Der Kleine Molekularbiologe. oder THE KITS ARE ALLRIGHT. Zusammengesammelte und kompilierte Rezepte *

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1 Der Kleine Molekularbiologe oder THE KITS ARE ALLRIGHT Zusammengesammelte und kompilierte Rezepte * JH Walter Berlin Mai

2 1 Mit schönem Dank aber auch an Susanne & Falko (Institut für Virologie FU Berlin), Robert (Institut für Veterinär-Pathologie FU Berlin), sowie AG PD Foss (UKBF FU Berlin) 2

3 RNA-Isolierung Prinzip: Zellen lysieren, RNase inaktivieren und RNA extrahieren. Man erhält eine RNA-Suppe, die ein Gemisch von rrna, t-rna und mrna enthält. Die interessierende mrna ist zu etwa 2% enthalten. Prinzipbeschreibung: Das Material wird in Guanidinisothiocyanat (GTC) lysiert. GTC ist ein chaotropes Salz, das effektiv Proteine inkl. RNase denaturiert. Durch Zugabe von Phenol, senkt man ph und die Proteine lösen sich in Phenol. In der grauen Interphase ist die DNA und im wässrigen Überstand die RNA. Wo: Erdgeschoß rechts, S1: Präparation der Probe; EG ganz hinten links: Durchführung Materialien: TRIzol(tm) Reagens (Gibco BRL): Lösung aus Phenol und GTC Ethanol 75% mit RNasefreiem H 2 O hergestellt. Isopropanol Arbeitsschritte: Zentrifuge mit "Fast Cool" auf 4 C vorkühlen; Eppendorf mg Gewebe mechanisch zerkleinern und 1 ml TRIzol dazu bzw. 5-10x10 6 Zellen in 1ml TRIzol resuspendieren 5 min. bei RT inkubieren 200 µl Chloroform zugeben, 15 sec kräftig schütteln. 2-3 min bei RT inkubieren 15 min bei 4 C zentrifugieren ( g = U/min) 1,5 ml Eppis vorbereiten Wässrige (obere) Phase in Eppis überführen (etwa 600 µl) 0,5 ml Isopropanol zugeben und schütteln 10 min bei RT inkubieren Zentrifuge vorkühlen 10 min bei 4 C zentrifugieren ( g = U/min) Überstand dekantieren und auf Papiertuch abtropfen lassen. Pellet mit 1 ml Ethanol (75%) waschen 5 min bei 4 C zentrifugieren (7.500 g = U/min) Wasserbad auf C vorwärmen Überstand verwerfen und Pellet unter Schreibtischlampe trocknen; CAVE: wenn RNA zu trocken wird, löst sie sich nur noch schlecht Pellet in 200 (bzw. 100) µl RNasefreiem Wasser lösen 10 min ins Wasserbad C Auf Eis packen 3

4 Konzentrationsbestimmung Nukleinsäure Prinzip: Die Konzentration wird photometrisch als Optische Dichte (OD) bei 260 nm bestimmt. Die Konzentration errechnet sich aus OD 260nm, Verdünnung und einem für DNA, RNA bzw. Oligo-spezifischem Multiplikationsfaktor. Zuverlässig sind Photometerwerte zwischen 0,1 und 1 OD. Materialien Photometer (Shimadzu, UV 1202) Quarzküvette, 80 µl Aqua bidest Ablauf Photometer einschalten Küvette mit Bidest füllen und Nullen Küvette mit 8 µl Probe und 72 µl Bidest füllen (=1:10) 4 µl Probe und 76 µl Bidest (=1:20) Messen Mit 80 µl Bidest Küvette ausspülen, bzw, quantitativ entfernen Formel: c [µg/ml] = OD 260 x V x F V= Verdünnung F=Multiplikationsfaktor dsdna=50; RNA=40; ssoligo= 20 4

5 Reverse Transkription Prinzip: Man pipettiert RNA und Oligo-Primer zusammen, erhitzt auf 70 C um RNA zu schmelzen, läßt auf 37 C abkühlen und damit den Primer hybridisieren. Dazu kippt man Puffer, Nucleotide, Rnase- Hemmer sowie Reverse Transkriptase und inkubiert das Ganze bei 37 C. Als Ergebniss erhält man eine einzelsträngige cdna. Wo: Erste Etage; Ansatz im PCR-Raum (Tiefkühli oben FST); dann auf Eis in den RT-Raum Materialien: MMLV-RT (Moloney murine leukemia virus-reverse Transkriptase); Gibco RT-Puffer 5x(Gibco): 200 U/µl Erststrangpuffer 250 mm Tris-HCL (ph 8,3) 375 mm KCL 15 mm MgCl2 0,1 M 40 U/ml Je 2 mm DTT (Dithiothreitol); Gibco RNasin (Rnase-Inhibitor); Promega DNTP s (Fermentas) Primer (T20) 20 µm RT-Mix 12 µl pro Ansatz RT-MIX 4 µl RT-Puffer 2 µl DTT 2 µl dntp s 2 µl T20 1 µl RNasin 1 µl MMLV-Reverse Transkriptase SuperSkript/Super-MMLV-H(-) 25µl pro Ansatz; 17µl RT-Mix zu RNA 5µl 5xMLV 4µl dntps 2µl OligoT(20) 1µl Super MMLV-H(-) 5µl dh 2 O Ablauf 1. In Mini-Epis (0,5 ml) 2 µg RNA 2. Mit RNase freiem H 2 O auf 8 µl auffüllen 3. 5 min. bei 70 C RNA linearisieren 4. Kurz auf Eis µl RT-Mix hinzu 6. 1 h bei 37 C 7. 5 min bei 95 C 8. auf Eis packen 5

6 PCR Prinzip: DNA-Ausgangsmaterial (template) wird mit zwei passenden Primern (vorwärts u. rückwärts), Nukleotiden und Puffer vermischt, eine thermostabilde DNA-Polymerase dazugemixt und in den Thermocycler gestellt. Die Annealing-temperatur schlägt Mac-Vektor vor. Wo: Ansatz im PCR-Raum (1.Etage hili) Materialien: Q-Puffer PCR-Puffer, 10fach dntp s Taq-Polymerase Primer A, vorwärts Primer B, rückwärts Amp-Tubes 0,5 ml, Epi 1 ml Paraffinöl Ablauf Ansatz der PCR (1. Etage) * Reagenzien aus dem Tiefkühlfach holen (cave: Taq nicht, denn die ist in Glycerol gelöst, braucht erst kurz vorm Pipetieren rausgeholt werden) * Mini-Epis rausholen und beschriften * Groß-Epi fürn Mix bereitstellen 10 µl Q-Puffer 5 µl PCR-Reaktionspuffer 5µl dntp s 1 µl Primer A 1 µl Primer B 0,3 µl Taq-Polymerase ad 50 µl Aqua bidest ( 20 µl) Den Mix kurz zentrifugieren und dann 42 µl in jedes Mini-Epi pipettieren 8 µl cdna (kommt im EG dazu)* * Nach Zugabe der cdna mit 1 Tropfen Paraffinöl überschichten Dann in Thermocycler Biometra Programm 2 ablaufen lassen; falls Display "Pause" anzeigt, <STOP> und <ENTER> drücken. <Edit> <2> <Enter><Enter>...bis Anzeige "Temp 3" von MacVector errechnete Annealing-Temperatur eingeben <Enter>; <Enter><Enter>...bis Anzeige "Anzahl Schleifen:" Schleifenanzahl eingeben <Enter>, <Enter><Enter>...bis Anzeige "Zeit 6:Pause." <Ende> <Start> <2> <Enter> 6

7 Agarosegelelektrophorese Prinzip: Agarose in TAE-Puffer, der EtBr enthält, im microwave oven kochen, etwas Abkühlen, Gießen und Festwerden lassen. DNA in die Slots, Strom drauf, rausholen und mit UV illuminieren. Wo: EG hire TAE-Puffer, 50x, ph 8 Tris(hydroxymethyl)aminomethan Na-Acetat EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat Aqua bidest. 242,5 g 20,65 g 18,5 g Ad 1000 ml TAE, 1x EtBr 100 ml 4 µl (=10 mg/ml) Mit TAE 1x ein 1%iges Gel anfertigen =100 ml Spannung 100 V maximal A je Slot (vorher in Eppis vorbereiten) 2 µl Laufmedium + 10 µl Probe Marker 2 µl Laufmedium + 0,5 µl Marker + 10 µl Bidest 7

8 Klonieren Prinzip: Eine isolierte DNA-Sequenz wird in einen Vektor eingebaut (=Ligation), über den Vektor in kompetente Bakterien eingebracht und darin vermehrt (Transformation). Da Taq-Polymerasen meist (nicht immer) am 3 -Ende ein A anhängen (hängt ab von der Base des 5 -Endes des komplementären Primers; ab besten sollte dies A oder G sein), war die Konstruktion von Vektoren mit Thymin-Überhang wie beim pgem-system nur logisch. Nicht zu verwechseln mit Klonen, gelle?! Die T4-DNA-Ligase ist für die Ligation von DNA-Fragmenten besonders geeignet, da sowohl komplementäre "sticky ends" als auch "blunt ends" ligiert werden können. Bei der Ligation eines Vektors mit einer Insert-DNA sollte das molare Verhältnis 1 : 3 betragen. In schwierigen Fällen sollte die Ligation ü.n. bei 4 C oder für mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur erfolgen. Um dabei eine optimale Temperatur für die Ligation der jeweiligen DNA-Fragmente zu erreichen, kann die Inkubation auch ü.n. in einer mit 30 C warmen Wasser gefüllten Thermoskanne im Kühlschrank (4 C) erfolgen (Temperaturshift: 30 C 4 C). Hierbei kommt es zu einem langsamen Temperaturabfall von der Ausgangs- zur Umgebungstemperatur im Kühlschrank. Um bei einer anschließenden Transformation des Ligationsansatzes eine hohe Transformationseffizienz zu erreichen, ist es von Vorteil, den Ligationsmix 5-fach mit TE-Puffer zu verdünnen. Materialien Agar-Platten inkl. Ampicillin; 2 je Ansatz (LB-Agar+20mg/ml Ampi) pgem -T easy Vector System, Promega 0,5 ml und 1,5 ml Eppendorfis SOC Kulturmedium X-Gal IPTG Eis Wärmebad Ablauf Ligation 2x Rapid Ligation Puffer (vor Gebrauch vortexen) 5 µl pgem -T Easy Vector (50 ng) 1 µl PCR-Produkt (3:1 Insert:Vector) T4 DNA-Ligase 1 µl (Aqua dest ad 10 µl) Für 1h bei RT inkubieren. Transformation Ligationsmix kurz zentrifugieren 2 µl vom Mix in 1,5 ml Eppendorfgefäß; auf Eis JM109 High Efficiency Competent Cells, in Eisbad auftauen Durch leichtes Anstoßen Durchmischen 50 µl der Zellen ins 1,5 ml Eppendorfgefäß Durch leichtes Anstoßen Durchmischen Ins Eis stellen 20 min Hitzeschock: 42 C sek Ins Eis stellen 2 min 950 µl SOC Medium hinzufügen bei 37 C inkubieren unter Bewegung (150 rpm) 1,5 h LB-Agar-Platten mit 100 µl X-Gal und 100 µl IPTG massieren 100 µl Kultur auf LB/Ampicillin/IPTG/X-Gal-Platte und einmassieren bei 37 C h 8

9 MINIPREP Prinzip: Plasmid-DNA wieder raus ausm Bakterium holen. Prinzipbeschreibung: Alkalische Bakterienlyse und Adsorption der DNA an Silica in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen und nachfolgendem Auswaschen der Plasmid-DNA. Material: QIAprep Spin Miniprep Kit #27104 QIAprep Spin Columns Puffer P1 Puffer P2 NaOH/SDS Puffer N3 high salt conc. (chaotrop.) Puffer PB chaotropische Salze Puffer PE (Konzentrat) Puffer EB 10 mm Tris-Hcl, ph 8,5 RNase A Collection Tubes (2 ml) Tischzentrifuge xg (13000 rpm) Ablauf: 1. Einzelkolonien mit autoklaviertem Zahnstocher picken und in 5 ml LB- Medium, dem 100 µg Ampicillin/ml zugefügt wurde, überbringen. 2. Bei 37 C über Nacht unter ständigem Rühren ( 120 U/min) inkubieren. 3. 1,5 ml der Kultur in Epis überführen und 5min zentrifugieren, den Überstand dekantieren. 4. Das Bakterienpellet in 250 µl Puffer P1 resuspendieren µl Puffer P2 zugeben und 4-6mal vorsichtig umdrehen µl Puffer N3 zugeben und 4-6mal vorsichtig umdrehen. 7. Zentrifugieren für 10 min In dieser Zeit die QIA Spin Columns in die 2 ml Collection Tubes stecken. 8. Den Überstand in die QIA Spin Columns schütten. 9. Zentrifugieren für sec. 10. Waschen: 0,75 ml Puffer PE in die QIA Spin Columns gießen und für sec. zentrifugieren. 11. Den flow-through wegkippen und 1 min zentrifugieren. 12. Die QIA Spin Columns in saubere 1,5 ml Epis stecken. 50 µl Puffer EB oder Aqua. dest. ins Zentrum der Columns pipettieren, 1 min warten und 1 min zentrifugieren. 13. Das Eluat sollte nun die -Plasmid-DNA enthalten, die man/frau mit oder ohne in 40 µl TE aufzunehmen auf ein Gel packt und REA betreibt. 9

10 Restriktionsenzymanalyse (REA) Prinzip: Pure Plasmid-DNA wird mit EcoR I geschnitten, so daß das eigentliche Plasmid und das Insert getrennt vorliegen. Was liegt dem nun zugrunde? Restriktionsenzyme! Eigentlich heißen sie Restriktionsendonuklease und kein Mensch weiß sogenau warum. Der Name geht zurück auf Beobachtung von Phagen in Baktierenkulturen: Bestimmte Phagen vermehrten sich nur in bestimmten Bakterien-stämmen, waren also auf diese beschränkt - restricted, wie der Angelsachse sagt. Schuld daran waren bakterielle Enzyme - Endonukleasen -, die DNA mit ihnen unbekannte Methylisierungsmustern verdauten. Was machen sie genau? Sie erkennen vier bis acht Basenpaare in einem DNA-Strang, die sie dann ganz exakt schneiden. Nomenklatur Die Benennung dieser Enzyme ist ein Wunderwerk an Kryptologie, so wie es Molekularbiologen eben lieben. Wir haben also so eine Endonuklease aus einem bestimmten Bakterium. Nun nehme wir den ersten Buchstaben des Gattungsnamen und die ersten beiden Buchstaben des Artnamens dieses Bakteriums. Beispiel: Aus Escherichia coli wird so Eco. Dahinter kommt eine Typ- oder Stammbezeichnung. Beispiel EcoR. Und zum Schluß noch eine Ordnungsnummer in lateinisch. Beispiel: EcoR I. Restriktionsenzymkategorien Je nach Aufbau werden drei Typen unterschieden: Typ I Restriktionsenzyme bestehen aus S-, M- und R-Untereinheiten. S erkennt die Sequenz, M methyliert und R schneidet. Typ III Restriktionsenzyme bestehen aus mehreren Untereinheiten, erkennen spezifische Sequenzen und schneiden etwa Nukletoide davon entfernt und werden von Molekularbiologen nicht eingesetzt. Typ II Restriktionsenzyme sind für den Molekularbiologen die relevanten. Typischerweise bestehen sie aus zwei voneinander unabhängigen Enzymen: Einerseits aus dem schneidenden eignetlichen Restriktionsenzyme und einer methylisierenden Methylase. Beide erkennen die gleiche Zielsequenz: Während nun das eine Enzym schneidet, wird durch das andere Enzym hemimethylisierte DNA vollständig methylisiert und so dem Zugriff des Restriktionsenzym entzogen. Damit schützt sich so ein Bakterium vom Verdau eigener DNA. Blöderweise methylieren auch andere Lebewesen ihre DNA. Und wie der Zufall es manchmal so will, genau an der Stelle an der man schneiden möchte. Was tun? Man nimmt ein anderes Enzym, das genau an derselben Sequenz schneidet, dem aber ein bestimmte Methylisierungfolge keine Probleme machen. Solche Enzyme nennt man auch Isoschizomere, da sie die gleiche Sequenz erkennen und die gleiche Sequenz schneiden. Enzyme die, die gleiche Sequenz erkennen aber an anderer Sequenz schneiden, nennt man Neoschizomere. Wo: EG; S2 Ansatz: Plasmid DNA 1 % Gel; l-hind III als Marker 5 µl DNA aus MiniPrep (10 µl) 2, 5 µl Puffer, 10fach (2,5 µl) 1 µl ECO R1 (1 µl) ad 17 µl Aqua bidest. (12 µl) Genomische DNA 6 µg DNA 4 µl Puffer, 10fach 4 µl Enzym ad 40 µl Aqua bidest. 0,7 % Gel; l-hind III als Marker Ablauf: 2 h bei 37 C Wasserbad inkubieren in Agarosegel auftrennen 10

11 DNA-Fragmente aus Agarosegel isolieren Prinzipbeschreibung: Die DNA-Bande im Agarosegel (TAE-gepuffert), die interessiert, wird unter UV- Lichtbeleuchtung (sonst sieht man sie ja nicht) aus dem Gel geschnitten. Cave! Das Ausschneiden sollte schnell geschehen, weil die DNA auf UV-Licht sehr empfindlich mit Depurinierung, Strangbrüchen, Basendimerausbildungen u.ä. reagiert. Nun wird die DNA aus dem Gel extrahiert. Dazu macht man sich zu Nutze, daß Silica-Verbindungen wie Glas, Glasmilch o.ä. in Anwesenheit konzentrierter chaotroper Salze (Na-Jodid, GTC, Ma-Perchlorat) DNA binden. Nach Waschen mit Salz-Ethanol-Puffer, wird die DNA mit Hilfe von Lösungen mit geringen Salzkonzentrationen (H 2 O, TE-Puffer=Tris 10 mm, EDTA 1mM) aus den Silicamaterialien eluiert. Materialien: DNA in Gel QIAquick Gel Extraction Kit Ablauf: 1. Das DNA-Fragment mit scharfer Klinge unter UV-Illumination (Kopf-Kondom nicht vergeßen!!) aus dem Agarosegel herausschneiden und in Epi packen. 2. Auswiegen. 3x Volumen Puffer QG zu 1 Volumen Gel mit DNA geben; es gilt 100 mg 100 µl. 3. Bei 50 C im Wasserbad für 10 min inkubieren bis Gel komplett gelöst ist. Alle 2-3 min dabei kräftig vortexen. 4. Die Farbe des Epi-Inhalts kontrollieren: Sollte gelb sein; falls nicht 10 µl 3 M Natrium-Acetat zugeben Gel-Volumen Isopropanol zugeben und mischen. Gilt nur DNA Fragmente, die < 500 bp und > 4 kbsind. 6. Die QIAquick spin column in die 2ml Collection Tube stecken. 7. Den Epi-Inhalt in die spin column kippen und 1min zentrifugieren. 8. Den Flow-Through wegkippen und spin column wieder in die Collections Tubes stecken. 9. 0,5 ml Puffer PE zugeben und 1 min zentrifugieren 10. 0,75 ml Puffer PE zugießen, 2-3 min. warten und 1 min zentrifugieren. 11. Den Flow-Through wegkippen und 1 min bei xg ( rpm). 12. QIAquick spin column in 1,5 ml Epis stecken µl Puffer EB oder Aqua dest. ins Zentrum der QIAquick spin column pipettieren und dadurch DNA eluieren. 1 min. bei max. Speed zentrifugieren. 14. Im Eluat ist unsere erwünschte DNA (einfrieren bei 20 C) 11

12 Transkription [ 35 S]-UTP 4,5 µl (ca. 50 µci) [ 35 S]-UTP in Eppendorf 30 Min bei 70 C (oder 20 C entsprechend länger) einfrieren bei 80 C lagern in Eppendorf pipettieren (an den Rand) 2 µl 5x Transkritionspuffer (T3,T7 oder SP6) +0,5 µl 100 mm DTT +0,5 µl RNAsin (Promega) +1 µl 3x rntp-gemisch +y µl (z.b. 1/0,5 linearisiertes Plasmid) (1 µg/µl) (+x µl DEPC-H 2 O) => x+y =5 µl kurz Picofuge +1 µl RNA Polymerase (50UT7, T3 oder 10USP6) nicht aus Behälter, nicht vortexen, da instabil gegen mechanische Irritationen 60 Min bei 37 C H 2 O Bad erneut 0,5 µl Polymerase 30 Min bei 37 C +5 µl y-trna (50 mg/ml) +0,5 µl RNAsin (Promega) +0,5 µl DNA I, RNA-frei (25 mg/µl, Promega) 8 Min bei 37 C +10 µl 3 M Na-Acetat, ph 6,0 +74 µl DEPC-H 2 O Phenol-Extraktion +100 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1, v:v:v) zentrifugieren (13000 rpm, RT, 5Min) Überstand abpipettieren und in neues Eppi Nur obere Phase, nicht Interphase oder Unterphase ca µl (75 µl) abpipettieren EtOH Präzipationsschritt 10 µl Na-Acetat 250 µl absolut Alkohol Min bei 70 C zentrifugieren (4 C, 20 Min, rpm) oder bei 80 C lagern Überstand in frische Eppi Pellet prüfen (ob überhaupt da!), Überstand erst nach Szintimessung wegwerfen 500 µl Ethanol 70% (-20 C kalt) zentrifugieren (4 C, 5 Min, rpm) Überstand abpipettieren Pellet in Epi trocknen lassen (unter Abzug ca. 10 Min) 30 µl 10 mm DTT (50 µl 1 mm DTT) gut mischen bis Pellet aufgelöst lagern bei 80 C oder Szintillationmessung 12

13 Messung von [ 35 S] in Szintillationszähler (Beckman-Gerät) Jedes Messröhrchen mit 2 ml Szintillationsflüssigkeit füllen Anordnung der Röhrchen in der speziellen Halterung: 1. Reihe: leeres Röhrchen in Platz 7. Übrige Plätze frei lassen leer Leer = nur Szintiflüssigkeit Platz 7 = zeigt Gerät, daß 35 S 2. Reihe: Platz 1 Leerwert. Auf den folgenden Plätzen die heißen Proben leer Probe1 Probe2 Probe3 Probe4 Probe5 Probe6 Probe7 3. Reihe: alles frei Zeigt Gerät, daß fertig 1 µl des Transkriptionsansatzes für die Messung der Inkorporation im Szintillationszähler abnehmen und in 2 µl szintillationsflüssigkeitsgefüllte Röhrchen geben, mischen und Spitze ebenfalls drin lassen. Halterungen in Gerät stellen, START drücken, Drucker Online schalten. Berechnung der spezifischen Aktivität: Zuerst die im gesamten Reaktionsansatz vorhandene Aktivität aus dem cpm-wert des 1. Filters und dem entsprechenden Volumen berechnen, dann die cpm der in RNA eingebauten Aktivität aus dem 2. Filter ebenfalls auf den Gesamtansatz hochrechnen. Etwa % der eingesetzten cpm sollten in makormolekularen RNA inkorporiet sein: Inkorporationsrate= Cpm aus Filter 2 x Gesamtvolumen (bei Annahme für Filter 2)/ Volumen aus Filter 1 Cpm aus Filter 1 x Gesamtvolumen (bei Annahme für Filter 1)/ Volumen aus Filter 1 danach berechnen: pmol markietes NTP x 4 x Inkorporationsrate x (1µg/3225pmol) =... µg RNA 13

14 Einfache ISH (ohne Immunhistologie) Paraffin Alle Lösungen bis auf HCl und Triethanolamin am Vortag ansetzten. Schnitte auf APES-OT aufziehen und ün trocknen lassen 30 Min Xylol bei RT (am besten ün) 20 Min Xylol bei RT 30 Min Aceton 10 Min Aceton/PBS 10 Min PBS 20 Min 0,2M HCl bei RT (Proteindenaturierung) 30 Sec PBS 2 Min PBS 10 Min Pronase bei RT (0,125 mg/ml / 1x PBS ph 7,2) (Pronase aliquots: 1 Aliquot = 12,5 = 1x) 30 Sec 0,1 M Glycin / 1x PBS (stoppt Pronase) 30 Sec PBS spülen 30 Sec PBS spülen 20 Min bei 4 C Nachfixieren mit 4% Paraformaldehyd (4 C) / PBS ph 7,0 3 Min PBS Acetylierung: 10 Min 0,1M Triethanolamin ph 8, dabei unmittelbar vor Gebrauch 0,25 % (v:v) Essigsäureanhydrid zugeben, auf Schüttler 5 Min PBS Dehydrierung: 2 Min 30 % Ethanol (mit DEPC-H 2 O ansetzen) 2 Min 70 % Ethanol (mit DEPC-H 2 O ansetzen) 2 Min 90 % Ethanol (mit DEPC-H 2 O ansetzen) 2 Min 100 % Ethanol (mit DEPC-H 2 O ansetzen) 1 2 h OT trocknen lassen, beschriften, in Kammer einordnen (3 Lagen Zellstoff; ca. 18 OTs pro Kammer) Hybridisierung Es werden immer drei (oder ggf. mehr) Objektträger mit gleicher [ 35 S]-antisense-Sonde und mindestens ein Objektträger mit der dazugehörigen [ 35 S]-sense-Sonde angesetzt, so daß Entwicklung nach mindestens drei unterschiedlichen Expositionszeiten möglich ist. Die sense-hybridisierung wird parallel zur als optimal antisense-hybridisierung entwickelt. Auf jeden Objektträger kommen 25 µl einer Mischung aus Hybridisierungsmix mit Sondenmix im Verhältnis 4:1 (v:v). Hybridisierungsmix (HybMix): 50 % Formamid / 0,3 M NaCl / 10 mm Tris-HCl ph 7,5 / 10 mm NaPO 4 ph 6,8 / 1 x Denhardt s / 1 mg/ml Hefe-tRNA / 5 mm EDTA / 10 mm Dithioreitol / 10 % Dextransulfat / cpm [ 35 S]-markierter RNA pro 25 µl. für 400 µl 600 µl 1000 µl 1300 µl 1500 µl Formamid 200 µl 300 µl 500 µl 650 µl 750 µl 10x Salze 50 µl 75 µl 125 µl 162,5 µl 187,5 µl 0,1 M DTT 40 µl 60 µl 100 µl 130 µl 150 µl Hefe-tRNA 10 µl 15 µl 25 µl 32,5 µl 37,5 µl 50 % DexSO4 100 µl 150 µl 250 µl 325 µl 375 µl HybMix 30 Sec niedrigtourig vortexen und bis zum Gebrauch in 50 C H 2 O-Bad stellen. 14

15 Sondenmix (Σ = 25 µl) 30 Sec in 80 C 50 % Formamid 10 % DTT = (Sollcpm 40000) 25 µl Mix auf jeden OT, luftblasenfrei Deckglas (gebacken und silikonisiert) darauf und mit Pipettenspitze andrücken Den Zellstoff in der Kammer mit 50 ml Lösung (25 ml Formamid + 25 ml DEPC-H 2 O) tränken Kammer in Plastikfolie luftdicht verschließen und in Wärmschrank bei 48 C (50 C) über Nacht (16-18h) inkubieren Einen Satz vertikale Küvetten für die Waschung am folgenden Tag bereits jetzt in den Wärmeschrank stellen. Waschen nach Hybridisierung Wasserbäder mit 37 C und 50 C anschalten, Arbeitsplatz messen!!! 30 Min Glasküvetten in 52 C Wasserbad (oder Wärmschrank) vorwärmen Posthybridisierungs-Waschlösung auf 50 C erhitzen und in vertikale Küvetten füllen Für 120 OT werden ca ml PosthybMix benötigt (50 % deionisiertes Formamid / 1x Salze / 1 mm DTT) Schnitte in gefüllte vertikale Küvetten stellen. 30 Min im Schüttelbad bei 52 C waschen (1. Reihe benutzte Küvetten; 2. Reihe neue vorgewärmte Küvetten 2. Bad) Deckgläser durch leichtes Rütteln der Küvetten zum Abgleiten bringen lassen ggf. nachhelfen. Schnitte nicht eintrocknen lassen; Deckgläser und Waschlösung (beides min 2 x H 2 O trennen) in radioaktiven Müll 4 h bei 50 C in neuer Waschlösung waschen TES Waschlösung auf 37 C vorwärmen (10 mm TrisHCl ph 7,5 / 1 mm ETDA / 0,5 M NaCl) 15 Min 2 x in TES waschen (TES nachher in radioaktiven Müll) 30 Min bei 37 C in TES und RNase inkubieren. (20 µg/ml RNase A Endkonzentraion) Schnitte in horizontale Küvette umfüllen Min bei 37 C in TES (TES 1x wechseln) 20 Min bei RT in 2x SCC waschen (Schüttler) 20 Min bei RT in 0,1x SCC (/0,1 x SDS) waschen 20 Sec 30 % Ethanol / 0,3 M NH 4 -Acetat für 200 ml 0,3 M NH 4 -Acetat: 20 Sec 70 % Ethanol / 0,3 M NH 4 -Acetat 9 ml 7,5 M NH 4 -Acetat ml H 2 O 20 Sec 90 % Ethanol / 0,3 M NH 4 -Acetat 10 Sec 100 % Ethanol oder Aceton 1 2 h oder ÜN staubfrei lufttrocknen lassen 15

16 Beschichten der Objektträger mit Fotoemulsion (Dunkelkammer) Entwickeln 16

17 Materialien: Kodak D 19 Entwickler auf 50 % (1:1; v:v) mit Aqua dest. verdünnt (braunes Präzipitat am Flaschenhals vorher entfernen) 1 % Essigsäure Kodak Fixierer 3000 Lösung A auf 25 % (1:4; v:v) mit H 2 O verdünnt (Achtung: nicht Lösung B) Stoppuhr Ablauf: Kartellbox mehrere Stunden an RT adaptieren Genannte Lösungen in horizontale Glasküvetten geben Küvetteneinsätze und Drahtgriffe mit in Dunkelkammer nehmen Licht aus, ein Weile warten (Leuchtstoffröhren!) Objektträger aus Kartellbox in Glasküvetteneinsätze sortieren (in völliger Dunkelheit!) 3 Min in 50 % Kodak D 19 entwickeln (alle 30 Sec Küvetteneinsätze rütteln) Sec in 1 % Essigsäure tauchen (inaktiviert Kodak D 19, darf nie in Koadk D 19 Lösung kommen!) 3 Min 25 % Fixierer (alle 30 Sec rütteln) Dannach erst darf Licht angemacht werden Präparate Min unter fließendem Leitungswasser (kalt) spülen HE-Färbung für einfache ISH 3 Min Hämalaun (vorher filtrieren) 3 5 Min Wasser (zum bläuen) aufsteigende Alkoholreihe 5 15 Sec Eosin (Merck 15935) absteigende Alkoholreihe in deionisiertes Wasser mit Glyceringelatine (vorher erwärmen) eindecken; Hinterseite der Objektträger abwischen. Eosin für 2 l 5 l 10 % Phloxin B 20 ml 50 ml 1 % Eosin Y (alkoholische Lösung) 200 ml 500 ml Essigsäure 100% 20 ml 50 ml Ethanol 96 %ig 1760 ml 4400 ml Beschichtung von Objektträgern (Alternativen zu APES) 17

18 Poly-L-Lysin Objektträger in 0,25 M NH 4 -Acetat tauchen, bei 60 C trocknen, 30 min 50mg/ml poly-l-lysin bei RT (aus 10 mg/ml Stammlösung, gelagert bei -20 C) über Nacht trocknen (staubfrei) staubfrei lagern Gelantine 5 g Gelantine in 500 ml warmem dh 2 O auf Rührer lösen erhitzen auf 80 C (nicht kochen!) langsam auf 40 C abkühlen lasssen 0,5 g Chlorkaliumsulfat unter vorsichtigem Rühren hinzugeben sterilfiltrieren Objektträger in warme Gelantinelösung tauchen trocknen in 1% Paraformaldehyd fixieren (10 min, RT) Über Nacht Staubfrei bei 63 C trocknen. Glutaraldehyd-aktivierte APES-Objektträger 3h 2% APES in EtOH/DEPC-H 2 O (1:1,v:v) dann 3x 1 min in EtOH waschen und trocknen 2h 70 C 6h 5% Glutaraldehyd in DEPC-H 2 O dann 3 x 15 min in DEPC-H 2 O waschen und trocknen Silikonisierung von Deckgläsern Deckgläsergröße: 21 x 26 mm oder größer Deckgläser in vertikale Küvetten fächerförmig einsortieren (15 Stck./Küvette) 20 min in 0,2 N HCL kurz in 100% Ethanol tauchen 15 min trocknen lassen 5h bei 250 C im Ofen backen nach Abkühlen in Silikonlösung (Serva) tauchen (unter dem Abzug!) Silikonbeschichtung einbrennen: 2h bei C staubfrei lagern ( in Alufolie einwickeln bzw. abdecken) Lösungen DEPC-H 2 O Aqua bidest. in gereinigte Flaschen füllen, je Liter 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonat [Sigma], Handschuhe! Abzug!) dazugeben, gut schütteln, mindestens 1 Std. einwirken lassen. autoklavieren, danach ph einstellen (DEPC zerfällt bei Hitze in Ethanol und CO 2. Es entsteht somit H 2 CO 3!) 18

19 RNase-freie Lösungen NB: Alle Lösungen, die autoklaviert werden können, mit Aqua bidest. in sauberen Flaschen ansetzen, für die übrigen Lösungen DEPC-H 2 O und gebackene Flaschen verwenden. 7,5 M Ammoniumacetat (NH 4 -Acetat) ph 7,5 (Nicht R.F.!) für 100 ml 500 ml 57,8 g 289 g mit Eisessig (konz.essigsäure) ph 7,5 einstellen DEPC 0,1 ML 0,5 ML Aqua dion. autoklavieren.ph kontrollieren 100 x Denhardts Lösung 0,2 g Ficoll 400 0,2 g PVP (Polyvinylpyrrolidone) 0,2 g BSA Fraktion V (BSA = Rinder-Serumalbumin) in DEPC-H 2 O ad 10 ml lösen in 1 ml-aliquots (Eppendorfröhrchen) bei -20 C lagern 50 % Dextransulfat (DexSO4) (10 ml) 25 g Dextransulfat in 25 ml DEPC-H 2 O lösen in 80 C Wasserbad erhitzen, öfters vortexen und bei 3000 rpm zentrifugieren erneut 25 ml DEPC-H 2 O zugeben und mischen bei -20 C lagern 0,1 M Dithiothreitol (DTT) für 10 ml 20 ml DTT 154 mg 309 mg DEPC-H 2 O 9 ml 18 ml 0,5 M EDTA 10ml 20 ml ph 6,0 einstellen, auf 10 ml mit DEPC-H 2 O auffüllen, bei -20 C in 0,2 ml Aliquots (0,5 ml Eppendorfröhrchen) lagern 0,5 M EDTA ph 8,0 für 100 ml 500 ml EDTA 14,62 g 73,1 g erst lösen, dann NaOH-Tabletten oder 10 N NaOH hinzugeben, rühren, bis alles gelöst ist DEPC 0,1 ml 0,5ml autoklavieren, ph kontrollieren, ggf. mit 1 N NaOH nachtitrieren Formamid (deionisiert) ph 7,0 etwa 400 ml Formamid (Merck) in 0,5 l-flaschen geben und mit ca. 50 g AG 501 x 8 (D) Mischbett- Ionenaustauscherharz weiter deionisieren (mindestens 12h, nicht mit Magnetquirl rühren!). ph prüfen, ggf. mit neuem Austauscherharz weiter deionisieren. mittels Papierfaltenfilter (sterilisiert) filtrieren für die Verwendung als Hybridisierungspuffer in 1 ml-aliquots bei -20 C lagern 1M Glycin/PBS für 100 ml 500 ml Glycin 7,5 g 37,5 g in 1x PBS lösen DEPC 0,1 ml 0,5 ml autoklavieren ph 7,4 mit NaOH einstellen 19

20 Hefe-tRNA (yeast trna, y-trna) 50 mg y-trna in 1 ml DEPC-H 2 O lösen in 10 ml-aliquots bei -20 C lagern 3 M Natriumacetat (Na-Ac) ph 6,0 für 100 ml 500 ml Trinatriumacetat 24,61 g 123,5 g mit Eisessig (konz. Essigsäure) ph 6 einstellen DEPC 0,1 ml 0,5 ml Autoklavieren 5 M NaCl für 100 ml 500 ml NaCl 29,2 g 146 g DEPC 0,1 ml 0,5 ml Autoklavieren 1 M NaHCO 3 (Natriumhydrogencarbonat) 0,84 g NaHCO 3 (p.a.,merck) in 10 ml DEPC-H 2 O auflösen in 1 ml-aliquots bei -20 C lagern 1 M Na 2 CO 3 (Natriumcarbonat) ph 10,2 1,06 g Na 2 Co 3 (p.a.,merck) in 10 ml DEPC-H 2 O auflösen vortexen! ph 10,2 mit Natriumhydrogencarbonat einstellen bei -20 C lagern in 1 ml Aliquots lagern 1M NaPO 4 (Natriumphosphat) ph 6,8 mischen (ca.1:1) aus 1M NaH 2 PO 4 (Natriumdihydrogenphosphat, für 100 ml 13,8 g; für 500 ml 65,4 g) und 1M Na 2 HPO 4 ( Dinatriumhydrogenphosphat, für 100 ml 17,8 g; für 500 ml 89 g) bis ph 6,8 erreicht ist 0,1 DEPC auf 100 ml autoklavieren 10 x PBS (phosphate Buffered Saline) ph 7,2 1,3 M NaCl, 70 mm Na 2 HPO 4, 30 mm NaHPO 4 für 500 ml 1000 ml NaH 2 PO 4 *H 2 O 2,6 g 5,2 g Na 2 HPO 4 *H 2 O 6,22 g 12,44 g NaCl 38,0 g 76 g DEPC 0,5 ml 1,0 ml autoklavieren und dann ph 7,2 mit 1 M NaOH einstellen 4%PFA/PBS ph 7,0 (Paraformaldehyd) für 500 ml: 20 g Paraformaldehyd in 1 x PBS (aus 10x PBS) lösen auf Heizplatte bei 70 C etwa 3-4 h rühren bis die Lösung vollständig klar ist nach Abkühlen ph 7,0 mit 1 M NaOH (oder HCl) einstellen vor Gebrauch filtrieren (Papierfaltenfilter 185 mm, S&S, steril) sollte stets frisch sein, kurzfristig lichtgeschützt bei 4 C aufbewahren! Pronase 125 mg Pronase (Sigma type XIV, P-5147) in 3,125 ml DEPC-H 2 O lösen 20

21 312,5 ml Aliquots (=> 12,5 mg) 4h bei 37 c vorverdauen (Wasserbad, zerstört kontaminierende Enzyme) lyophilisieren (Speedvac) bei -20 C lagern ( 1 Portion für 100 ml Verdaulösung mit 0,125 mg/ml Endkonzentration) optimale Konzentration bzw. Verdauzeit durch Vorversuche ermitteln! Proteinase K 125 mg Proteinase K in 3,125 ml DEPC-H 2 O lösen 312,5ml Aliquots ( => 12,5 mg) 4h bei 37 C vorverdauen lyophilisieren bei -20 C lagern ( 1 Portion für 100 ml Verdaulösung mit 0,125 mg/ml Endkonzentration) 10x Salts ( Salze ) für 50 ml 150 ml 200 ml 500 ml 5 M NaCl 30 ml 90 ml 120 ml 300 ml 1 M Tris-HCl ph 7,5 5 ml 15 ml 20 ml 50 ml 1 M NaPO 4 ph 6,8 5 ml 15 ml 20 ml 50 ml 0,5M EDTA ph 8,0 5 ml 15 ml 20 ml 50 ml DEPC-H 2 O 4,5 ml 13,5 ml 18 ml 45 ml unmittelbar vor Gebrauch 100x Denhardt s Lösung zugeben: 100x Denhardt s 0,5 ml 1,5 ml 2 ml 5 ml 0,1 M Triethanolamin ph 8,0 für 50 ml 100 ml 500 ml Triethanolamin Base 665 ml 1,33 ml 6,65 ml DEPC-H 2 O 45 ml 80 ml 450 ml ph 8,0 mit 1 M HCl einstellen, mit DEPC-H 2 O Volumen auffüllen unmittelbar vor Gebrauch dazugeben: Essigsäureanhydrid 125 ml 250 ml 1,25 ml 1M Tris (Tris-hydroxymethyl-aminomethan, verschiedene ph-werte) mischen aus 1 M Tris-HCl (für 100 ml 15,8 g Substanz; für 500 ml 79 gsubstanz) und 1M Tris-Base (für 100 ml 12,14 g Substanz; für 500 ml 60,7 g Substanz) bis gewünschter ph-wert erreicht ist mit DEPC-H 2 O ansetzen (kein DEPC zugeben, nicht autoklavieren) 1 TBS für Immunhistologie (0,05 M Tris / 0,15 M NaCl, ph 7,6) 8,7 g NaCl zu 1000 ml 0,05 M Tris-HCl und 8,7 g NaCl zu 1000 ml 0,05 M Tris-Base beide Tris-Lösungen kombinieren, bis ph 7,6 erreicht ist 10xTBS für Immunhistologie (0,05 M Tris / 1,5 M NaCl, ph 7,6) 87 g NaCl zu 1000 ml 0,5 M Tris-HCl und 87 g NaCl zu 1000 ml 0,5 m Tris-Base beide Tris-Lösungen kombinieren, bis ph 7,6 erreicht ist Antikörper-Verdünnungspuffer für IH / ISH-Doppelmarkierung (1x RPMI-1640 / 1% BSA / 5000 U Heparin/ml / 2,5 mg/ml y-trna) 1 g BSA 21

22 U Heparin (Sigma H-08809) 250 mg Hefe-tRNA 10 ml 10x RPMI 1640 (Seromed) 85 ml DEPC-H 2 O ph 7,5 einstellen mit 1 m Tris-Base (Heparin reagiert sauer!), dann Endvolumen mit DEPC-H 2 O auffüllen. Reste können eingefroren werden. 10 x APAAP Entwicklungspuffer (E-Puffer, 0,5 M Tris / 1,5 M NaCl, ph 9,7) 87 g NaCl zu 1000 ml 0,5 M Tris-HCl und 87 g NaCl zu 1000 ml 0,5 M Tris-Base beide Tris-Lösungen kombinieren, bis ph 8,8 erreicht ist 0,2 N HCl (Salzsäure) 100 ml 1 M HCl ad 500 ml DEPC-H 2 O Lösungen, die nicht RNase-Frei sein müssen 20 x SSC (Standard Saline Citrate) für 500 ml 650 ml 1000 ml NaCl 87,5 g 113,75 g 175 g Na 3 -Citrat 44,1 g 57,2 g 88 g in deionisierten H 2 O (aus der Leitung) lösen, ph 7,0 RNase A für 10 mg/ml: 100 mg RNase A in 10 ml DEPC-H 2 O lösen Aliquotieren zu 1 ml 2 min kochen (100 C Wasserbad, zerstört kontaminierende DNase u.a. Enzyme) bei -20 C lagern ausschließlich Einmal-Plastikpipetten (z.b. Falcon) verwenden! (1 ml Enzym für 500 ml Verdaulösung mit Endkonzentration 20 mg/ml) Posthybridisierungs-Waschlösung (50% deionisiertes Formamid ph 7,0, 1x Salze, 10 mm DTT) für 400 ml 500 ml 1000 ml 1500 ml 2000 ml Formamid 200 ml 250 ml 500 ml 750 ml 1000 ml 10x Salze 40 ml 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml DTT 0,6 g 0,8 g 1,6 g 2,3 g 3,1 g restliches Volumen mit deionisiertem H 2 O auffüllen 10x TES Waschlösung ph 7,5 für 1000 ml 2000 ml 1500 ml 2500 ml 1 M Tris-HCl ph 7,5 100 ml 200 ml 150 ml 250 ml 0,5M EDTA 20 ml 40 ml 30 ml 50 ml NaCl 289 g 578 g 333 g 731 g mit deionisiertem Leitungswasser auffüllen, ph kontrollieren 1x TES Waschlösung ph 7,5 (10 mm Tris-HCl ph 7,5 / 1 mm EDTA / 0,5 M NaCl) für 1000 ml 1500 ml 2500 ml 1 M Tris-HCl ph 7,5 10 ml 15 ml 25 ml 0,5 M EDTA 2 ml 3 ml 5 ml 5 M NaCl 100 ml 150 ml 250 ml mit deionisiertem Leitungswasser auffüllen, ph kontrollieren 22

23 TAE 50 x für 500 ml 1 l 2 l 3 l 5 l Tris Base 141 g 242 g 484 g 726 g 1210 g 0,5 M EDTA 50 ml 100 ml 200 ml 300 ml 500 ml Essigsäure 28,6 ml 57 ml 114 ml 171 ml 285 ml mit deionisiertem Leitungswasser auffüllen Phenol Gleiches Volumen 1 M Tris ph 8,0 / 0,1 M EDTA / 0,1 % Hydroxyquinolin auf das Phenol geben 65 C bis Phenol gelöst ist schütteln, zentrifugieren, Phasentrennung abwarten Wässrige (Ober-)Phase abnehmen Gleiches Volumen 10mM Tris ph 8,0 / 1 mm EDTA zugeben schütteln, Phasentrennung abwarten, Oberphase abnehmen etc x wiederholen Lagerung bei -20 C nach Möglichkeit unter Stickstoff Herstellung von carrier DNA 500 mg DNA (z.b. aus Kalbsthymus) in 250 ml TE über Nacht auflösen + 60 ml 1 M NaOH 20 min 100 C im Wasserbad mit konz. Essigsäure oder 1 M HCl neutralisieren ml gepuffertes Phenol ml Chloroform schütteln, Phasentrennung abwarten, ggf. zentrifugieren wässrige Phase abnehmen, restliches Chloroform durch Ether-Extraktion entfernen + 1/50 vol. 5 M NaCl (etwa 6 ml) + 2 Vol. EtOH, bei -20 C über Nacht präzipitieren lassen zentrifugieren, Pellet in 50 ml TE lösen OD 260nm eines verdünnten Aliquots bestimmen 1 mg auf einem 1% Agarose Gel auftrennen, die gesamte EtBr-darstellbare DNA sollte kleiner als 2 kb sein, überwiegend zwischen 300 und 1000 bp einige Tropfen Chloroform zugeben, bei 4 C lagern vor Gebrauch 10 min Kochen 23