phasen Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und Wasser Gewebepulver Zugabe von Phenol Phasentrennung nach Zugabe von Chloroform/Zentrifugation

8 RNA Extraktion (klassisch) RNA wird nach Entnahme der wässrigen Phase mit Ethanol gefällt und zentrifugiert

9 RNA Extraktion (alternativ) Prinzip: RNA-adsorbierende Silica- oder Glaßmaterialien Verwendung von Säulen zur besseren Handhabung

10 Nach der RNA Aufreinigung RNA liegt in wässriger Lösung vor. Agarose- Gelelektrophorese - Bemerkungen zu den Methoden: Nach klassischer Methode gute bis sehr gute RNA Qualität ohne DNA Kontamination aber mit Phenolspuren; 28 S rrna 18 S rrna Nach alternativer Methode sehr gute RNA Qualität meist mit DNA Kontamination aber ohne Phenolspuren und Salze; +

11 Abschätzung der RNA Qualität und Quantität Wie sauber ist die RNA (Proteine, DNA, Salze...) Wie intakt ist die RNA (Degradation/Abbau der RNA) Wieviel RNA-Ausbeute habe ich? Messung des UV-Spektrum, Gelelektrophorese und optischer Nachweis mittels Fluoreszensfarbstoff oder durch UV Absorbtion bei 260 nm,

12 UV-Spektrum RNA/DNA Protein

13 Agarose Gelelektrophorese

14 Agarose Gelelektrophorese

15 Agarose Gelelektrophorese Agarose: Polysaccharid aus Rotalgen, wird in Puffer geschmolzen und erstarrt zu einer Matrix, deren Porengröße von der Agarose Konzentration abhängt - +

16 Agarose Gelelektrophorese Agarose- Gelelektrophorese Elektrophoretisch getrennte Produkte werden durch den interkallierenden Farbstoff Ethidiumbromid im UV-Licht angefärbt. Ein Größenvergleich erfolgt durch eine DNA- oder RNA-Leiter. mgl. DNA Verunreinigungen 28 S rrna 18 S rrna Bezeichnung Größe Funktion trna transfer RNA Nukleotide (nt) Aminosäuretransport zum Ribosom rrna ribosomale RNA 4 Arten, 120, (18S) und 3500 Struktureinheiten der Ribosomen nt (28S) mrna messenger RNA wenige 100 bis über nt Abschriften der Gene als Vorlage der Proteinsynthese

17 RNA Analyse mit einem Chip

18

19 Probentrennung im Agilent Bioanalyser

20 Synthese der crna Sonden RNA DNA crna Markierung Amplifikation Herstellung von Einzelsträngen Bindung RNA/DNA stärker als DNA/DNA

21 Zellen/Gewebe RNA oligo dt T7, dntps ss cdna Reverse Transkriptase Herstellung der Microarray Sonden dntps DNA Polymerase ss crna T7 RNA Polymerase Fragmentierung NTPs biotin NTPs ds cdna Hybridisierung Waschen Färben Messen

22 Doppelstrang G A G AC T G T T G C G GAT GG T A C T C T G A C A ACG C C T A C C A T Wärme Schmelzen der DNA Hybridisierung Einzelstränge G A G AC T G T T G C G GAT GG T A C T C T G A C A ACG C C T A C C A T Abkühlen

23 A 40 C B 80 C B A B A A schmelzen Wärme A A A B A B B B B A B B 50 C B waschen A B Abkühlen hybridisieren B B 40 C B A Wärme A B A A A A

24 Pufferlösung Markierung mit Biotin spezifische Hyb. hybridisieren 45 C 16h hohe Salzkonzentration unspezifische Hyb. Microarray Microarray waschen 50 C 3x5min niedrige Salzkonzentration Microarray

25 Hybridisierung Die Hybridisierung eines Doppelstrangs aus zwei komplementären Einzelsträngen ist ein reversibler Prozess. Dieser ist abhängig von folgenden Parametern: - prozentualer Gehalt der Basen Guanin und Cytosin (%GC), - die Länge des DNA-Doppelstranges (n), - die Konzentration monovalenter Kationen (z. B. [Na+]) - Lösungsmittel (z.b. Formamid - destabilisiert des Doppelstrang) Empirische Berechnung der Hybridisierungstemperatur (nach Meinkoth und Wahl 1984): Tm = 81,5 C + 0,41 * (%GC) + 16,6 log [Na+] - 500/n - 0,61 * (%Formamid)

26 Früher: Microarrays/Biochips Die Umkehrung der traditionellen Molekularbiologie Spezifische Sonde unspezifisches Target cdna, Oligo-DNA Array of unknown Northern oder Southern Blot genomische oder cdna Bank Heute: Spezifische Targets bekannte Gene oder Sequenzen auf Macro- oder Microarrays unspezifische Sonde reverse-transcribed RNA

27 Northern Blot (klassisch) RNA (Target) fest gebunden an Träger, Sonde (markierte synthetische Nukleinsäure) frei in Lösung Agarose- Gelelektrophorese Northern Blot Nitrozellulose RNA Hybridisiert mit der Sonde gegen ein Gen 28 S rrna 18 S rrna 3,0 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,5 kb RNA Färbung

28 Microarray Target (synthetische Nukleinsäure) fest gebunden an Träger, Sonde (RNA) frei in Lösung Synthetische Oligonukleotide bekannter Sequenz in einem bestimmten Planquadrat Markierte RNA an den Oligos hybridisiert und mit Farbstoff markiert

29 Affymetrix GenChip

30 Auflösung des Scanners Größe des Spots eines synthetisierten Oligos

31 Design der GeneChips Affymetrix Gene Expression Arrays Exon Arrays Tiling Arrays

32 Design der GeneChips Affymetrix mrna Sequence of interest 5 3 Probe Set 25 bp oligonucleotide Target Sequence 5 - TTACCCAGTCTA G CTAGTAGCTGGA 3 IIIIIIIIIIII I IIIIIIIIIIII 3 - AATGGGTCAGAT C GATCATCGACCT - 5 Perfect match probe Mismatch probe 5 - AATGGGTCAGAT C GATCATCGACCT AATGGGTCAGAT G GATCATCGACCT 3 Probe pair

33 Design der GeneChips Affymetrix Cell Whole Chip PM MM Probe pair 1,28 cm Probe Set

34 Auswertestrategien der GeneChips Einzelanalyse Probe Set _s_at Array1 Signal array1 Signal array2 Probe Set _s_at Array2

35 Einzelanalyse Signal Detection call Detection p-value

36 Discrimination Score R = (PM-MM)/(PM+MM) One-sided Wilcoxon Signed Rank test aller R eines Probesets Führt zum Detection p-value

37 Das Signal für ein ProbeSet wird summiert aus den ProbePairs. Es wird ein One-step Tukey s biweight estimate verwendet.

38 Auswertestrategien der GeneChips Vergleichsanalyse Probe Set _s_at Array1 Signal Log Ratio Probe Set _s_at Array2 Baseline

39 Vergleichsanalyse Signal Log Ratio Difference Call Difference p-value Es werden erst die ProbePairs zweier Chips ins Verhältnis gesetzt und dann für das ProbeSet eine Summe (Signal Log Ratio) gebildet. (PM-MM) array1 / (PM-MM) array2

40 Einzelanalyse Vergleichsanalyse Gruppenanalyse Preprocessing MAS5 MAS5 RMA GC-RMA Plier Statistik

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