ROLE OF MULTIDRUG RESISTANCE TRANSPORTERS IN POST-ISCHEMIC NEUROPROTECTION

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1 DISS. ETH NO ROLE OF MULTIDRUG RESISTANCE TRANSPORTERS IN POST-ISCHEMIC NEUROPROTECTION A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Sciences ETH Zurich presented by ANNETT FISCHER, born SPUDICH Pharmacist, dipl. pharm. Friedrich Schiller University Jena born December 20 th, 1978 citizen of Naumburg, Germany accepted on the recommendation of Prof. Dr. Heidi Wunderli-Allenspach, examiner PD Dr. Dirk M. Hermann, co-examiner Prof. Dr. Ursula Quitterer, co-examiner Zurich, 2007

2 SUMMARY The significance of ATP-binding cassette (ABC) transporters is increasingly recognized for the pharmacotherapy of CNS diseases such as epilepsy, brain cancer and HIV-associated dementia. While ABC transporters are more or less well studied in these disorders contributing to the phenomenon of multidrug resistance, their role in cerebral ischemia remained unclear. This study was carried out to investigate the relevance of ABC transporters in neuroprotection following ischemic stroke using the middle cerebral artery (MCA) thread occlusion model in mice. To address this issue, the expression of two best known ABC carriers, multidrug resistance protein (Mdr)-1 (also P-glycoprotein, ABCB1) and multidrug resistance-associated protein (Mrp)-1 (also ABCC1), was analyzed after focal cerebral ischemia by immunohistochemistry and Western blots, showing on the one hand upregulation of Mdr-1 and on the other hand a moderate downregulation of Mrp-1 in the ischemic brain. Immunohistochemistry also revealed exclusively an endothelial localization of both transporters, Mdr-1 being expressed at the luminal and Mrp-1 at the abluminal membrane of brain capillary endothelial cells. To clarify the function of both ABC transporters for the neuroprotective therapy of ischemic stroke, the brain accumulation and efficacy of selected Mdr-1 and Mrp-1 substrates were studied after Mdr-1 and Mrp-1 was pharmacologically deactivated or genetically deleted by mdr-1 a/b or mrp-1 knockout. A pharmacological inhibition of Mdr-1 by tariquidar (TQD) and a genetic mdr-1 a/b knockout considerably increased the accumulation and efficacy of the neuroprotective compounds FK506 (tacrolimus) and rifampicin after focal cerebral ischemia, as induced by 30 and 90 min of intraluminal middle cerebral artery (MCA) occlusion. In contrast, a pharmacological Mrp-1 inhibition by MK571 or a genetic mrp-1 knockout substantially reduced the brain concentrations of its substrates 17β-estradiol-D-glucuronide (17βEG) and S-nitrosogluthatione (GSNO) and, thus, dose-dependently reversed the neuroprotectivity of 17βEG, but also the toxicity of GSNO after focal cerebral ischemia

3 These results demonstrate the in vivo relevance of the Mdr-1 and Mrp-1 transporter systems after ischemic stroke, suggesting an antagonistic function of both transporters. The inhibition of Mdr-1 may be an efficacious strategy to improve neuroprotective drug action in cerebrovascular disease, whereas Mrp-1 may represent a to-date not described gateway for drugs to the ischemic brain. Thus, ideal canditates for neuroprotective therapies might be either substances that do not bind to Mdr-1 or that bind to Mrp-1, or the combination of both

4 ZUSAMMENFASSUNG Die Bedeutung von ABC Transportern gewinnt zunehmendes Interesse für die Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), wie Epilepsie, Hirntumore und HIV-assoziierte Demenz. Während ABC Transporter im Bereich dieser Erkrankungen zum Teil gut untersucht sind und für das Phänomen der Multidrug Resistenz verantwortlich gemacht werden, war ihre Rolle beim Schlaganfall bisher ungeklärt. Ziel dieser Studie war daher die Untersuchung der Relevanz von ABC Transortern für neuroprotektive Therapien beim ischämischen Schlaganfall unter Verwendung des Fadenokklusionsmodels bei der Maus. Zu diesem Zweck wurde die Expression der zwei bekanntesten ABC Transporter, Multidrug Resistance Protein (Mdr)-1 (auch P-Glykoprotein oder ABCB1 genannt) und Multidrug Resistance-Associated Protein (Mrp)-1 (auch ABCC1) nach fokaler zerebraler Ischemie mittels Immunhistochemie und Western Blot analysiert, wobei einerseits eine Hochregulierung von Mdr-1 und andererseits eine mäßige Herunterregulierung von Mrp-1 im ischämischen Gehirn gezeigt werden konnte. Die Immunhistochemie zeigte die ausschließlich endotheliale Lokalisation der beiden Transporter auf, wobei Mdr-1 auf der luminalen und Mrp-1 auf der abluminalen Membran von Hirnkapillarendothelzellen exprimiert wird. Um die Funktion beider ABC Transpoter für die neuroprotektive Therapie von ischämischem Schlaganfall aufzuklären, wurde die Akkumulation und die Wirksamkeit von ausgewählten Mdr-1- und Mrp-1-Substraten im Gehirn von Mäusen untersucht, bei denen Mdr-1 und Mrp-1 pharmakologisch deaktiviert oder genetisch ausgeschaltet waren. Eine pharmakologische Inhibition von Mdr-1 mittels Tariquidar (TQD) oder ein genetischer mdr-1 a/b Knockout steigerten beträchtlich die Akkumulation und die Wirksamkeit der neuroprotektiven Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Rifampicin nach fokaler zerebraler Ischämie, die durch 30- oder 90-minütige intraluminale Fadenokklusion der Arteria cerebri media bei der Maus induziert wurde. Im Gegensatz dazu, verringerte eine pharmakologische Mrp-1 Inhibition

5 oder ein genetischer mrp-1 Knockout erheblich die Hirnkonzentrationen der Mrp-1-Substrate 17β-Estradiol-17β-D-Glucuronid (17βEG) und S-Nitrosogluthation (GSNO) und verhinderte daher dosis-abhängig die Neuroprotektivität von 17βEG, aber auch die Toxizität von GSNO nach fokaler zerebraler Ischemie. Diese Ergebnisse demonstrieren die In vivo-relevanz der Mdr-1 und Mrp-1 Transportersysteme nach ischämischem Schlaganfall, wobei beide Transporter eine antagonistische Funktion zu haben scheinen. Die Inhibition von Mdr-1 könnte eine effiziente Strategie zur Verbesserung der neuroprotektiven Wirkung von Medikamenten bei zerebrovaskulären Erkrankungen sein, wohingegen Mrp-1 eine bislang nicht beschriebene Zutrittspforte für Pharmaka in das ischämische Gehirn darstellt. Ideale Kandidaten für neuroprotektive Therapien wären dementsprechend Substanzen, die entweder nicht an Mdr- 1 oder die mit besonderer Affinität an Mrp-1 binden, oder die beide Eigenschaften kombinieren