Kultur tierischer Zellen

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1 2008 AGI-Information Management Consultants May be used for personal purporses only or by libraries associated to dandelon.com network. S. J. Morgan und D. C. Darling Kultur tierischer Zellen Aus dem Englischen übersetzt von Christof Hauck Spektrum Akademischer Verlag

2 Inhalt Vorwort Danksagung Abkürzungen Grundlegende Methoden Einleitung 19 Wozu braucht man die Zellkultur? 19 Die verschiedenen Aspekte der Zellkultur 20 Sicherheitsratschläge 22 Grundlegende Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit Zellkulturen Ausrüstung und normaler Laborbetrieb 25 Das Zellkulturlabor Autoklaven und Heißluftsterilisatoren Arbeitsweise und Sicherheitsüberlegungen Was läßt sich in einem Heißluftsterilisator/Autoklaven sterilisieren? Wie stellt man fest, ob der Autoklav ordnungsgemäß gearbeitet hat? Sterile Arbeitsbänke Die verschiedenen Bautypen und ihr Arbeitsprinzip Inbetriebnahme und Reinigung steriler Arbeitsbänke Sicherheitsaspekte, Wartung und technische Überprüfung 32

3 6 Kultur tierischer Zellen Brutschränke Inkubationsbedingungen Inbetriebnahme eines Gasbrutschranks Tägliche Wartung und Kontrolle Zentrifugen Tips zum Gebrauch der Zentrifuge Mikroskope Sterile Arbeits techniken Der sterile Bereich der Arbeitsbank Umgang mit Pipetten und Plastikpipettenspitzen Entnehmen von Medium aus einem sterilen Vorratsbehälter Sterilfilter für Einmalspritzen Ansetzen von Medien Anforderungen an Medien für die Zellkultur Medienarten und Zusammensetzung Serumfreie Medien In welcher Form sollte man das Medium beziehen: als Pulver, Konzentrat oder gebrauchsfertige Lösung? Was benötigt man für das Ansetzen von Medien? Ansetzen von Medien aus Flüssigkonzentraten Ansetzen von Medien aus Pulver Filtereinrichtungen Filtermethode Autoklavierbare Medien Mediumzusätze Die Kultur permanenter Zellinien Verschiedene Arten etablierter Zellinien Vorbereitungen Beurteilung der Zellkulturen Zellzahlbestimmung Vorbereitungen bei Suspensionskulturen Vorbereiten von adhärenten Zellen Einsatz des Haemocytometers 70 Die Subkultivierung von Zellen 73 Ermitteln einer Wachstumskurve 75 63

4 Inhalt Produktion größerer Zellmengen Rollerkulturflaschen Spinnerkulturen Mikrohäger Primärkulturen Warum eigentlich Primärzellen? Methoden der Zellisolierung Isolierung von Fibroblasten aus Hühnerembryonen Isolierung von Rattenhepatocyten Menschliche Primärzellen Isolierung von Thyrocyten Isolierung von Endothelzellen aus der Nabelschnur Besondere Voraussetzungen für die Kultur von Primärzellen Immortalisierung von Primärzellen Kontaminationen Verschiedene Kontaminanten in Zellkulturen Beseitigung von Kontaminationen Antimikrobielle Wirkstoffe Desinfektion mit Formaldehyd Kryokonservierung Gefrierschutzmittel Das Einfriermedium Das Einfrieren von Zellen Auftauen der Zellen Zellkionierung Klonierung durch Verdünnung Mathematische Überlegungen feeder-zellschicht Ansetzen einer Klonierung durch Klonierungseffizienz Expandieren des Klons Klonierung in Weichagar Hintergrund Vorgehensweise Verd ünnung

5 8 Kultur tierischer Zellen Expandieren des Klons Alternativstrategien Ringklonierung - direktes Klonieren von Kolonien aus einer einzelnen Petrischale Weiterführende Techniken und Anwendungen Isolierung von Lymphocyten und Richtlinien zur Etablierung von Lymphzellinien Isolierung von Lymphocyten Isolierung aus menschlichem Blut Lymphocyten aus Tonsillen des Menschen Mauslymphocyten aus der Milz Mauslymphocyten aus Thymus und Lymphknoten Anreicherung von T- und B-Zellen Anreicherung von B-Zellen des Menschen Anreicherung von T-Zellen Andere Selektionsmethoden Kultivierung von Lymphzellinien T-Zellinien Test auf Spezifität Klonierung der Lymphzellinien Zellfusion Ziele und Anwendungen Zellen, die sich als Fusionspartner eignen Fusion der Zellen Vorbereiten der Fusion Die Fusion Kultur der Fusionsansätze Untersuchung des Wachstums der Hybride Expansion und Klonierung der Hybride Cytotoxizitätstests Killerzellen Voraussetzungen für Cytotoxizitätstests

6 Inhalt Vorbereitung der Effektorzellen Vorbereitung der Zielzellinien Der Cytotoxizitätstest Interpretation der Ergebnisse Immortalisierung mit dem Epstein-Barr-Virus Vorbereitung des Virus Bestimmung des Virentiters Immortalisierung menschlicher Lymphocyten Klonierung Transfektion Grundlagen und Ziele Die Herkunft der DNA Wie kann sich Fremd-DNA in einer kultivierten Zelle replizieren? Identifizierung transfizierter Zellen Einsatz transfizierter Zellen Transfektion adhärenter Zellen Auswahl der Methoden und Materialien Calciumphosphat-Copräzipitation Transfektion von nichtadhärenten Zellen mit Retrovirusvektoren Eigenschaften von Retroviren Konstruktion von Vektoren Auswahl der Methoden und Materialien Abnehmen von Kulturüberstand der Produzentenzellen Infektion der Zielzellen Alternative Transfektionsmethoden ao iai Anhang A: Glossar Anhang B: Nützliche Adressen Anhang C: Empfehlenswerte Index