Die Kovalente Struktur von Proteinen und Nukleinsäure

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1 Die Kovalente Struktur von Proteinen und Nukleinsäure 1. Bestimmung der Primärstruktur A) Endgruppenanalyse: Zahl der Untereinheiten? B) Spaltung der Disulfidbrücken C) Trennung, Reinigung und Charakterisierung der Polypeptide D) Aminosäurezusammensetzung E) Spezifische Peptidspaltungsreaktionen F) Trennung und Reinigung von Peptidfragmenten G) Sequenzbestimmung H) Ordnen der Peptidfragmente I) Zuordnung von Disulfidbrücken J) Peptidsequenzierung durch Massenspektroskopie K) Peptid Mapping 2. Nukleinsäuresequenzierung 3. Chemische Evolution A) Sichelzellanämie B) Spezies Variation C) Evolution durch Genduplikation 4. Bioinformatik A) Sequenzdatenbanken B) Sequenz Alignment C) Phyleogenetische Stammbäume 5. Polypeptidsynthese A) Syntheseschema B) Probleme und Aussichten 6. Oligonukleotidsynthese A) Synthese Schema B) DNA Chips C) SELEX

2 Proteine bauen das Leben auf o Auge, Wahrnehmung von Licht: Rhodopsin o Knochen, Körperform: Collagen o Immunsystem, Verteidigung gegen Fremd: Immunoglobuline o Zum Verstehen der Funktion von Proteinen müssen wir deren Aufbau/Struktur kennen lernen: primär, sekundär, tertiär und quartär Struktur

3 Hierarchie der Proteinstrukturen

4 Primärstruktur von Insulin Frederick Sanger 1953 erste Sequenz von Insulin Intra- und Inter-Ketten Disulfidbrücken

5 Schritte zur Primärstruktur/Sequenz 1. Vorbereitungen zur Sequenzierung Bestimmung der Anzahl unterschiedlicher Untereinheiten Spaltung der Disulfidbrücken Reinigung der Untereinheiten Bestimmung der AS Zusammensetzung der Ue. 2. Sequenzierung der Ue. Fragmentierung der Ue. in Peptide, welche durchsequenziert werden können Trennung und Reinigung der Fragmente Bestimmung der Sequenz der Fragmente Wiederholung mit unterschiedlicher Fragmentierung, um die Fragmente aufgrund ihrer Überlappungen ordnen zu können 3. Aufbau der kompletten Struktur Anordnung überlappender Fragmente Bestimmung der Inter- und Intra-Ketten Disulfidbrücken

6 Endgruppenanalyse Wie viele unterschiedliche Ue. befinden sich in meinem Protein: N-Terminus: Dansyl chlorid reagiert mit primären Aminen (auch ε Gruppen von Lys), Hydrolyse, Analyse der Dansyl-Derivatisierten AS Edman Abbau, PITC (Phenylisothiocyanate, Edman s Reagenz) reagiert mit N-ter. Amin zu PTC (Phenylithiocarbamyl), Säurespaltung, Analyse der PTH (Phenylthiohydantoin)-AS mittels TLC, Elektrophorese, HPLC, GLC.. Kann wiederholt werden zur Sequenzbestimmung, N -> C C-Terminus: weniger zuverlässig als N-terminale Methoden Exopeptidase, Bsp. Carboxypeptidase, zeigen AS-Spezifität Hydrazinolyse, zeigt aber viele Seitenreaktionen

7 Analyse der N- terminalen AS mittels Dansyl Chlorid

8 Edman Abbau

9 Bestimmung der C-terminalen AS mittels Exopeptidasen

10 Hydrazinolyse zur Bestimmung der C- term. AS

11 Spaltung von Disulfidbrücken 1. Zur Trennung der Polypeptidketten 2. Zur nachfolgenden Spaltung Entweder oxidative Spaltung: Per-Ameisensäure -> Cys zu Cystein Säure, Nachteil: oxidiert auch Met zu Methionine Sulfon und interferiert daher mit der nachfolgenden Cyanbromid Spaltung Oder reduktive Spaltung mit 2-Mercaptoethanol (BME), oder Ditiothreitol (DTT), Ditioerythritol (Cleland s Reagenz) Spaltung unter denaturierenden Bedigungen, um alle Disulfidbrücken zu exponieren. Die freien Sulfhydryl Gruppen werden danach mit Iodessigsäure zu S-Carboxymethylcystein alkyliert, um die weitere Neubildung von Disulfidbrücken zu vermeiden.

12 Oxidative Spaltung mit Per-Ameisensäure

13 Reduktive Spaltung mit BME, DTT, oder Cleland s Reagenz

14 Alkylierung der Cysteine mit Iodessigsäure

15 Trennung, Reinigung und Charakterisierung der Polypeptidketten o o Denaturierung und Dissoziation der Untereinheiten unter sauren oder basischen Bedingungen, mittels Harnstoff oder Guanidium, oder Detergentien (SDS). Danach Reinigung mittels Gel-Filtration, Ionentauscher etc. Massenbestimmung (110 D/AS) zb. durch: Massenspektroskopie: MALDI, matrix assisted laser desorption ESI, electrospray-ionization MS/MS, tandem massenspektroskopy

16 Aminosäureanalyse Hydrolyse des Polypeptides in seine AS Einheiten und quantitative Bestimmung der AS Zusammensetzung Saure Hydrolyse: 6N HCl, C, h -> Trp geht kaputt, Glx, Asx Basische Hydrolyse: 2-4N NaOH, 100 C, 4-8 h -> zerstört Cys, Ser, Thr und Arg, aber kann zur Bestimmung von Trp verwendet werden Enzymatisch: Endopeptidasen, Bsp. Pronase (Mischung aus versch. Endopeptidasen), Selbstverdau...

17 Aminosäureanalyse Automatisierte amino acid analyzer mit vor- oder nach-säulen (Ionentauscher oder RP-HPLC) Derivatisierung der AS mit o- Phthalaldehyde (OPA) plus BME (<1h, pmol Sensitivität). Die AS Zusammensetzung sagt ev. gar etwas über die Struktur des Proteins aus Fluorescent adduct

18 Spezifische Spaltungsreaktionen Ziel: Spaltung des Proteins in Peptidfragmente von AS, welche dann sequenziert werden können. Enzymatisch: Trypsin spaltet nach (C-Seite) positiv geladenen AS. Lys kann mittels Citraconic Anhydrid unspaltbar gemacht werden Cys kann durch 2-Bromomethylamine spaltbar gemacht werden Limitierte Proteolyse Chemisch: Cyanogenbromid spaltet nach (C-Seite) von Met und produziert ein Peptidyl Homoserin

19 Spezifität von Endopeptidasen

20 Trypsin Spaltung Schutz von Lys Macht Met Spaltbar

21 Spaltung mit Cyanogenbromid

22 Weitere Schritte o Reinigung der Peptidfragmente: RP-HPLC o Sequenzbestimmung mittels zyklischem Edman Abbau, automatisiert, Sequenator ca. 1h pro AS. Heute auch über Massenspektroskopie möglich o Bestimmung der Gesamtsequenz durch Bestimmung der Reihenfolge der unterschiedlichen Peptide (sequence assembly) o Bestimmung der Disulfidbrücken mittels Diagonalelektrophorese

23 Reihenfolge der Peptidfragemente Überlappende Sequenzinformation der einzelnen Peptidfragmente muss zur Bestimmung der Gesamtsequenz herangezogen werden

24 Bestimmung der Position von Disulfidbrücken

25 Peptide Characterization and Sequencing by Mass Spectrometry o Determines the mass to charge ratio of an ion (m/z) in the gase phase o Soft ionization methods since 1985 FAB ESI MALDI Positive charge through ionisation of Lys, Arg

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28 The ESI-MS spectrum of the 16,951-D horse heart protein apomyoglobin.

29 Peptide sequencing by tandem MS

30 The tandem mass spectrum of the doubly charged ion of the 14-residue human [Glu 1 ]fibrinopeptide B (m/z = 786).

31 Protein Modifikationen o Zur Identifikation von AS, welche für die Funktion des Proteins wichtig sind, werden gruppenspezifische Reagentien eingesetzt. Damit können zb. AS der active site markiert und dann mittels Peptid mapping identifiziert werden. Bsp. das active site ser in Serin Proteasen ist ungewöhnlich reaktiv und reagiert mit diisopropylphosphofluoridat (DIPPF) andere Ser aber nicht.

32 active-site Modifikationen Bsp. Ser in serine proteasen

33 Gruppenspezifische Reagentien

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37 DNA Sequenzierung Primärstruktur von Proteinen ist durch die Basenfolge der entsprechenden Gene bestimmt. Da DNA Sequenzierung technisch einfacher ist, wird heute die Proteinsequenz meist auf Ebene der DNA bestimmt. Dabei bleibt allerdings offen: Position der Disulfidbrücken Post-translationelle Modifikationen Sequenzfehler auf DNA Ebene RNA Editing, Differenzen im Code

38 Strategy 1) break down into manageable sized fragments 2) Sequencing of individual fragments 3) Ordering of fragments

39 Chain termination by incorporation of dideoxynucleotides Chain termination

40 Autoradiograph of a sequencing gel

41 Automated sequencing Using fluorescent dideoxy nucleotides 4 reactions/one gel or 1 reaction/one gel

42 Genome sequencing strategies

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45 The human genome o 3200 Mb o 2001 o 50% repetitive sequences o 28% transcribed into RNA o Only 1% protein coding o Ca proteins

46 Chemische Evolution o Evolution von Proteinen, Struktur <-> Funktion o Bsp. Sichelzellanämie: Erkrankung der roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Diese enthalten (33%) Hämoglobin, Tetramer α 2 β 2, welches Sauerstoff bindet und an die Peripherie transportiert. Wild: HbA, Krank: HbS; Glu β6 -> Val β6 (Verlust 2 - ) HbS aggregiert bei tiefem Sauerstoffdruck und verändert damit die Form der Erythrozyten von discoidal (bikonkav) zu sichellförmig -> Aggregation der veränderten Blutkörperchen in der Peripherie -> Hämolytische Anämie, reduzierte Lebensdauer der Bltk. von 120 auf 60 Tage Mendelische Vererbung, nur Homozygote zeigen Symptome, meist tödlich. Heterozygot: ~40% HbS -> bessere Resistenz gegen Malaria (Infektion mit dem Protozoen Plasmodium falciparum), da die Infektion den ph der Erythrozyten erniedrigt -> sichelförmig -> Entfernung in der Leber

47 Sichelzellanämie ist eine molekulare Krankheit welche aber für den heterozygoten Träger einen gewissen Selektionsvorteil bringt. Die Mutation wurde daher in Malaria gefährdeten Zonen konserviert

48 Peptide Mapping Fingerprinting: Papier Chromatography + Papier Elektrophorese

49 Spezies-spezifische Variationen in homologen Proteinen Sequenzvergleiche von homologen Proteinen, Bsp. Cytochrom C von Mensch, Schwein, Huhn,... Protein mit einer Polypeptidkette ~103 AS. Teil der Elektronen- Transportkette der Mitochondrien, transferiert Elektronen von Cytochrom C zu Cytochrom C Oxidase. Funktionell stark konserviert, Hefe-Protein kann das im Schwein ersetzen. Alle Proteine haben dieselbe Funktion, aber unterschiedliche AS Sequenz: Neutraler Drift Identifikation von konservierten/invarianten AS -> funktionell wichtig Konservative Substitutionen, Asp -> Glu, d.h. Ladung ist hier wichtig Hypervariable Regionen, zb. dienen nur als Linker zwischen 2 funktionellen Teilen (Domänen) des Proteins

50 Sequenzvergleich von Cytochrom C aus 38 Spezies

51 Types of AS exchanges o Invariant -> active site, funct. important o Neutral drift o Conservative o Hypervariable -> linker

52 Differenzmatrix, Anzahl der Ausgetauschten AS zwischen den Spezies

53 Taxonomische Information durch Proteinsequenzvergleiche Phylogenetischer Stammbaum von Cytochrom C Anzahl Unterschiede per 100 AS = PAM units, Prozent der akzeptierten Punktmutationen Gleiche Distanz am Ursprung, d.h. auch die Vorläufer haben sich weiter evolviert. Quantifizierung der evolutionären Distanz

54 Unterschiedliche Proteine verändern sich mit unterschiedlicher Geschwindigkeit unit evolutionary period : Zeit, um die Sequenz zweier homologer Proteine um 1% zu ändern, nachdem sich zwei Spezies getrennt haben. Widerspiegelt den evolutionären Druck auf die Sequenz.

55 Die Evolutionsrate ist konstant Und nicht von der Generationszeit des Organismus abhängig, d.h. ein Protein in Insekten evoluiert genau so schnell wie dasjenige in Elefanten.

56 Protein Evolution ist nicht die Basis für Speziesunterschiede Der Mensch ist auf Sequenzeben ca. 99% identisch mit dem Affen. Trotzdem,...

57 Evolution durch Genduplikation o o o Duplikation eines essentiellen Gens nimmt den Selektions-Druck von der Kopie weg, sie kann sich dann sehr schnell verändern ohne dabei den Wirten zu gefährden. Bsp. Hämoglobin, Myoglobin Vermutlich wurden deshalb währen der Speziesbildung auch ganze Genome dupliziert Proteine bestehen aus Funktionseinheiten (Domänen), welche immer wieder verwendet und angepasst werden

58 Bioinformatics o Data mining o Sequences are published in databases not in printed form

59 Sequence alignments PAM units, as measure of evolutionary distance, (.99) 50 = 61% identical GAPS - Penalty

60 Alignments using dot matrices

61 The optical alignments of human myoglobin (Mb, 153 residues) and the human hemoglobin a chain (Hba, 141 residues)

62 PAM substitution matrices Based on observed rates of protein evolution The PAM-250 Log Odds Substitution Matrix

63 Needleman-Wunsch alignment

64 Gap penalties introducing a gap is more expensive than extending it

65 Pairwise alignments using BLAST and FASTA Heuristic algorithm use educated guesses BLOSUM matrices BLAST, basic local alignmentsearch tool Sensitivity <-> selectivity

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67 Multiple sequence alignments E.g. by CLUSTAL Used to generate profiles for more sensitive searches for distantly related proteins Scoring matrices based on hidden Markov models (HMMs) PSI-BLAST

68 Phylogenetic tree Unrooted / rooted tree

69 Polypeptidsynthese o Chemische Synthese von Peptiden aus AS: zu Struktur - Funktionsbeziehungen Einbau von nicht-standard AS Pharmakologie o Erst: homopolypeptide, Bsp. Polyglycin, Polyserin o 1953: Oxytocin (Nonapeptid), biologisch aktives Neuropeptid, Kontraktion des Uterus

70 Chemische Synthese von (Poly-) Peptiden o Prinzip: Addition einer Boc-geschützten AS an den N-Terminus der wachsenden Kette, C->N Wachstum

71 Merrifield: Festkörperphasensynthese o o o Kopplung der wachsenden Kette (C->N) an eine feste Matrix (Polystren) Automatisierte Peptide Synthesizer Problem, Ausbeute: 98% Ausbeute pro Schritt, 100AS -> 200 Schritte -> = 2% Endausbeute!

72 Kopplungschemie der ersten AS an die Matrix 1. Kopplung 2. Entschützen

73 DCCD dient der Aktivierung und Kondensation der AS

74 Beispiele von geschützten Seitenketten

75 Freisetzung

76 Native chemical ligation Length limit ~60 Aa Native chemical ligation to produce longer peptides

77 Chemical synthesis of oligonucleotides o for probes in Southern o In situ hybridization o PCR primers o Side-directed mutagenesis

78 Synthetic procedure o Since 1980 solid-phase method analogous to peptide synthesis, phosphoramidite method o Nonaqueous o 3 -> 5 o Automated, up to 140mer, 40 min/cycle

79 DNA chips o One-gene-at-a-time -> whole genome analysis o Oligonucleotide arrays o Photolithography / in situ synthesis o SNIPs -> individualized medicine

80 A DNA chip

81 The photolithographic synthesis of a DNA chip

82 Variations in gene expression, mrna levels, expression profiling

83 SELEX o Systematic evolution of ligands by exponential enrichment o High affinity oligonucleotide probes, aptamers

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