HyperCel STAR AX Ionenaustauschsorbens

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1 Life Sciences USD 2831(2) HyperCel STAR AX Ionenaustauschsorbens Salztolerantes Sorbens für die Anionenaustauschchromatographie mit hohen Ausbeuten Ein im industriellen Einsatz skalierbares Anionenaustauscherchromatographie-Sorbens, das zum hochproduktiven Proteincapture und zur Kontaminantenabreicherung bei mittlerer oder hoher Leitfähigkeit entwickelt wurde (2 bis 1 ms/cm), typisch für unverdünnte biologische Feedstocks (d.h., Säugezellkulturüberstände, E. coli-feedstock, Plasma, etc ). Filtration.Separation.Solution.SM

2 Das HyperCel STAR AX Sorbens wird in großem Umfang hergestellt und entspricht den Bedürfnissen von industriellen Nutzern und Aufsichtsbehörden. Ein Regulatory Support File (RSF) zur Einreichung bei den zuständigen Aufsichtsbehörden kann zur Verfügung gestellt werden, um Nutzer bei der Validierungsverfahren zu unterstützen. Dieses Sorbens bietet Folgendes: Hohe dynamische Bindungskapazität (DBC) bei kurzer Verweildauer (2 Minuten oder weniger) Direktes Proteincapture oder Kontaminantenabreicherung aus unverdünnten Feedstocks bei mittlerer oder hoher Leitfähigkeit Hervorragende Flusseigenschaften zur schnellen Verarbeitung des Feedstocks Spezifische Selektivität über eine große Bandbreite von Leitfähigkeiten (2 1 ms/cm) Verbesserte Prozesswirtschaftlichkeit Das HyperCel STAR AX Sorbens besteht aus einer festen Zellulosematrix mit hervorragenden Flusseigenschaften, die nur einen geringen Rückdruck hervorruft und den Bedürfnissen der industriellen Proteinherstellung entspricht. Das Sorbens ist in einer Vielzahl von Packungskonfigurationen erhältlich, darunter AcroPrep ScreenExpert 96-Well-Platten für das frühe Sorbentienscreening in der Proteinaufreinigung und praktische 1-mL- und -ml-prc- Fertigsäulen, die für die schnelle Methodenoptimierung, das Selektivitätsscreening und präparatives Arbeiten im kleinen Maßstab entwickelt wurden. Das HyperCel STAR AX Sorbens wird als Lösung/ Suspension in 1 M NaCl mit % (v/v) Ethanol oder als Kuchen für Anwendungen im Prozessmaßstab angeboten (der Kuchen vereinfacht den Sorbenstransfer, indem die Durchmischung und Suspension großer Materialvolumina vermieden wird). Das HyperCel STAR AX Sorbens verfügt über eine chemische Stabilität, die eine einfache CIP-Reinigung (Clean in Place) und Lagerung ermöglicht. Im Falle einer Standard-CIP wird eine Behandlung mit, bis 1 M NaOH empfohlen, wogegen bei einer langfristigen Lagerung auch bis mm NaOH zum Einsatz kommen können. Tabelle 1 Schlüsseleigenschaften Durchschnittliche Partikelgröße Ionenaustauschligand Dynamische Bindungskapazität 1 Typischer Leitfähigkeitsbereich des Feedstocks Empfohlene Reinigungsbedingungen 2 8 μm Primäres Amin > mg BSA/mL innerhalb eines ph-bereichs von 7,-8, und einer Leitfähigkeit von 1 ms/cm 2-1 ms/cm 1 M NaOH Das HyperCel STAR AX Sorbens ist im Labor-, Pilot- und Prozessmaßstab einfach zu packen und entpacken. Es zeigt hervorragende Flusseigenschaften und ist mit den Erfordernissen fortschrittlicher Produktionsverfahren kompatibel. Das Sorbens kann mit preisgünstigen Standardpuffern gepackt werden. Eine Säule von mm I.D. x 1 mm Höhe gepackt in einem mm NaCl-Puffer kann bei einem Rückdruck von weniger als 1, bar (22 psi) (Abbildung 1) verarbeitet werden. Die Packleistung ist vom Labor- zum Prozessmaßstab ( mm I.D.) konsistent. Typische Werte für Bodenzahlen liegen bei N/m >. Typische Asymmetriefaktoren (AF) sind: 1, < AF < 1,. Abbildung 1 Druck vs. Flussrate - HyperCel STAR AX Sorbens Druck (bar) Lineare Geschwindigkeit (cm/std.) Säule: mm I.D. x 1 mm Betthöhe. Packpuffer: mm NaCl Besonderheiten und Vorteile Hohe dynamische Bindungskapazität über einen breiten Leitfähigkeitsbereich: Vermeidung von Verdünnung des Feedstocks; Optimierung des Downstream Processings Abbildung 2 Dynamische Bindungskapazität vs. Verweildauer als Funktion von ph-wert und Leitfähigkeit - HyperCel STAR AX Sorbens Leitfähigkeit Verweildauer = 1 Min. Verweildauer = 2, Min. Verweildauer = Min ph ph ph Säule:, cm I.D. x cm Betthöhe (~1 ml). Probe: mg/ml BSA inäquilibrierpuffer. Äquilibrierpuffer: 2 mm Tris-HCl, ph 7,-8,. Leitfähigkeit 3- mscm. Verweildauer: 1- Min (,2-1 ml/min). Die Zahlen verweisen auf die Bindungskapazität für BSA in mg/ml Sorbens. 1. Bestimmt mithilfe von mg/ml BSA in 2 mm Tris-HCl,,1 M NaCl bei einer Verweildauer von 2 Minuten. 2. Injektion von Säulenvolumina an,-1 M NaOH, 1 Stunde Kontaktzeit. 2

3 Eine Design of Experiments (DoE) Studie wurde durchgeführt, um die Auswirkungen verschiedener ph-werte (7, bis 8,), Leitfähigkeiten (3 bis ms/cm) und Verweildauern (1 bis Minuten) auf die dynamische Bindungskapazität für Rinderserumalbumin (BSA) als Modell zu untersuchen. Hervorragende Selektivität und Trenneffizienz über ein breites Leitfähigkeitsspektrum Abbildung Trennung einer Proteinmischung auf HyperCel STAR AX bei ms/cm. Die Daten zeigen den Einfluss von ph-wert und Leitfähigkeit auf die DBC für BSA auf HyperCel STAR AX. Die Konturdiagramme in Abbildung 2 belegen, dass das Sorbens über ein breites Spektrum an ph-werten und Leitfähigkeiten bei kurzer Verweildauer eine hohe DBC (> mg/ml) erreicht und somit eine optimale Prozessflexibilität und Produktivität ermöglicht. Abbildung 3 Dynamische Bindungskapazität von HyperCel STAR AX für Humanserumalbumin (HSA) aus unverdünntem und verdünntem Plasma mau 8 6 Cytochrom C Transferrin Albumin Leitfähigkeitsgradient 3 7 ms/cm 11 ms/cm 3 6 ml HSAmg/mL mg/ml HyperCel ercelstar AX AX DEAErigid (feste Agarose) agarose Abbildung 3 zeigt die DBC von HyperCel STAR AX für HSA verglichen mit einem DEAE-Anionenaustauschsorbens mit konventioneller fester Agarose bei Leitfähigkeiten von unverdünntem (11 ms/cm) und verdünntem (7 ms/cm) Plasma. Die in Abbildung 3 dargestellten Daten bestätigen, dass die DBC durch eine Leitfähigkeit im Bereich 7-11 ms/cm im Vergleich zu einem konventionellen Sorbens weniger beeinflusst wird. Dies ermöglicht eine direkte Aufgabe von unverdünntem Plasma auf das HyperCel STAR AX Sorbens. Kombiniert mit den hervorragenden Flusseigenschaften bei geringem Rückdruck (Abbildung 1) können große Mengen von Feedstock direkt und schnell verarbeitet werden, womit sich der gesamte Prozessdurchsatz erhöht und das Risiko einer Proteinschädigung eingeschränkt wird. Die hohe Bindungskapazität ermöglicht den Einsatz von Säulen mittleren Volumens und mittlerer Stellfläche, was zu einer Reduktion der erforderlichen Puffervolumina, Einsparungen bei der Ausstattung und geringeren Investitionskosten für Sorbentien führt. HyperCel STAR AX PRC Fertigsäule, 1 ml; µl Mischung (2 mg/ml Cytochrom C, mg/ml humanes Transferrin, mg/ml Rinderserumalbumin [BSA]). Beladen: 2 mm Tris-HCl ph 8,, ms/cm. Eluieren: Gradient von - % 2 mm Tris-HCl, ph 8, + 1 M NaCl. Die Sorbensselektivität ist ein wichtiger Parameter, um zwischen dem Zielprotein und Verunreinigungen im Feedstock zu unterscheiden. Das Screening der Sorbentienselektivität ist dabei entscheidend und sollte in einem frühen Stadium der Verfahrensentwicklung durchgeführt werden. Ein schnelles Screening und eine Optimierung der Bedingungen können erreicht werden, wenn eine Pall 1 ml PRC Fertigsäule verwendet wird. Sobald die entsprechende Phasenchemie gewählt wurde, können die Bedingungen in einer ml PRC Fertigsäule durch Verdopplung der Betthöhe optimiert werden. Zwei ml Säulen können in Serie miteinander verbunden werden, um die Betthöhe der Säule auf cm zu erhöhen und die realen Bedingungen im Pilotmaßstab oder bei Scale-down Anwendungen nachzustellen. Auch Säulen von 1 ml lassen sich in Serie schalten. Aufgrund der Unterschiede in der Partikelstruktur, Phasenchemie und der spezifischen ionischen Ladungsdichte, wie in Abbildung dargestellt, bleiben die Selektivität und die Trenneffizienz von HyperCel STAR AX über ein breites Leitfähigkeitsspektrum erhalten. Anwendungen und Beispiele Anwendungen beinhalten ein direktes Capture von rekombinanten Proteinen, monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, Plasmaderivativen oder anderen Biopharmazeutika. Aufgrund seiner Fähigkeit, Proteine direkt aus unverdünnten Feedstocks anzureichern, kann HyperCel STAR AX auch für eine frühe Kontaminantenabreicherung eingesetzt werden (d.h. CHO-Wirtszellproteine). Dies geschieht vor der Aufreinigung der Zielverbindung, d.h. vor einem Antikörper-Capture im Rahmen eines Protein A Affinitätsschritts. 3

4 . Anwendung 1. Direktes Capture von Albumin aus unverdünntem Plasma Das Ziel besteht darin, HyperCel STAR AX als erste Stufe einer zweistufigen Aufreinigungssequenz zur Anreicherung von Humanserumalbumin (HSA) aus unverdünntem Plasma (Leitfähigkeit 11 ms/cm) zu bewerten. HyperCel STAR AX wurde als erste Stufe der Anreicherung ohne Anpassung des Plasmas hinsichtlich ph- Wert oder Leitfähigkeit eingesetzt. Im Folgeschritt kam S HyperCel als orthogonaler Kationenaustauscher zum Einsatz. Reines, unverdünntes Plasma (ph 7,6, 11 ms/cm), wurde mit einer DBC von 3 mg/ml (siehe Abbildung 3) aufgebracht. Eine Design of Experiments (DoE) Studie in 96-Well Filterplatten (AcroPrep Advance Filterplatten, Pall) wurde zur Bestimmung der optimalen Bedingungen durchgeführt, mit denen das beste Ausbeute-Reinheit-Verhältnis erreicht werden kann (siehe Abbildung für ein Beispiel der Optimierung der Wasch-und Elutionsbedingungen). Diese Bedingungen wurden anschließend auf Pall PRC Fertigsäulen (Abbildung 6) übertragen. Abbildung 6 Transfer der in 96-Well Platten bestimmten Bedingungen auf eine 1 ml HyperCel STAR AX PRC Fertigsäule. mau 2 1 Waschen 2, ph 7,, E FT aus reiner ms/cm Plasmabeladung Waschen 1 FT W1 W2 Elution, ph,, 2 ms/cm Albumin IgG Transferrin Albumin ml FT W1 W2 E P P = Plasma Die auf 96-Well Platten optimierten Bedingungen wurden für die chromatographische Aufreinigung von unverdünntem Plasma auf HyperCel STAR AX mit einer 1 ml PRC-Fertigsäule übertragen. Das Chromatogramm (Abbildung 6) und die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen bestätigten, dass die meisten Verunreinigungen durch Waschen mit hoher Leitfähigkeit beseitigt wurden, was zu einer Reinheit von 99 % der HSA-Fraktion in einem einzigen Schritt und einer Ausbeute von 9 % führte. Abbildung Auswirkung der Wasch- (W) und Elutionsbedingungen (E) auf Ausbeute und Reinheit von HSA (in Prozent) auf HyperCel STAR AX (Design of Experiments in 96-Well Filterplatten) Leitfähigkeit, Waschen (ms/cm) 1. Optimale Waschbedingungen ph-wert, Waschen 7. Reinheit (%) < > 98 Festwerte E ph 3, E Leitfähigkeit 2, Leitfähigkeit, Elution (ms/cm) 3 3. Wie in Abbildung 3 dargestellt, wies das während des Captureschrittes mit unverdünntem Plasma eingesetzte HyperCel STAR AX Sorbens eine DBC von >3 mg/ml auf, mehr als doppelt so hoch wie bei einem unter diesen Bedingungen getesteten konventionellen DEAE-Agarose-Sorbens. Ausbeute (%) HSA wurde durch eine einfache < Erhöhung des ph-wertes (,) ohne Salzzugabe eluiert, wodurch 6eine direkte Anwendung auf einer 6 8 orthogonalen Kationenaustauschersäule 8 9 (mit S HyperCel Sorbens) Optimale ermöglicht wurde. > 9 Elutionsbedingungen Dieser letzte Polishing-Schritt Festwerte auf S HyperCel führte zu einer W ph 7, aufgereinigten HSA-Fraktion, die bei ph 7, mit einer Reinheit W Leitfähigkeit 2, > 99 %, und einer Kapazität von etwa 6 mg/ml eluierte (Tabelle 2)..Tabelle. 2. ph-wert, Elution. Zweistufige Aufreinigung von Humanserumalbumin aus unverdünntem Plasma. eit (%) erte 3, igkeit 2, Leitfähigkeit, Elution (ms/cm) 3 Optimale Elutionsbedingungen Ausbeute (%) < > 9 Festwerte W ph 7, W Leitfähigkeit 2, Anreicherung auf HyperCel STAR AX Polishing auf S HyperCel Sorbens Beladung Unverdünntes Plasma ph, Eluat (HyperCel STAR AX) Kapazität (mg/ml) Ausbeute Reinheit > 3 mg/ml 9% 99% 6 mg/ml 9% > 99% ph-wert, Elution. Abbildung zeigt, dass die HSA-Ausbeute vor allem durch die Elutionsbedingungen beeinflusst wird (optimale Zone: ph 3,-,2 und Leitfähigkeit 2-27 ms/cm), während die Reinheit vor allem durch die Waschbedingungen beeinflusst wird (hohe Leitfähigkeit >1 ms/cm verbessert die Reinheit).

5 Anwendung 2. Frühe Entfernung von CHOPs (Chinese Hamster Ovary Proteine) vor Protein A Capture eines monoklonalen Antikörpers (MAb) Das Ziel dieser Studie bestand darin, die Auswirkungen einer Vorreinigungsstufe mit HyperCel STAR AX vor dem konventionellen Protein A Capture eines monoklonalen Antikörpers (MAb) aus einem Säugerzellkulturfeedstock zu bewerten (Abbildung 7). Der Inhalt verunreinigender CHOPs wurde mithilfe eines kommerziellen ELISA-Assays für die beiden in Abbildung 7 dargestellten Aufreinigungskonzepte verglichen. Abbildung 7 Konventionelle und alternative MAb-Aufreinigungskonzepte, darunter die Vorreinigungsstufe auf HyperCel STAR AX CCS CHOP: 13. ppm Eine Vorreinigungsstufe kann die Wirtschaftlichkeit eines Verfahrens durch Verlängerung der Lebensdauer der teuren Protein A Säule, die als Standard für das MAb-Capture verwendet wird, positiv beeinflussen. Bestellinformation HyperCel STAR AX Sorbens Artikelnummer ml ml ml L L L HyperCel STAR AX FT-Modus HyperCel STAR AX PRC Fertigsäulen CHOP: 362. ppm Artikelnummer Protein A (Bindungs-/ Elutionsmodus) CHOP: ppm Protein A (Bindungs-/ Elutionsmodus) CHOP: 3.3 ppm PRC Säule x HyperCel STAR AX, 1 ml PRC Säule 8x HyperCel STAR AX, ml PRCSTARAX1ML PRCSTARAXML. HyperCel STAR AX Sorbensplatten CHOP Inhalt x (ppm) AcroPrep ScreenExpert Platten: HyperCel STAR AX Sorbens für die Anionenaustauschchromatographie Artikelnummer 96WPSTARAX. 13 CCS 36 HyperCel STAR AX 33 Protein A HyperCel STAR AX + Protein A Die Daten zeigen, dass die Anwendung von HyperCel STAR AX vor Protein A zu einer verbesserten CHOP-Abreicherung führt (> 8-fach). Aufgrund dieser Synergiewirkung wird das finale CHOP- Niveau von einem ursprünglichen Wirtszellgehalt von 13. ppm auf ~ ppm (3-Log-Reduktion) reduziert. Die MAb-Wiederfindung beträgt 9 %.

6 Hauptniederlassung des Unternehmens Port Washington, NY, USA Tel.: gebührenfrei (USA) Tel.: Europäische Hauptniederlassung Fribourg, Schweiz +1 () Telefon LifeSciences.EU@pall.com Hauptniederlassung im Asien-Pazifik-Raum Singapur Tel.: sgcustomerservice@pall.com Filtration.Separation.Solution.SM Besuchen Sie uns im Internet unter Senden Sie eine an biopharm@pall.com Internationale Niederlassungen Die Pall Corporation hat Niederlassungen und Zweigstellen in der ganzen Welt, einschließlich: Argentinien, Australien, Belgien, Brasilien, China, Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Indien, Indonesien, Irland, Italien, Japan, Kanada, Korea, Malaysia, Mexiko, Neuseeland, den Niederlanden, Norwegen, Österreich, Polen, Puerto Rico, Russland, Schweden, der Schweiz, Singapur, Spanien, Südafrika, Taiwan, Thailand, USA und Venezuela. In allen großen Industrieregionen der Welt befinden sich Vertretungen. Besuchen Sie um die Ihnen nächstgelegene Niederlassung oder Vertretung von Pall zu finden. Die Informationen in dieser Druckschrift entsprechen dem Kenntnisstand zum Zeitpunkt der Drucklegung. Änderungen der Produktangaben sind vorbehalten. Wenden Sie sich für aktuelle Informationen bitte an Ihren regionalen Pall-Vertriebshändler oder direkt an Pall. 13, Pall Corporation. Pall,, AcroPep und HyperCel sind Marken der Pall Corporation. indicates a trademark registered in the USA und TM indicates a common law trademark. Filtration.Separation.Solution. ist ein Servicezeichen der Pall Corporation 3/13, PDF, GN USD 2831 (2)