* Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. Dr. h.c. W. Voelter. Prof. Dr. Ernst Bayer zum 70. Geburtstag gewidm et

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1 Zur Festphasenpeptidsynthese des Makrophagen-migrationsinhibierenden Faktors der Maus (mmif): Ein Vergleich verschiedener Syntheseansätze zur Darstellung der schwierigen C-terminalen Sequenz mmif(93-115) Solid Phase Peptide Synthetic A ppro ach es to M ouse M acrophage M igration Inhibitory Factor (m M IF): C om parison of D ifferent Strategies Producing the C-Terminal D ifficult Sequence P eptide m M IF ( ) Thom as Kaiser, W olfgang V oelter* Abteilung für Physikalische Biochemie des Physiologisch-chemischen Instituts der Universität Tübingen, Hoppe-Seyler-Straße 4, D Tübingen Prof. Dr. Ernst Bayer zum 70. Geburtstag gewidm et Z. Naturforsch. 52 b, (1997); eingegangen am 4. Dezember 1996 MIF, Solid Phase Peptide Synthesis, Difficult Sequence, Fragment Condensation, Coupling Conditions From solid phase peptide synthetic approaches of mmif(93-115) the C-terminal sequence turned out to be a typical difficult sequence peptide. Various stepwise syntheses were performed with different resins and coupling reagents. The Peptide was synthesized in 90% yield by solid phase fragment condensation of protected mmif(93-108) to mmif( ) 2-Chlorotrityl resin bound. Einleitung D e r m igrationsinhibierende F aktor (M IF) ist das erste entdeckte Lym phokin. U rsprünglich w urde M IF durch die nam ensgebende Fähigkeit nachgew iesen, die M igration von M eerschw ein chenm akrophagen zu inhibieren [1-2 ]. In den letzten Jahren stellte sich heraus, daß M IF im K ör per nicht n u r entscheidende F u n k tio n en bei E n t zündungsprozessen und der Im m unität hat [3-4 ], sondern d arü b er hinaus auch bei d er Z elld ifferen zierung d er H au t [5] und d er A ugenlinsen [6] eine wichtige Rolle spielt, sowie ebenfalls in den P ro zeß der Z ellproliferation m it einbezogen ist [7]. Von M IF sind die S equenzen d er hum anen (hm IF) [8] und der m urinen (m M IF) [9] Form, so wie die V ariante d er R atte (rm IF) [10] b ekannt, die sich durch hohe H om ologie {ca. 90% von 115 A m inosäuren) auszeichnen. D ie m urine Form ist im Vergleich m it dem F aktor d er R a tte sogar zu 99% hom olog. S ek u n därstrukturanalysen m ittels C D -M essungen w urden von den biologisch isolier ten Form en des hum anen und m urinen Faktors 1994 publiziert [11] w urden die en tsp rech en * Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. Dr. h.c. W. Voelter /97/ $06.00 den U ntersuchungen des Faktors der R atte über 'H -N M R -S tu d ien veröffentlicht [12]. Kürzlich w urden die E rgebnisse durch die K ristallstruktu ranalysen d e r hum anen [13] Form und des M IF aus R atte n le b e r [14] ergänzt. D iese nahezu identi schen F estk ö rp erd aten bestätigten übereinstim m end einen ausgeprägt hohen S ekundärstrukturanteil m it fünf /3-Faltblattbereichen (32% ) und zwei a-h elices (29% ) für den F aktor der R atte [14]. Bei d er m urinen Form handelt es sich um ein 12,5 kd a P rotein, das aus säm tlichen der 20 n a tü r lich vorkom m enden A m inosäuren zusam m enge setzt ist. F ü r die Totalsynthese dieses Proteins w urde die M ethode d er F estphasenpeptidsynthese gew ählt. Ü b e r diesen Weg konnten G u tte und M errifield schon 1970 die R ibonuclease A, ein P rotein m it 124 A m inosäuren [15] und N utt et al die aus 99 A m inosäuren zusam m engesetzte, A^-terminale Sequenz der H IV -Protease [16] d a r stellen. A llerdings liegen üb er diese Synthesepro d u kte n u r unvollständige analytische D aten vor. Im G egensatz zur Boc/Bzl-Strategie, m it der die letztgenannten Synthesen durchgeführt w urden, w ird in dieser A rb eit für die D arstellung des M IF d er M aus die Fm oc/tb u-strategie angew endet [17] Verlag der Zeitschrift für Naturforschung. All rights reserved. D Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.v. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. Zum ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung Keine Bearbeitung ) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition no derivative works ). This is to allow reuse in the area of future scientific usage.

2 282 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif Ergebnisse und Diskussion In Bezug auf die hier angew andte S ynth esestra tegie wird das Prinzip des m axim alen Schutzes verfolgt, indem alle trifunktionellen A m in o säuren m it perm an en tem Schutz ihrer S eitenketten einge setzt w erden [18]. In A nlehnung an den von B ayer [19] vorgeschlagenen Weg einer preview - Syn these, w ird zunächst das S yntheseverhalten des Cterm inalen Sequenzbereichs m M IF ( ) u n tersucht, d er m it d er folgenden A m inosäure P ro 92 eine günstige Schnittstelle für den alternativen A nsatz einer w eitergehenden k o nvergenten F est phasenpeptidsynthese aufweist [20-21], Vorschläge zu r schrittweisen D arstellung des C-term inalen Fragments m M IF ( ) D urchfü hru ng der Festphasensynthese im batch Verfahren a u f dem Wang P olym erträger Z u r D arstellung im 'batch'-v erfahren w urde zu nächst das W ang -H arz als polym eres T rägerm a terial gew ählt. H ierbei handelt es sich um ein mit 1% D ivinylbenzol copolym erisiertes p-b enzyloxybenzylalkohol Polystyrolharz [22]. D as Polym er hat sich bei d er Synthese von P eptiden b ew ährt [23] und w urde von R am age et al. erfolgreich als T rägerm aterial für die schrittw eise T otalsynthese von U biquitin, einem aus 76 A m inosäuren zusam m engesetzten Polypeptid, eingesetzt [24], D e r schrittw eise A ufbau erfolgte auf einem mit 0,64 m M ol Fm oc-a la/g b eladenen Polym er, über autom atisierte Synthesezyklen m it altern ieren d en Fm oc-a bspaltungs- und A cylierungsschritten, die durch den K aiser -Test (N inhydrin-test) [25] auf V ollständigkeit überprüft w urden. Als in situ Acylierungsreagenz w urde B enzotriazol-l-yl-oxy-tris(dim ethylam ino)-phosphonium hexafluorphosphat (B O P ) [26] gew ählt und in dreifachem Ü berschuß (Fm oc-a S / B O P / D IE A = 1 : 1 : 2) in D M F als L ösungsm ittel um gesetzt. Im V erlauf d er Synthese w urden bei d er E in fü h rung d er en tsprechenden A S-D erivate im B ereich m M IF ( ) starke V erklum pungsprozesse der Peptidharzkugeln beobachtet. A ußerdem w urde im A nschluß an diese U m setzungen eine zunehm ende V olum enverm inderung des P e p tid harzes festgestellt, die bei anschließenden L ö sungsm ittelw echseln zu D CM noch v erstärk t auf trat. D ie durchgeführten N in hydrinkontrollen w a ren in diesem Sequenzbereich eindeutig, so daß keine M ehrfachkupplungen durchgeführt w urden. L etztere w aren in Form von D oppelacylierungen bei d er E inführung von A sn98 und Val95 sowie ei n er D reifachkupplung bei Ile97 notwendig, deren U m setzungen ern eu t von oben beschriebenen Schw ierigkeiten begleitet w urden. N ach A bspaltung vom Träger und der Schutz gruppen w urde das R o h p ro d u k t (1 b) m ittels RPH P L C untersucht. D as P rodukt erwies sich als ein schwierig zu reinigendes Peptid, da lyophilisiertes 1 b eine sehr schlechte Löslichkeit zeigte. Die massenspektrom etrische U ntersuchung von 1 b resul tierte in vielen A bbruch- und Fehlsequenzen (siehe Tab.I). D er schrittw eise Syntheseansatz a u f einem Tenta kel-h a rz nach der con tin u ous f lo w -M ethode D ie nachw eisbaren Fehl- und A bbruchsequen zen bei d er vorangegangenen D arstellung belegen eine unzureichende A ussagekraft der K ontrollen ü b er den qualitativen N inhydrin-farbtest, insbe sondere in d er schw ierigen Sequenzregion m M IF ( ). E in ern e u ter A nsatz w urde schrittw eise, diesm al im D urchflußverfahren ( con tin u ous flo w ') durchgeführt. A utom atisierte con tin u ous flo w -Synthesen erm öglichen eine k ontinuierliche synthesebegleitende feed b a ck K ontrolle ü ber \J V - m on itorin g [27-28]. A ls stationäre Phase w urde das TentaGel -SPH B T rägerm aterial, ein mit dem TFA labilen W ang A n k er (P H B ) funktionalisiertes Tentakel- Tab. I. Auswertung des Ionenspray-Massenspektrums des synthetisierten Rohprodukts mmif(93-115) 1 b mit einer Zuordnung der experimentellen m /z -Werte zu ent sprechenden Peptidfragmenten theoretisch errechneter Fehl- und Abbruchsequenzen. M assen (d etek tiert in %) M assen (berechnet) Zuordnung zu C-terminalen mm IF Peptidfragmenten ,0 1310,0 1266,0 1441, , , , , ,11 939, ,83 [m M IF ( ) + H ]+ [m M IF (93-115) + 2H ]2+ [m M IF ( ) + H ]+ [m M IF (93-115) -A sp + 2H ]2+ [m M IF (93-115) - Ile + 2H ]2+ [m M IF ( ) + H ]+ [m M IF ( ) + H ]+ m M IF ( ) + H ]+ [m M IF ( ) + H ]+ [m M IF (93-115) + 3H ]3+ m M IF ( ) + H ]+ m M IF ( ) + H ]+ (23) (100) (47) (50) (26) (63) (24) 939,0 (50) 882,0 (25) 840,0 (40) 783,0 (26)

3 Th. Kaiser-W. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 283 polym er, mit einer Beladung von 0,19 mmol Fm oc-a la/g eingesetzt. Tentakelpolym ere sind w eitgehend unabhängig von der Polystyrolmatrix und zeichnen sich durch ein nahezu hom ogenes physikalisch-chemisches Verhalten aus, das in w eitgehend lösungsm ittelunabhängigen Q uelleigenschaften resultiert. Die kinetischen U m satzraten entsprechen annähernd denen in m atrixfreien Lösungen [29]. Diese A rt von Trägerm aterial hat sich in den letzten Jahren gerade bei solchen, als difficult sequence'"-synthesen charakterisierten, Peptiddarstellungen bew ährt [19, 30-34], 2-(lH - B enzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetram ethyluronium - tetrafluorborat (TBTU ) wurde anstelle von BOP als in situ Acylierungsreagenz eingesetzt [35], D er Verlauf der einzelnen Synthesezyklen w urde bei A = 304 nm aufgezeichnet und die Vollständigkeit der jeweiligen Fm oc-abspaltungsschritte m ittels U \ - m onitoring durch ein erneutes E rreichen der Basislinie angezeigt [28]. Die resultierenden Fm oc-abspaltungsprofile zeigten eine verlangsam te Fmoc-Freisetzung ab Position (jly 108 und eine kontinuierliche Zunahm e des tailing -Prozesses im Sequenzbereich m M IF( ). A bspaltungszeiten von m ehr als 40 min w a ren notw endig und die entsprechenden K upplungen w urden ebenfalls zeitlich verlängert. D ieser Syntheseansatz wurde daraufhin auf der Stufe m M IF( ) (2 a) vorzeitig unterbrochen und durch Freisetzung von Peptid (2 b) überprüft. D ie chrom atographischen (Abb. 2) und massenspektrom etrischen A nalysen (Abb. 3) des lyophilisierten und in dem H PLC-Lösungsm ittelelutionssystem gut löslichen Rohprodukts, lieferten sehr heterogene Profile und bestätigten die Ergebnisse der vorangegangenen Synthese weitgehend (Tab. II). D ieser Syntheseansatz wurde nicht w eiter fo rtgesetzt und unterstreicht die W ichtigkeit einer zuverlässigen Ü berprüfung der ablaufenden Acylierungsreaktionen. Diese konnten, im Vergleich zur Fm oc-d eblockierung, über das U V - m onitoring T time [min] Abb 2. RP-HPLC Profil vom Rohprodukt m M IF( ) 2 b. System: Gynkotek (München, Deutschland); Säule: 4,6 Nucleosil C )8, Macherey Nagel (Düren, Deutschland). Bedingungen: Fließmittel: A: 0,05% TFA/ H20 und B: 0,05% TFA/CH3CN. Gradient: 0-1 min 15% B, min 15-50% B; Flußrate: 1 ml/min; D etektion: 214 nm. IS-MS Analyse (API III/TAGA 6000 E Massenspektrometer der Firma Sciex, Toronto, Kanada): Peak 1 = m M IF( ), Peak 2 = mm IF( ) und Peak 3 = m M IF ( ). bei der continuous flo w M ethode nicht erfaßt w erden. D ie schrittweise Festphasensynthese nach dem batch -Verfahren a u f dem 2-C h lortrityl - P oly styrolträger A ufgrund der Erfahrungen mit dem lw ang - und dem T entakel-h arz, w urde im Z usam m enhang mit den resultierenden Syntheseschwierigkeiten im C -term inalen Bereich von m M IF für einen erneuten schrittw eisen D arstellungsversuch NH2-Asp(OtBu)93-Arg(Pmc)-Val-Tyr<tBu)-De-Asn(Trt>-Tyr(tBu>-Tyr(tBu>-Asp(OtBu)101- Met-Asn(Trt)-Ala-Ala-Asn(Trt>-VaI-Gly-Tip(Boc)109-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu>-Thr(tBu)- Phe-Ala115-OH Abb 1. Primärsequenz von m M IF(93-115) mit permanentem Schutz der Seitenketten.

4 284 Th. Kaiser-W. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 778,0 Abb 3. IS-MS vom Rohprodukt mmif( ) 2 b. Massenspektrometer: API III/TAGA 6000 E der Firma Sciex (Toronto, Kanada). Eine Interpretation der experimentell ermittelten Daten erfolgt in Tab. II. Tab. II. Auswertung und Zuordnung des IS-MS vom Rohprodukt mmif( ) 2 b. Die Daten sind nach folgender Anordnung zusammengestellt: Peptid + Schutzgruppen, Rumpfsequenzen und Fehlsequenzen. M assen (detektiert) M assen (berechnet) Zuordnung zu C-terminalen mmif Peptidfragmenten 1611, [m M IF ( ) + tbu + H ]+ 1577,0 1577,65 [m M IF( Na]+ 1555,0 1555,65 [m M IF( H ]+ 778,0 778,32 [mmif( H ] ,0 1441,57 [m M IF( H ]+ 1309,0 1309,37 [m M IF( H ]+ 1195,0 1195,27 [m M IF ( H ]+ 1124, [m M IF( H ]+ 1053,0 1053,11 [m M IF( H ]+ 938,0 939,01 [m M IF( H ] ,88 [m M IF( h r 1498,0 1498,59 [m M IF( Gly + H ] [m M IF( Met + H ]+ 1369, [m M IF( Ala + H ] [m M IF( Asp -Asn + H ]+ 1238, [m M IF( Met -Trp + H ] [m M IF( Met -Asn -Ala + H ]+ 978, [m M IF( Phe + H ]+ eine, mit einem Trityl-A nker funktionalisierte Polym erm atrix gewählt, das 2-Chlortritylchlorid- H arz ( 2-Clt'-chlorid- bzw. das Barlos -Harz) [36]. Bei der Verwendung dieses äußerst säurelabilen Trägerm aterials ist die D urchführung einer DC- A nalytik ( off-lin e m on itoring ) über die A b spaltung C-term inal freier, aber ansonsten vollständig geschützter Peptide möglich. Dam it ergibt sich, durch die Kombination von UV-Kontrolle und einem Test mit N inhydrin-sprühreagenz auf den DC-Trägern, eine zusätzliche M öglichkeit zur synthesebegleitenden Ü berprüfung aller Kupplungs- und Fm oc-a bspaltungsreaktionen [37, 38]. Das Barlos -H arz wurde mit 0,17 mmol Fmoc- Ala/g beladen [36] und die Synthese folgenderm a ßen modifiziert: Die Fm oc-a bspaltungen wurden repititiv und mit verschiedenen Piperidinlösungen durchgeführt [39]. Als Acylierungsreagenzien w urden T B T U und bei nachfolgenden D oppelkupplungen' B O P eingesetzt. Im Fall von D oppelkupplungen', die in der synthetisch problem ati-

5 Th. Kaiser-W. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 285 sehen Region m M IF (95-108) autom atisch und zudem in doppeltem K upplungsansatz erfolgten, w urden im A nschluß A cetylierungen ( capping ) durchgeführt [16]. A uf der Zwischenstufe m M IF( ) w urde der Syntheseverlauf ergänzend durch Freisetzung von Peptidm aterial vom Träger in geschützter Form (3 b) und nach A bspaltung der Schutzgruppen (3 c) überprüft. Die unterschiedlichen chrom atographischen (Abb. 4a) und elektrophoretischen A nalyseverfahren (A bb. 4b) [40, 41] bestätigten eine erfolgreiche U m setzung und einen sehr hohen R einheitgrad des R ohprodukts 3 c. Im w eiteren V erlauf der Synthese w urden ab weichende Farbreaktionen bei den K aiser -Tests nach Fm oc-a bspaltungen festgestellt [42], Diese wurden ebenfalls im A nschluß an einige Acylierungsreaktionen beobachtet, konnten allerdings in Kom bination mit der D C -A nalytik auf DM F-Lösungsm itteleinschlüsse im Peptidpolym er zurückgeführt werden. Nach der Einführung von A la105 wurden m ittels DC zudem unzureichende Acylierungsreaktionen nachgewiesen. Starke K lum penbildung und deutliche V olum enverm inderungen des Peptidharzes w urden bei Einführung von A sn 103 beobachtet. Nach der A bspaltung aller Schutzgruppen und der Freisetzung des Peptids (4 c) w urden über RP- H PLC zwei Fraktionen isoliert (A bb. 5) und massenspektrom etrisch die verschiedenen Produkte analysiert und zugeordnet. Die in Tab. III zugeordneten Sequenzen belegen die Notwendigkeit der zusätzlich durchgeführten A cetylierungsreaktionen im V erlauf der Synthese. D ie acetylierten A bbruchsequenzen w erden w eiteren U m setzungen in den Synthesezyklen entzogen und lassen sich später m it R P-H PL C ab trennen (siehe Abb. 5, Fraktion 1). Die E rgebnisse der durchgeführten schrittw eisen Syntheseansätze bestätigen ausgeprägte Schwierigkeiten bei der D arstellung der C-terminalen Sequenz und som it eine Z uordnung von m M IF(93-115) als difficult sequence Peptid [43]. Interm olekulare A ggregationen der P eptidketten in der gequollenen H arzen sind nach K ent [44] als prim äre U rsache dieses Phänom ens anzusehen. K ristallstrukturdaten des rm IF zeigen eine bevorzugte Ausbildung von ß-Faltblattstruktur (Fragm ent ) [14], in diesem, mit dem Faktor der M aus identischen Sequenzbereich. A 214 A ) time [min] time [min] Abb 4. RP-HPLC (A)- und CZE (B)-Profile vom Rohprodukt mmif( ) 3 c. HPLC-Bedingungen: Anlage, Säule und Fließmittel siehe Abb. 2; Bedingungen: Gradient: 0-1 min 5% B, 1-31 min 5-95% B; Flußrate: 1 ml/min; Detektion: 214 nm. CZE-Bedingungen: System: BioFocus CE 3000 (Bio-Rad, München, Deutschland); Kapillare: 24 cm x 25 /xm (beschichtet); Puffersystem: 0.1 M Phosphatpuffer, ph = 2,5 (Bio-Rad); Konzentration: ca. 50 ^g / 50 ^1, Injektion (elektrokinetisch): 8 sec/10 KV bei 15 C; Lauf: 15 KV (von + nach -) bei 15 C; Detektion: 214 nm.

6 286 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif satz durchgeführt. Aus den E rgebnissen d er v o ran gegangenen schrittw eisen D arstellungen geht h e r vor, daß die eigentlichen Syntheseschw ierigkeiten erst nach d er Position 108 au ftraten. Z udem konnte gezeigt w erden, daß die D arstellung von m M IF ( ) auf dem 2-C lt -Träger (3 a) zu dem gew ünschten R o h p ro d u k t m it einem sehr h o hen R einheitsgrad fü h rte (A bb. 4). A ufgrund die ser R esultate w urde m M IF ( ) als A us gangsfragm ent für die F rag m en tk o n d en satio n ge wählt, obgleich d er W -term inale T rp(b oc)-r est keine ideale V erknüpfungsstelle darstellt. D arstellung des gesch ützten P eptidfragm en ts m M I F ( ) Abb 5. RP-HPLC Profil vom Rohprodukt mmif(93115) 4 c. HPLC-Anlage, Säule und Fließmittel siehe Abb. 2. Bedingungen: Gradient: 0-1 min 5% B, 131 min 5-60% B; Flußrate: 1 ml/min; Detektion: 214 nm. IS-MS Analyse (API III/TAGA 6000 E Massen spektrometer der Firma Sciex, Toronto, Kanada): Zuordnung der Nebenprodukte von Fraktion 1 in Tab. III. Peak 2: mmif(93-115). Tab. III. Auswertung und Zuordnung der IS-MS Ana lyse, der von 4 c isolierten HPLC Fraktion 1 (Abb. 5). M assen (d etektiert in% ) M assen (berechnet) Z uordnung zu C-term inalen mmif Peptidfragm enten 1394, ,0 698,0 (25) (32) (100) (82) 1395, ,36 709,36 698,18 [A cetyl-m M IF( ) [Acetyl-m M IF( ) [Acetyl-m M IF( ) [A cetyl-m M IF( ) -H + 2Na]+ + Na]+ -H + 3Na]2+ + 2Na] ,0 1259,0 652,0 640,5 (25) (40) (78) (58) 1281, ,27 652,27 640,77 [Acetyl-mMIF( ) [A cetyl-m M IF( ) [Acetyl-m M IF( ) [A cetyl-m M IF( ) -H + 2Na]+ + N al+ -H + 3Na]2+ + 2Na] ,0 (18) 1188,0 (11) 616,5 (32) 1210, ,18 615,68 [Acetyl-m M IF( ) -H + 2Na]+ [A cetvl-m M IF( ) + Na]+ [Acetyl-m M IF( ) -H + 3Na]2+ U ntersuchungen zu r D arstellung des C-term inalen Fragm ents m M IF ( ) durch F ragm ent kon den sation an der festen Phase A ufgrund d e r erschw erten Z ugänglichkeit des C -term inalen Peptidfragm ents m M IF ( ) w urde ein alternativer, k o n v erg en ter S ynthesean Die Festphasensynthese w urde im 'batch '-V e rfahren auf dem säurelabilen 2-C lt -Träger d u rch geführt. A lle Teilschritte w urden durch D C -A nalytik und N inhydrinfarbtests überprüft. Im V er gleich zu den vorangegangenen Syntheseansätzen zur D arstellung von m M IF ( ) erfolgte der schrittw eise A ufbau d er Sequenz m M IF ( ) w eitaus unproblem atischer. Z u d em w urde eine kontinuierliche V olum enzunahm e d er P ep tid m a trix je K upplungszyklus und eine Z un ah m e im E ndvolum en von ca. 2/3 festgestellt. Die A bspaltung des P eptids in C -term inal freier, aber ansonsten vollgeschützter Form erfolgte in essigsaurer Lösung (D C M / T F E / H A c = 7:2:1) innerhalb von 2 h [36]. D as R o h p ro d u k t (5 b) w urde m ittels FA B-M S als geschütztes m M IF ( ) bestätigt und die anschließende analytische R P -H P L C (A bb. 6) zeigte eine hohe R einheit. E ine w eitere A ufreinigung von 5 b erfolgte über M itteldruck-c hrom atographie (M P-L C ) und Säu lenchrom atographie m it dem Laufm ittelsystem CHC13 / M eo H / H A c (7:2:0,5). Zusätzlich w urde von einer geringen M enge des Syntheseproduktes entschütztes P eptid m it einer T FA / scavan ger Lösung freigesetzt. D as R o h p ro dukt (5 c) w urde ü b er R P -H P L C analysiert (A bb. 7), einzelne F rak tio n en isoliert und m assenspektrom etrisch (IS-M S) ch arakterisiert, sowie die P ro duktreinheit ü b er K ap illarzo n en elek tro p h o rese (C Z E ) k o n trolliert (A bb. 8). R P -H P L C und m assenspektrom etrische A n a lyse der isolierten F rak tio n en von 5 c belegen eine hohe R einheit des synthetischen P rodukts 5 b. Z u dem weist 5 b eine gute Löslichkeit in D M F auf

7 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 287 A Abb 6. RP-HPLC-Profil von dem geschützten Rohprodukt mmif(93-108) 5 b. HPLC-Bedingungen: Säule, HPLC-Anlage und Fließmittel siehe Abb. 2.; Gradient: 0-1 min 80% B, 1-11 min % B, min 100% B; Flußrate: 1 ml/min; Detektion: 254 nm; Konzentration: ca. 0,5 mg/ml (A/B); Retentionszeit: 20,23 min, 5 b. i i r time [min] Abb 8. CZE-Profil des Rohprodukts mmif(93-108) 5 c. Bedingungen: Kapillare: 30 cm x 50,wm (beschichtet); Puffer: 5 mm Tris, 5 mm Borax, 7 M Harnstoff, 50 mm SDS, ph 8,7; Injektion: 15 KV, 5 sec; Lauf: 15 KV, 15 C (von + nach -), Detektion: 214 nm. Abb 7. RP-HPLC Profil vom Rohprodukt mmif(93-108) 5 c. HPLC-Anlage, Säule und Fließmittel siehe Abb 2. Bedingungen: Gradient: 0-1 min 5% B, 1-31 min 5-60% B; Flußrate: 1 ml/min; Detektion: 214 nm. IS-MS Analyse (API II I/TAG A 6000 E Massenspektrometer der Firma Sciex, Toronto, Kanada): Peak 1: mmif(93-108) als Met(O); Peak 2: mmif(93-108) und Peak 3: [mmif(93-108) - (A = 17 Da.)]. und ist somit als Fragm ent für einen konvergenten Syntheseansatz gut geeignet. D arstellung des C-terminalen Fragments m M IF ( ) Aufgrund der erfolgreichen Synthese von m M IF( ) durch schrittweisen Aufbau auf dem B arlos -H arz (3 a), wurde dieses Trägerm aterial auch für den konvergenten Syntheseansatz ausgewählt. Bei U ntersuchungen zu konvergenten Festphasensynthesen konnten Barlos et al. belegen, daß Fragm entkondensationen um so schneller verliefen, je geringer die A usgangsbeladung an C- term inaler A m inosäure bei den eingesetzten Polystyrolharzen w ar [38]. W eitere, kürzlich erschienene Publikationen bestätigen diesen Sachverhalt, gerade auch im Z usam m enhang mit difficult sequence Problem en [45, 46], 2-Clt -Chloridharz wurde erneut mit Fmoc-Ala- O H beladen und die D arstellung mit einer resultierenden Beladung von 0,16 mmol Fmoc-Ala/g w iederholt. D as analysierte, entschützte R ohprodukt (6 c) wies eine sehr hohe Produktreinheit auf (> 90% R P-H PLC) und bestätigte die gute R eproduzierbarkeit der vorangegangenen Synthese von 3 a (siehe A bb. 4).

8 288 Th. K aiser-w. V oelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif D as dargestellte P eptidharz (6 a) stellt dam it ein geeignetes A usgangsm aterial für die konvergente F estphasenpeptidsynthese dar. m M IF ( ) (10 b) in hoher R einheit (ca. 90% H P L C -A nteil) und A usbeute (90% ) erhalten (A bb. 9). Fragm entkondensation von m M IF ( ) m it dem h arzgebu ndenem C-term inalen Fragm ent m M IF ( ) D ie K ondensationsreaktion w urde, e n tsp re chend d er schrittw eisen E inführung einzelner ASD erivate, in einem dreifachem Ü bersch u ß (F rag m ent 5 b / T B T U / D IE A = 1:1:2) und zunächst in D M F als L ösungsverm ittler (0,06 M L ösung in Bezug auf 5 b, 30 m in A ktivierungszeit) d u rchge führt. N ach der autom atischen A bsp altu n g d er N term inalen F m oc-g ruppe des vorgelegten P e p tid harzes 6 a, w urde die hellgelb gefärbte, klare A k ti vierungslösung m it d er P eptidm atrix versetzt und bei R. T. geschüttelt. Die R eak tio n w urde nach 14 S tunden been d et (negativer K aiser -Test) und nach einem anschließenden A cetylierungsprozeß d er A nsatz aufgearbeitet. Von dem erh alten en P eptidharz (7 a) w urde, nach Freisetzung vom T rä germ aterial und A bspaltung aller S chutzgruppen, das P eptid m M IF ( ) im R o h p ro d u k t (7 b) m it einem A nteil von nur ca. 10% (R P -H P L C ) nachgew iesen. A ufgrund der geringen K upplungseffizienz w ur den ern eu te U m setzungen, u n te r vergleichbaren K upplungsbedingungen und A n satzgrößen, in v e r schiedenen L ösungsm itteln bzw. L ösungsm ittelge m ischen (K onzentration von P ep tid frag m en t 5 b: 0,05 M ) durchgeführt. D ie U m setzung w aren sow ohl in D M SO, als auch im G em isch D M S O /D M F deutlich verzögert und w urden nach 6 Tagen S chütteln bei R. T. ab gebrochen. In beiden Fällen w urden P eptid harze (8 a und 9 a) erhalten, deren freigesetzte P ro d u k te (8 c und 9 c) sehr hetero g en e R P -H P L C Profile lieferten. Ein w eitaus besseres Q u ellv erh alten d er P eptidm atrix 6 a w urde m it dem L ösungsm ittelge misch D M F / N M P + 1% Triton X-100 festgestellt, das in Form d er m agic m ixtu re (D C M /D M F / N M P 1:1:1 + 1% Triton X-100 in 4 N E th y len car bon at) von Z hang et al. entw ickelt und in Bezug auf difficult sequ en ce -S yn th esen erfolgreich ein gesetzt w urde [47], Die erfolgte A cylierungsreaktion in diesem Lösungsm ittelgem isch w ar nach 5 S tunden abgeschlossen und nach A b spaltung von T räger und Schutzgruppen w urde das P eptid Abb 9. RP-HPLC Profil des Kondensationsprodukts mmif(93-115) 10 c. HPLC-Anlage, Säule und Fließmit tel siehe Abb 2. Bedingungen: Gradient: 0-1 min 5% B, 1-31 min 5-60% B; Flußrate: 1 ml/min; Detektion: 214 nm. D er A nsatz der Fragm entkondensation (Abb. 10) stellt eine erfolgreiche M ethode zur Synthese des P eptids m M IF ( ) dar. Das dargestellte P ep tidpolym er (10 a) eignet sich als A usgangsm aterial für die Fortsetzung d er Totalsynthese vom m uri nem MIF. A ufgrund d er Ergebnisse der ersten F ragm entkupplungen bietet sich eine W eiterfüh rung d er konvergenten Synthesestrategie an. M it d er 2-C lt -Polystyrolm atrix w urde ein T rägerm a terial verw endet, das es erm öglicht die en tsp re chenden R eak tio n en auf der festen Phase zusätz lich ü b er D C -A nalytik zu verfolgen. E xperim enteller Teil F ü r die Festphasensynthesen im 'batch'-v erfah ren w urde ein vollautom atisches P eptidsynthese gerät E C O SY N P, der Firma E ppendorf/b iotronik (M aintal, D eutschland) verw endet. Die Synthese im D urchflußverfahren w urde auf einem halbau tom atischen P eptidsynthesegerät BIO LY N X 4175 durchgeführt und durch U V -M essungen im D urch flu ß p h o to m eter Biochrom U ltraspec II (beide G eräte von der Firma LKB, U ppsala, Schw eden) bei 304 nm kontrolliert. - Für die

9 Th. Kaiser-W. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 289 Fmoc-Trp(Boc)10,-Asii(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-AIa115-0-R 1.) 30% Pip / DMF 2.) Fragmen tkupplung mit Finoc-Asp(0tBu) Gly10,-OH: Ansätze: mmif(93-115) / TBTU / DIEA = 3: 3: 6 a) DMF (0,06 M) 14 Stunden b) DMSO (0,05 M) > 6 Tage c) DMSO / DMF (0,05 M) > 6 Tage d) DMF / NMP + 1% Triton X-100, Zusatz von 1,5 AnteUen HOBt (0,05 M) 5 Stunden Fmoc-Asp(0tBu)93-Arg(Pmc)-Va]-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Tyr(tBii)-Asp(0tBu)-Met-Asii(Trt)- Ala104-Ala-Asn(Trt)-Val-Gly108-Trp(Boc)109-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Ala115-O-R Abb 10. Übersicht über die Ansätze der Fragmentkondensationen zur Darstellung von mmif(93-115), R = 2-Clt - Polystyrolträger. D ünnschichtchrom atographie (D C) wurden DC- Fertigplatten, beschichtet mit Kieselgel 60 F254, d er Firm a M erck (D arm stadt, D eutschland) b e nutzt. Folgende Laufm ittelsystem e w urden verw endet (jeweils v/v/v): A = CH Cl3/M eo H /H A c = 7:1,5:1; B = Toluol/M eo H /H A c = 7:1,5:1,5; C = CH C l3/m e0 H /C 6H6/H20 = 8:8 :8 :1. Die C hrom a togram m e wurden mit UV-Licht bei 254 nm visualisiert und zusätzlich im Anschluß mit N inhydrin angefärbt. - M itteldrucksäulenchrom atographie (M P-LC) wurde mit dem HPLC-System: BT-8100 Pum pe, BT 8200 UV/VIS D etektor (beide G eräte von der Firma Eppendorf/Biotronik, M aintal, D eutschland) und einem C-R 6A C H ROM A TO - PA C-Integrator der Firma Shimadzu (Duisburg, D eutschland) durchgeführt. Es w urde eine Säule Si 60 (G röße B [310-25], /im ) der Firma M erck (D arm stadt, D eutschland) m it dem L aufmittelsystem CHCl3/M eo H /H A c (7:2:0,5 v/v/v) verw endet. - Für die Säulenchrom atographie wurde eine Flash Säule der Firma J. T. B aker (B aker Chem ikalien, G roß-g erau, D eutschland) eingesetzt. U nter Verwendung von Kieselgel 60 ( //m Korngröße) der Firma M erck (D arm stadt, D eutschland) als stationäre Phase, erfolgte die Trennung mit dem Laufm ittelsystem C H C l3/m eo H /H A c (7:2:0,5 v/v/v). - Für die R e verse Phase High Perform ance Liquid C hrom atographie (R P-H PLC) wurde folgende Anlage eingesetzt: High Precisions Pum p M odel 480 und UV- D etek to r BT 3030 der Firm a G ynkotek (M ünchen, D eutschland), C-R 6A CHROM ATOPAC- Integrator der Firm a Shimadzu (Duisburg, D eutschland) und eine selbstgepackte Säule: 4,6 Nucleosil C i8 der Firma M acherey-nagel (D üren, D eutschland). Als Laufm ittel wurden die Systeme: H ,05% TFA (A ) und C H 3CN + 0,05% TFA (B) verw endet. - Die Produkte w urden an einem LOC-1 Lyophilisator der Firma Christ (G efriertrocknungsanlagen G m bh, O sterode/h arz, D eutschland) gefriergetrocknet. - K a pillarzonenelektrophoresen (C Z E ) w urden an einem BioFocus CE 3000 G erät der Firma Bio-Rad (M ünchen, D eutschland) durchgeführt. - FAB- M assenspektren w urden mit einem Varian MAT- 711 der Firm a Finnigan (Brem en, D eutschland) aufgenom m en. Laserdesorbtions-M assenspektren (LD-M S) w urden mit einem K ratos M A LD I III der Firma Shim adzu (Duisburg, D eutschland) durchgeführt. Ionenspray-M assenspektren (IS- MS) w urden mit einem A PI III/TA G A 6000 E G e rät der Firm a Sciex (Toronto, K anada) verm essen. - A m inosäureanalysen wurden an einem LC 3000 der Firm a Eppendorf/B iotronik (M aintal, D eutschland) durchgeführt. - D er Substitutionsgrad von Fmoc-AS- bzw. Peptidharzen wurde über die U V -A bsorbtion an einem Uvikon 930 Spektrom eter der Firm a K ontron Instrum ents (Eching,

10 290 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif D eutschland) erm ittelt. H ierbei w urden H arzm en gen von 1-3 mg eingesetzt und in 3 ml 25% Pip/ D M F die A bsorbtion bei 290 und 301 nm gem es sen [48, 49], D a w ährend der bare/? -Synthesen H arzp ro b en für analytische K ontrollen e n tn o m m en w urden, erfolgte die B erechnung d er th e o re tischen E ndbeladung d er P eptidharze (in m M ol Peptid/g H arz) nach einer von B arlos et al. publi zierten Form el [38]. Alle nicht experim entell mit d er U V -M ethode erm ittelten A n g ab en ü b er A us b eu ten w urden über diese Form el b erechnet. D ie Lösungsm ittel D ichlorm ethan (D C M ), D ie t h y lether (E E ), M ethanol (M eo H ) und C h lo ro form (CHC13) w urden nach S tandartvorschriften g etrocknet und destilliert. D ie Fm oc-a m inosäuren, das B O P -K upplungsreagenz und das W ang H arz sind P rodukte d er Firm a N ovab iochem (H eidelberg, D eutschland). D as T B T U -R eagenz und das TentaG el -S-PH B -Trägerm aterial w urden von der Firm a R ap p Polym ere (T übingen, D eutschland) bezogen. 2-C hlortritylchlorid-h arz w urde von der Firm a C B L (Patras, G riech enland) erw orben. /V -H ydroxybenzotriazol (H O B t), D iisopropylethylam in (D IE A ) und T rifluorethanol (T F E ) sind P rod u k te d er Firm a Fluka (Buchs, Schweiz). Triton X-100, Thioanisol (T A ), E thandithiol (E D T ) und Trifluoressigsäure (TFA ) w erden ü b er die Firm a A ldrich (Steinheim, D eutschland) bezogen. A^/V-Dimethylformamid (D M F ), N -M ethylpyrrolidon (N M P), 1,4-Dioxan, A cetonitril, Essigsäure (H A c), A cetanhydrid (A c20 ), Ninhydrin, C hloroform und Piperidin (Pip) sowie alle w eiteren nicht aufgeführten C hem ikalien sind P ro d u k te d er Firm a M erck (D arm stad t, D eu tsch land). F m o c-a sp (O tb u )93-A rg ( P m e) -Val-Tyr (tb u)-ilea sn (T rt)-t yr(tb u )-T yr( tbu )-A sp (O tb u )-M e ta sn (T rt)-a la -A la -A sn (T rt)-v a l-g ly-t rp (B o c)a sn (T rt)-g ly -S er( tb u)- Thr( tbu ) -P h e-a la 115O -p -b en zylo x yb en zlyester-h a rz (1 a) E s w urden 0,5 g eines p-b enzyloxybenzylalkohol-polystyrolharzes m it einer B eladung von 0,64 m M ol Fm oc-a la-o H /g in diesem A nsatz v o r gelegt. D er A ufbau d er P ep tid k ette erfolgte in Synthesezyklen mit F m oc-a bspaltungen (20% Pip/D M F v/v, 2x3 min und 1x17 m in) und nachfol genden A cylierungsreaktionen (Fm oc-a S D erivat/b O P /D IE A (12,5% D IE A /D M F v/v) = 3:3:6 w/w/v, K onzentration d er Lösung an Fm oc-a S: ca. 0,1 M in D M F). Zw ischen den U m setzungen w ur den D M F-W aschschritte, sowie nach dem Fm oc- A bspaltungsprozeß ein zusätzlicher D ioxan/h 20Schritt (4:1, v/v) durchgeführt. Alle A cylierungsre aktionen w urden m ittels des qualitativen Ninhydrin-Tests nach K aiser überprüft. M ehrfachacylierungen w urden an den Positionen A sn98 (2 x), Ile97 (3 x) und Val9-' (2 x) durchgeführt. Es w urden 1,73 g (92% ) P eptidharz 1 a erhalten (th e o reti scher Substitutionsgrad: 0,171 mm ol Peptid/g H arz). 0,42 g 1 a w urden aufgearbeitet. Nach d er FmocA bspaltung erfolgte die E ndabspaltung des P ro dukts vom Träger u n ter gleichzeitiger E ntfernung d er restlichen Schutzgruppen mit 15 ml TFA /Phenol/H 20 /T A /E D T (82,5:5:5:5:2,5 v/w/v/v/v) bei R. T. innerhalb von 3 h. Im A nschluß w urde das H arz ü b er eine G lasfritte abfiltriert und die L ö sung direkt in 150 ml eisgekühlten, abs. E E ü b e r führt. D as ausgefällte R ohprodukt w urde abge saugt, m ehrm als mit abs. E E gewaschen und lyo philisiert. A usbeute: 146,2 mg (76% ) weißes Lyo philisat (1 b). - R P-H PLC : 5% - 95% B in 31 min, F lußrate: 1 ml/min; D etektion bei 214 nm, Rt: 17,5 min - C Z E ist aufgrund der L öslichkeit sproblem e nicht durchgeführt w orden.- IS-MS, mj z (% ): 1322,0 (100) [M +2H]2+ (w eitere M assen zuordnungen des R ohprodukts siehe in Tab. I). LD-M S: 2642,9 (100) [M +H ]+. - A SA: 3,05 A la (3.00); 0,94 Phe (1,00); 0,98 Thr (1,00); 1,09 Ser (1.00); 2,28 Gly (2,00); 6,08 Asx (6,00); 1,93 Val (2.00); 0,91 M et (1,00); 2,84 Tyr (3,00); 0,96 Ile (1.00); 0,94 A rg (1,00). D er G ehalt an Trp (1,00) w urde nicht erm ittelt. F m o c-a sp (O tb u )101-M et- A sn (T rt)- A la -A la A sn (T rt)- V al-g ly-trp (B oc) -A sn (T rt)-g lys er(tb u )-T h r(tb u )-P h e-a la 1I5-0 -P H B -S TentaG el -H arz (2 a) F ü r die D arstellung w urde 1 g des TentaGel -SPH B -Polym ers m it einer B eladung von 0,19 mm ol F m oc-a la-o H /g in einer continuous f lo w Syn these eingesetzt. D ie Fm oc-a bspaltungen erfolg ten m it 25% Pip/D M F (v/v). U n ter A ufzeichnung der U V -A bsorbtion w urde die Lösung in einer F ließrichtung durch das System geleitet. D ie Acy lierungsreaktionen w urden über T B T U A ktivie rung (Fm oc-a S D erivat/t B T U /D IE A = 3:3:5) in D M F durchgeführt. H ierzu wurde das System nach Z uführung d er A ktivierungslösung auf Rezirkulation um gestellt. Die Synthese w urde m it ei ner F lußrate von 3,5 ml/min bei R aum tem peratur nach folgendem Schem a durchgeführt:

11 291 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif Schritte: A rbeitsgang und R eagenzien Z eit W aschprozeß: Fm oc-a bspaltung: W aschprozeß: A cylierung: m in 4,5-4 5 min min 2 min 6-9 min. ca. 1 min min W aschprozeß: ständiger D M F-D urch- und A bfluß ständiger Pip/D M F-D urch- und A bfluß ständiger D M F-D urch- und A bfluß separates A nlösen d er K upplungschem ikalien in D M F (ca. 0,2 5-0,3 M an Fm oc-a S) A ktivierung (z.t. im U ltraschallbad) m anuelle Ü berführung ü b er den lo a d in g p o r t U m schalten von A bfluß auf R ezirkulation U m schalten von R ezirkulation auf A bfluß ständiger D M F-D urch- und A bfluß min D as Syntheseprotokoll ist in tabellarischer Form in folgender Ü bersicht (U V - m o n ito rin g u bei 304 nm ) dargestellt. Nr AS-Zyklus F m oc-a la-o H F m oc-p he-o H F m oc-t hr(tb u)-o H F m oc-ser(tb u)-o H F m oc-g ly-o H F m oc-a sn(t rt)-o H Fm oc-t rp(b oc)-o H F m oc-g ly-o H Fm oc-v al-o H F m oc-a sn(t rt)-o H F m oc-a la-o H Fm oc-a la-o H F m oc-a sn(t rt)-o H Fm oc-m et-o H F m oc-a sp(o tb u)-o H Fmoc-Abspaltungen Acylierungen H öhe des UV-Signals A nzahl der K upplungen Z eit (m in) K upplungs zeit (m in) C -term inale A m inosäure auf d er PO E -Polym erm atrix einfach 30 1,58 5,1 einfach 30 1,57 5,7 2 x 30 5,6 doppelt 1, ,57 5,0 einfach 2 x 30 1,56 5,2 doppelt doppelt 2 x 35 1,60 4,5 einfach 30 1,58 4,9 doppelt 2 x 30 1,36 6,9 doppelt 2 x 40 1,38 7,5 40 einfach 1,47 7,7 + 5 einfach 40 1,30 7, x doppelt 0, einfach 0,82 doppelt 2 x 35 0, E s w urden 1,37 g Peptidharz (2 a) (93% ) erh a l ten (theoretisch errechnete B eladung von 0,129 m M ol Peptid/g H arz). V on 0,5 g 2 a w urde zunächst die F m oc-g ruppe e n tfern t (40% Pip/D M F v/v, 2 x 25 min und 40% P iperidin in D C M /D M F (1:4 v/v), 10 min). D ie A bspaltu n g vom Träger erfolgte bei sim ultaner E n tfern u n g d er restlichen Schutzgruppen bei R. T. m it 22 ml einer Lösung von T FA /Phenol/H 20/TA/ E D T (82,5:5:5:5:2,5 v/w/v/v/v) innerhalb von 3 S tunden. E s w urden 96,6 mg P eptidm aterial 2 b (96% ) erhalten. - R P-H PLC : 15% - 50% B in 31 m in, F lußrate: 1 ml/min; D etek tio n bei 214 nm; Rt: 10,02 m in (23% H PL C -A usbeute). - C Z E : K apillare: 30 cm x 50 fxm (beschichtet), Puffer: 5 m M Tris, 5 mm Borax, 7 M H arnstoff, 50 mm SDS, p H 8,7, Injektion: 15 KV, 8 sec; Lauf: 20 KV, 15 C, (von + nach -), D etek tio n bei 214 nm, Mt: 2,84 min. - IS-MS, m /z (% ): 1555,0 (80) [M +H ]+, 778,0 (100) [M +2H ]2+. - A SA : 3,07 A la (3,00); 1,07 Phe (1,00); 0,98 T hr (1,00); 0,91 Ser (1,00); 2,14 Gly (2,00); 3,88 Asx (4,00); 1,01 Val (1,00); 0,94 M et (1,00). D er G eh alt an Trp (1,00) w urde nicht erm ittelt. F m oc- Trp (B o c) -A sn ( T rt)-g ly-s er( tb u )-T h r(tb u )P h e -A la 1 -O -2-ch lortritylester-h arz (3 a) 1 g des 2-C hlortritylchlorid-h arz w urde mit 62,3 mg (0,2 m M ol) F m oc-a la-o H um gesetzt [36], Von dem, m it einer B eladung von 0,17 m M ol F m oc-a la-o H /g, erh alten en H arz w urden 1,1 g eingesetzt. D ie Fm oc-a bspaltungen w urden mit 25% Pip/D M F (v/v, 2x5 m in und 1x15 m in) sowie

12 292 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 25% P iperidin in D M F/D C M (2:1 v/v) (1x3 min) durchgeführt. D ie A cylierungsreaktionen w urden in Form von E infachkupplungen m it dem T B T U R eagenz und D oppelacylierungen, wie im Fall der Trp(B oc) E inführung, mit dem B O P -R eagenz durchgeführt: Fm oc-a S D eriv at/t B T U bzw. B O P/ D IE A (12,5% D IE A /D M F v/v) = 3:3:4 w:w:v), ca. 0.2 M L ösungen an Fm oc-a S in DM F, 35 min. Zw ischen den U m setzungen erfolgten D M FW aschschritte, sowie ein D io x an /H 20-Schritt (4:1, v/v) im A nschluß an den F m oc-a bspaltungsprozeß. A lle Teilschritte w urden m ittels des K aiser Tests und m ittels D C -A nalytik kontrolliert. Die D C -Ü berprüfung erfolgte nach A b spaltung von P ep tidm aterial in geschützter Form m it D C M / T F E /H A c (7:2:1 v/v/v, 10 m in, R. T.) ü b e r die L aufm ittelsystem e A, B und C. E s w urden 1,32 g (100% ) des Peptidharzes 3 a erh alten (th e o re ti scher Substitutionsgrad: 0,142 m M ol Peptid/g H arz). 50 mg 3 a w urden in 4 ml ein er L ösung D C M / T F E /H A c (7:2:1 v/v/v) su spendiert und das P ro dukt in geschützter Form inn erh alb von 1,5 h bei R. T. abgespalten. Die L ösung w urde vom H arz abfiltriert, das H arz m it m eh reren P ortionen mit d er A bspaltlösung und D C M gew aschen und die vereinigten F raktionen im V akuum konzen triert. D as erhaltene, gelb gefärbte Ö l w urde m it eisge kühltem abs. E E versetzt und das ausfallende R o h p ro d u k t abzentrifugiert. N ach einem W asch prozeß mit E E w urde das P ro d u k t in tb u O H /H 20 (4:1) suspendiert und lyophilisiert. A usbeute: 8,8 mg (85% ) geschütztes P eptid (3 b). - D C: R f = 0,78 (A ); 0,54 (B); 0,57 (C). - FAB-M S: m /z (% ) 245,3 (90) [Trt-H +H ]+, 530,7 (60), 1424,7 (20) [MfBu+N a]+, 1480,8 (40) [M +N a]+. - IS-MS: 1460,5 (100) [M +H ]+. F ern er w urden von 5 mg des geschützt abgespal ten en P rodukts die w eiteren S chutzgruppen e n t fernt. D ie F m oc-a bspaltung erfolgte innerhalb von 45 min m it 25% Pip/DM F. N ach an schließen der E E -F ällung w urde das abzentrifugierte P ro dukt im V akuum getrocknet. M it 2 ml A bspaltreagenz T F A /P henol/h 20 /T A /E D T (82,5:5:5:5:2,5 v/ w/v/v/v) w urde das erh alten e P eptid in n erh alb von 3 h bei R. T. freigesetzt und m it einer A usbeute von 2,5 mg (ca. 93% ) (3 c) erh alten. - R P-H PL C : 5% - 95% B in 31 min, F lußrate: 1 m l/min; D e tektion bei 214 nm, Rt: 10,5 min. - C Z E : K apil lare: 24 cm x 25 /um (beschichtet), Puffer: 0,1 M P hosphatpuffer ph 2,5, Injektion: 10 KV, 8 sec; Lauf: 15 KV, 15 C, (von + nach -), D e te k tio n bei 214 nm, Mt: = 7,36 min. - IS-MS, m /z ( %) : 782,0 (100) [M +H ]+. - LD-M S. m /z (%): 782,7 (100) [M + H ]\- A SA : 1,00 A la (1,00); 0,97 Phe (1,00); 0,97 T hr (1,00); 0,95 Ser (1,00); 0,97 Gly (1,00); 0,98 Asx (1,00); der G ehalt an Trp (1,00) w urde nicht erm ittelt. F m o c-a sp ( O tb u )9:t-A rg ( Pm e)-val- Tyr( tb u )-llea sn (T rt)- Tyr( tb u ) - Tyr( tb u ) -A sp (O tb u )-M eta sn (T rt)-ä la -A la -A sn (T rt)-v a l-g ly-t rp (B o c)a sn (T rt)-g ly-s er(tb u )-T h r(tb u )-P h e-a la 115O -2-ch lortritylester-h arz (4 a) D ie Synthese w urde m it 1,25 g des dargestellten Peptidharzes 3 a fortgesetzt. D er K upplungsansatz w urde verdoppelt (Fm oc-a S/T B T U /D IE A = 6:6:8) und die A cylierungsreaktionen als D o p p el kupplungen durchgeführt. Zusätzlich erfolgten im A nschluß 15-minütige A cetylierungsreaktionen bei R. T. mit 1 ml D IE A (6 mm ol) und 0,52 ml A c20 (5,5 m M ol) in 5 ml DCM. Es w urden 1,48 g (79% ) P eptidharz 4 a mit einer erm ittelten P eptid substitution von 0,08 mm ol/g erhalten. Von 50 mg 4 a w urde das P rodukt in geschützter Form mit 5 ml einer Lösung D C M /T FE /H A c (7:2:1 v/v/v) innerhalb von 2 Stunden bei R. T. ab gespalten. N ach erfolgter A ufarbeitung (siehe 3 b) w urde das P rodukt (4 b) als weißes Lyophilisat mit einer A usbeute von 17,1 mg (93% ) erhalten. DC: R f = 0,75 (A ); 0,50 (B); 0,64 (C).- FAB-M S (% ) m /z: 4593,2 (45% ) [M +H]+, 4613,8 (100% ) [M +N a]+. Von w eiteren 0,12 g 4 a w urde die F m oc-g ruppe deblockiert (siehe Synthesebedingungen bei 3 a) und m it 4 ml T FA /Phenol/H 20/T A /E D T (82,5:5:5:5:2,5 v/w/v/v/v) innerhalb von 3 Stunden bei R. T. eine A bspaltung des P rodukts vom T rä ger und d er Schutzgruppen durchgeführt. D ie A ufarbeitung erfolgte, wie unter 1 b beschrieben. D as P rodukt (4 c) w urde mit einer A usbeute von 23,5 mg (95% ) erhalten. F m o c-a sp (OtBu)93-A rg(p m e) - Val- Tyr(tB u) -IleA sn (T rt)-t yr(tb u )- Tyr( tbu )-A sp ( OtBu)-M et A sn (T rt)-a la -A la -A sn (T rt)-v a l-g ly,08-o H (5 b) In einer B eladungsreaktion w urden 1 g B arlos H arz m it 0,24 g (0,8 m M ol) Fm oc-g ly-o H um ge setzt und ein Substitutionsgrad von 0,63 mm ol Fm oc-g ly-o H /g H arz erhalten. Für die Synthese w urden 0,5 g dieses F m o c-g ly -0-2-C lt -Trägers eingesetzt Die Fm oc-a bspaltungen w urden mit 25% Pip/D M F (v/v, 2 x 5 min und 1 x 15 min) so wie 17% Pip in DM F/DCM (2:1 v/v) (1x3 m in) durchgeführt. Die A cylierungsreaktionen w urden

13 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif in Form von E infachkupplungen m it dem T B T U und bei D oppelacylierungen mit dem B O P R e agenz, u n ter Z ugabe katalytischer M engen H O B t durchgeführt: Fm oc-a S D erivat/t B T U bzw. B O P/ D IE A (12,5% D IE A /D M F v/v) = 3:3:5 {ca. 0.2 M L ösungen an Fm oc-a S in DMF, 35 m in). Zw i schen den U m setzungen erfolgten D M F-W aschschritte, sowie d er D ioxan/h 20-Schritt im A n schluß an den Fm oc-a bspaltungsprozeß (siehe 1 a). A lle Teilschritte w urden m ittels des K aiser Tests und ü b er D C -A nalytik k o ntrolliert. Die Fm oc-a bspaltungsschritte w urden bei A s n 106, A s n 103 und T y r" w iederholt und D o p p elk u p p lu n gen an den Positionen A la 105, M e t102, A sn 98, A rg 94 u nd A sp 93 durchgeführt. Es w urden 1,37 g (92% ) P ep tid h arz (5 a-1) erh alten (theoretischer Substi tutionsgrad 0,214 m M ol Peptid/g H arz). D ie Syn th ese w urde u n ter en tsprechenden B edingungen w iederho lt und lieferte das P eptidharz (5 a-2) m it ein e r A usbeute von 1,34 g (91% ). Z u n äch st w urde in beiden Fällen geringe M en gen P eptidm aterials in geschützter Form abgespal te n und das P ro d u k t 5 b über FAB-M S bestätigt. A nschließend w urden jew eils 1,3 g 5 a-1 und 5 a2 zusam m en in 40 ml D C M /T F E /H A c (7:2:1) sus p en d ie rt und das P rodukt in geschützter Form in n e rh a lb von 2 Stunden bei R. T. abgespalten. Die P roduktiso lieru n g erfolgte, wie oben beschrieben. E s w urden 1,71 g (90% ) geschütztes P eptid (5 b) als w eißes Lyophilisat erhalten. A ufreinigungsversuche von P rod u k tm aterial w urde zunächst m ittels M P-L C u n ter isochratischen B edingungen d u rch g efü h rt (C H C l3/m eo H /H A c = 7:2:0,5 v/v/v, D e tek tio n bei 276 nm ). Es w urden 1 1 mg R o h p ro d u k t eingesetzt und das d etek tierte H a u p tp ro d u k t bei verschiedenen F lu ß raten isoliert (1,5 ml/m in, 9 bar, Rt: 45,56 min; 2,0 ml/min, bar, Rt: 37,80 min; 2,3 m l/m in bar, Rt: 32,50 min; 2,5 m l/m in, bar, Rt: 30,17 m in). N ach E E P räzipitatio n und anschließender Lyophilisation (G esam tau sb eu te: 9 mg 5 b, 82% ) erfolgte eine R ein h eitsk o n tro lle d er isolierten F rak tio n en m it tels R P-H PL C. E ine w eitere A ufarbeitung von insgesam t 1,65 g R o h p ro d u k t w urde ü b er S äulen chrom ato g rap h ie (40 g Kieselgel 60) m it dem L aufm ittel C H C l3/m eo H /H A c (7:2:0,5 v/v/v) durchgeführt. D ie A ufreinigung erfolgte in drei D urchläu fen, w obei jew eils ca. 500 mg P rodukt eingesetzt w urden. Die F raktionen m it den e n t sp rechen d en D C -R f-w erten w urden vereinigt, im V akuum au fk o n zen triert und das P ro d u k t m it E E gefällt. D as P ro d u k t w urde abfiltriert, die E E Phase im V akuum eingeengt und durch Z ugabe von H 20 eine N achfällung durchgeführt. D ie v erei nigten P ro d u k te w urden aus T F E /H 20 um gefällt. 293 N ach Lyophilisation m it tb u /H 20 (4:1 v/v) w urden insgesam t 1,29 g (78% ) P ro d u k t 5 b erhalten. Eine R einheitskontrolle erfolgte über R P-H PL C. DC: R f = 0,78 (A ); 0,67 (B).- R P-H PL C : 20% 100% B in 11 min, 100% B bis 31 min, Flußrate: 1 m l/min; D etek tio n bei 254 nm; Rt: 20,23 min (85% R P -H P L C ). - FA B-M S (% ) m /z: 3395,6 (100% ) [M +N a]+. - IS-M S (% ) m /z: 1133,0 (20) [M +2H +N a]3+, 1686,0 (100% ) [M +2H]2+, 1696,0 (40) [M +H +N a]2+, 1705,0 (20) [M +H+K ]2+. Von 30 mg des geschützten R ohprodukts wurde die F m oc-g ruppe en tfern t (30% Pip/D M F v/v, 30 m in) und nach E E -P räzipitation und Trocknung im V akkuum eine A bspaltung der w eiteren S chutzgruppen m it 5 ml T FA /T A /E D T /Phenol/ H 20 (78:9:6:4:3 v/v/v/w/v) 3 h bei R. T. durchge führt. D ie A ufarbeitung erfolgte, wie u n ter 1 b b e schrieben. D as R o h p ro d u k t (5 c) w urde m it einer A usbeute von 15 mg (90% ) erhalten. - RPH PLC : 5% - 60% B in 31 min, F lußrate: 1 ml/ min; D etek tio n bei 214 nm; Rt: 15,12 min (86% H P L C -A usbeute). - C Z E : Kapillare: 30 cm x 50 //m (beschichtet), Puffer: 5 mm Tris, 5 mm B o rax, 7 M H arnstoff, 50 m M SDS, ph 8,7, Injektion: 15 KV, 5 sec; Lauf: 15 KV, 15 C, (von + nach -), D etek tio n bei 214 nm, Mt: 6,95 min. - IS-MS m /z { %) : 939,5 (100) [M +2H ]2+, 951,0 (52) [M +H +N a]2+. - A SA: 5,15 Asx (5,00); 1,04 Gly (1.00); 2,09 A la (2,00); 1,94 Val (2,00); 0,81 M et (1.00); 0,97 Ile (1,00); 2,99 Tyr (3,00); 0,99 A rg ( ). F m oc- Trp (B o c) 109-A sn (Trt)- G ly-s er( tb u)t h r(tb u )-P h e-a la 1,:'-0-2 -ch lo rtritylester-h a rz (6a) 1 g 2-C hlortritylchlorid-t räger w urde mit 62,3 mg (0,2 m M ol) F m oc-a la-o H um gesetzt. Von dem, m it einer B eladung von 0,18 mm ol F m oc-a la-o H /g, e rh a lte n en H arz w urde 1 g ein gesetzt. D ie D arstellung erfolgte entsprechend den B edingungen d er u n te r 3 a beschriebenen Synthese au f dem 2-C lt -Träger. Es w urden 1,16 g P eptidharz (92% ) 6 a m it einem Substitutionsgrad von 0,15 m M ol Peptid/g H arz erhalten. Von 50 mg 6 a w urde geschütztes P ro dukt, wie u n ter 3 a b e schrieben, freigesetzt und 8 mg (73% ) Peptid (6 b) erhalten. D as P ro d u k t w urde durch FAB-M S und IS-M S bestätigt. Von 5 mg des geschützten P ro dukts w urde das P eptid, wie u n ter den A bspaltbedingungen bei 3 c beschrieben, deblockiert und 2,7 mg (100% ) P ep tidm aterial (6 c) erhalten. Die R einheit des P rodukts w urde über R P-H PL C überprüft.

14 294 Th. K aiser-w. Voelter - Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif F ragm entkondensationen zu r D arstellu ng von den F m oc-a sp (O tb u )93-A rg (P m e) - Val- T yr(tb u) -IleA sn (T rt)-t yr(tb u )-T y r(tb u )-A sp (O tb n )-M eta sn (T rt)-a la -A la -A sn (T rt)-v a l-g ly108trp (B o c )I09-A sn (T rt)-g ly-s er( tb u )-T h r( tb u )-P h ea la 115-O -2-ch lortritylester-h arzen 7 a, 8 a, 9 a und 10 a F ü r die K ondensationsreaktionen an d er festen Phase w urden jew eils 200 mg (0,03 m M ol) P e p tid harz 6 a vorgelegt. D ie F m oc-d eblockierungen e r folgten m it 25% Pip/D M F (2x5 min + 2x15 m in) und w urden bei den D arstellungen zu 8 a, 9 a und 10 a m ittels D C kontrolliert. - DC: R f = 0,56 (A ). D ie anschließenden A cylierungen w urden in allen R eak tio n en m it 304 mg P ep tid frag m en t 5 b (0,09 m M ol), 29 mg T B T U (0,09 m M ol) und 30,5 [A D IE A (0,18 m M ol) durch g efü h rt und bei den D arstellungen zu 8 a, 9 a und 10 a ebenfalls m ittels D C kontrolliert. In d er A cylierungsreaktion zu 7 a w urde die U m setzung in 1,5 ml D M F durchgeführt. N ach 14 h w urde m ittels des K aiser -Tests die R eak tio n üb erp rü ft und aufgrund einer ausbleib en d en F arb reak tio n beendet. Im A nschluß w urde eine 15 minütige A cetylierung in 5 ml D C M m it 1 ml D IE A (6 m M ol) und 0,52 ml A c20 (5,5 m M ol) durchge führt. Es w urden 0,24 g (79% ) P ep tid h arz 7 a e r halten. D ie R einheit des vollständig entschützten R o h p ro d u k ts 7 b w urde nach A ufarb eitu n g gerin [1] B. Bloom, B. Bennet, Science 153, 80 (1966). [2] J. R. David, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 56, 72 (1966). [3] J. Bernhagen, T. Calandra, R. A. Mitchell. S. B. Martin, K. J. Tracey, W. Voelter, K. R. Manogue, A. Cerami, R. Bucala, Nature 365, 756 (1993). [4] T. Calandra, J. Bernhagen, C. N. Metz, L. A. Spie gel, M. Bacher, T. Donnelly, A. Cerami, R. Bucala, Nature 377, 68 (1995). [5] T. Shimizu, A. Ohkawara, J. Nishihira, W. Saka moto, FEBS Lett. 381, 199 (1996). [6] G. J. Wistow, M. P Shaughnessy. D. C. Lee. J. Hodin, P. S. Zelenka, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 1272 (1993). [7] A. Lanahan, J. B. Williams. L. K. Sanders. D. Na thans. Mol. Cell. Biol. 12, 3919 (1992). ger M engen P eptidharz (vergleiche 1 b) üb er RPH P L C und IS-MS überprüft. D ie folgenden beiden F ragm entkupplungen w urden in 1,8 ml Lösungsm ittel. D M F/D M SO (1:1 v/v) bzw. D M SO durchgeführt. Die R eaktionen w urden ü ber D C verfolgt: R f = 0,56 (UV- und ninhydrinaktives E duktm aterial) + 0,74 (U V -aktives P ro d u k t) (A ). In beiden Fällen w urde nach 6 Ta gen die U m setzung abgebrochen und nach den A cetylierungsreaktionen (siehe 7 a) 0,22 g (73% ) Peptidharz 8 a bzw. 0,24 g (79% ) P eptidharz 9 a erhalten. - D C (8 b und 9 b): R f = 0,65 + 0,74 (A ) (beide U V -aktiv). D ie R einheit der entschützten R o h p ro d u k te 8 c und 9 c w urde nach A ufarbeitung geringer M engen P eptidharz (vergleiche 1 b) über R P -H P L C und IS-MS überprüft. E ine w eitere K ondensationsreaktion w urde u n te r en tsprechenden B edingungen in 1,8 ml des L ö sungsm ittels D M F/N M P (1:1 v/v) + 1% Triton X100 durchgeführt, wobei zusätzlich 6 mg H O B t (0,045 m M ol) zugegeben w urden. D ie DC-K ontrolle zeigte m it Rf: 0,74 (A ) nach 5 h eine voll ständige U m setzung an. Die R eaktion w urde b e en d et und es w urden 0,27 g (90% ) P eptidharz 10 a m it einer erm ittelten B eladung von 0,088 mm ol Peptid/g H arz erhalten. Von 0,1 g 10 a w urden nach A bspaltung von Träger und Schutzgruppen (B edingungen, siehe oben) 23 mg (100% ) entschütztes R o h p ro d u k t 10 b erh alten und dieses ü b er R P -H P L C und IS-MS überprüft. [8] W. Y. Weiser, P. A. Temple, J. S. Witek-Giannotti, H. G. Remold, S. C. Clark, J. R. David, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 7522 (1989). [9] J. Bernhagen, Dissertation, Abteilung für Physikali sche Biochemie, Fakultät für Chemie und Pharma zie der Universität Tübingen, Deutschland (1994). [10] M. Sakai, J. Nishihira. Y. Hibiya, Y. Koyama, S. Nishi, Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 439 (1994). [11] J. Bernhagen. R. A. Mitchell, T. Calandra, W. Voel ter, A. Cerami. R. Bucala. Biochemistry 33, (1994). [12] J. Nishihira, T. Kuriyama, M. Sakai, S. Nishi. S.-Y. Ohki. K. Hikichi. Biochim. Biophvs. Acta 1247, 159 (1995).

15 Th. K aiser-w. Voelter Zur Festphasenpeptidsynthese von mmif 295 [13] H.-W. Sun, J. Bernhagen, R. Bucala, E. Lolis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 5191 (1996). [14] M. Suzuki, H. Sugimoto, A. Nakagawa, I. Tanaka, J. Nishihira, M. Sakai, Nat. Struc. Biol. 3, 259 (1996). [15] B. Gutte, R. B. Merrifield, J. Biol. Chem. 246, 1922 (1971). [16] R. F. Nutt, S. F. Brady, P. L. Drake, T. M. Ciccarone, C. D. Colton, E. M. Nutt, J. A. Rodkey, C. D. Bennett, L. H. Waxman, I. S. Sigal, P. S. Anderson, D. F. Veber, Proc. Natl. Acad. Sei. U SA 85, 7129 (1988). [17] G. B. Fields, R. L. Noble, Int. J. Pep. Protein Res. 35, 161 (1990). [18] B. Riniker, A. Flörnsheimer, H. Fretz, P. Sieber, B. Kamber, Tetrahedron 49, 9307 (1993). [19] E. Bayer, Angew. Chem. 103, 117 (1991). [20] P. Lloyd-Williams, F. Alberiicio, E. Giralt, Tetrahedron 49, (1993). [21] H. Benz, Synthesis 337 (1993). [22] S. S. Wang, J. Am. Chem. Soc. 95, 1328 (1973). [23] E. Echner, W. Voelter, Liebigs Ann. Chem (1988). [24] R. Ramage, J. Green, O. Y. Ogunjobi, in R. Epton (ed.): Solid Phase Synthesis 1990, Peptides, Polypeptides and Oligonucleotides, Macroorganic Reagents and Catalysts, SPCC Ltd, p. 27, Birmingham, UK (1990). [25] E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, Anal. Biochem. 34, 595 (1970). [26] B. Castro, J. R. Dormoy, G. Evin und C. Selve, Tetrahedron Lett (1975). [27] A. Dryland, R. C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 (1986). [28] E. Atherton, R. C. Sheppard in: Solid phase peptide synthesis, a practical approach, IRL Press, Eynsham, Oxford, UK (1989). [29] Produktinformation der Firma Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland (1995). [30] E. Bayer, W. Rapp, Chem. Pept. Prot. 3, 3 (1989). [31] M. Beyermann, H. Wenschuh, P. Henklein, M. Bienert, in R. Epton (ed.): Innovation & Perspectives in Solid Phase Peptide Synthesis, Peptides, Polypeptides and Olinucleotides, p. 349, Canterbury, UK (1992). [32] C. Schröder, H. Echner, K. Schmer, W. Voelter, in R. Epton (ed.): Innovation & Perspectives in Solid Phase Peptide Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, Biological and Biomedical Applications, p. 677, Birmingham, UK (1992). [33] C. Schröder, A. Günther, W. Seeger, W. Voelter, Biomed. Peptides, Proteins & Nucleic Acids 1, 13 (1995). [34] R. Drozdz, A. N. Eberle, J. Pept. Sei. 1, 58 (1995). [35] R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bannwarth, D. Gillessen, Tetrahedron Lett. 30, 1927 (1989). [36] K. Barlos, O. Chazi, D. Gatos, G. Stavropoulos, Int. J. Peptide Protein Res. 37, 513 (1991). [37] K. Barlos, D. Gatos, S. Kutsogianni, G. Papaphotiou, C. Poulus, T. Tsegenidis, Int. J. Peptide Protein R es 38, 562 (1991). [38] K. Barlos, D. Gatos, G. Papaphotiou, W. Schäfer, Liebigs Ann. Chem. 215 (1993). [39] B. D. Larsen, A. Holm, Int. J. Pep. Protein Res. 43, 1 (1994). [40] W. Voelter, G. Grübler, H. Straubinger, H. Zimmerman, S. Stoeva, H. Echner, T. Kaiser, G. Paulus, LABO 1, 40 (1994). [41] T. Kaiser, S. Stoeva, G. Grübler, H. Echner, A. Haritos, W. Voelter, in R. S. Hodges, J. A. Smith (eds.): Peptides, Chemistry, Stucture and Biology, Proceedings of the 13. American Peptide Symposium, p. 244, Escom, Leiden, Niederlande (1994). [42] J. D. Fontenot, J. M. Ball, M. A. Miller, C. M. David und R. C. Montelaro, Peptide Research 4,19 (1991). [43] T. Kaiser, J. Bernhagen, R. Bucala, G. Paulus, W. Voelter, R. Bucala, in H. L. S. Maia (ed.): Peptides 1994, Proceedings of the 23rd European Peptide Symposium, p. 853, Escom, Leiden, Niederlande (1995). [44] S. B. H. Kent, Ann. Rev. Biochem. 57, 957 (1988). [45] J. P. Tam, Yi-An Lu, J. Am. Chem. Soc. 117, (1995). [46] M. Quibell, L. C. Packman, T. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 117, (1995). [47] L. Zang, C. Goldammer, B. Henkel, F. Zühl, G. Panhaus, G. Jung, E. Bayer, in R. Epton (ed.): Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, Biological and Biomedical Applications 1994, p. 137, Mayflower Worldwide Limited, Birmingham, UK (1994). [48] J. Meienhofer, M. Waki, E. P. Heimer, T. J. Lambross, R. C. Makofske, C. D. Chang, Int. J. Pep. Protein Res. 13, 35 (1979). [49] Biolynx, Peptide Synthesizer Practical Notes, LKB Pharmacia, Uppsala, Schweden, 13 (1989).

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