Spezielle Bakteriologie

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1 Spezielle Bakteriologie Wahlpflichtpraktikum Mikrobiologie 4 (BIO-BA 63200) 1. Kurstag Dr. Sandro Wolf, Dr. Marina Totrova, Dr. Kerstin Röske

2 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Da es unter den Mikroorganismen pathogene Vertreter gibt, sind alle unbekannten Keime als potentiell pathogen zu betrachten, und es ist mit entsprechender Vorsicht mit ihnen zu arbeiten. Die im Kurs verwendeten Mikroorganismen gehören der Risikogruppe I oder II nach der Biostoffverordnung vom an. Entsprechende Hinweise werden im Kurs gegeben. Nähere Informationen unter: Das Tragen eines kochbaren Arbeitskittels ist Pflicht. Dieser verbleibt wären der gesamten Kurszeit im Praktikumsraum. Nach Beendigung des Praktikums kann der Kittel autoklaviert werden lassen. Im Praktikumsraum sind Essen, Trinken und Rauchen sowie die Lagerung diesbezüglicher Dinge verboten. Vor Verlassen des Raumes sind die Hände gründlich zu waschen und zu desinfizieren. Mikroorganismen dürfen nicht auf Kleidung, Arbeitsplätze, Geräte usw. gelangen. Verschüttetes Material ist mit Zellstoff abzudecken, der mit Desinfektionsmittel getränkt wurde. Kontaminierte Flächen sind mit Desinfektionsmittel zu reinigen.

3 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Am Ende eines jeden Kurstages muß der eigene Arbeitsbereich mit Flächendesinfektionsmittel gereinigt werden. Mikroorganismen sind in verschlossenen Gefäßen zu halten. Impfösen sind nach jeder Benutzung auszuglühen. Vor der Entsorgung müssen Mikroorganismen durch Autoklavieren inaktiviert werden (Entsorgungsbeutel). Beim Pipettieren mit Glaspipetten sind die zugehörigen Pipettierhilfen zu verwenden. Gebrauchte Pipetten sind in dafür vorbereitete Gefäße (Peressigsäure!) abzulegen. Beim Mikroskopieren mit dem 100er-Objektiv ist Immersionsöl zu verwenden (Achtung, dieses Öl muß als gesundheitsschädigend angesehen werden!). Vor dem Wechsel vom 100er zum 40er Objektiv ist das Öl mit einem Zellstofftuch vom Objektträger zu entfernen. Zum Reinigen des Objektivs ist ein weiches, fusselfreies Kleenex-Tuch zu verwenden, Objektive sind nicht mit Alkohol abzuwischen! Verletzungen und andere (auch Bagatell-) Zwischenfälle sind sofort dem Praktikumsleiter zu melden.

4 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Im Brandfall: Feuerlöscher, Brandmelder im Gang Türen schließen; nicht verschließen Fluchtwegeplan folgen; Sammelplatz für Neubau Biologie: Parkplatz Hinweise: Brenner nur bei Bedarf anstellen; Automatikpipetten; angegebenen Pipettierbereich beachten; nicht überdrehen Beimpfte Gefäße sind mit Datum, Inhalt und Zugehörigkeit (Platz-, Gruppennummer) zu beschriften. Platten platz-/gruppenweise in Tüten verpacken, Tüten beschriften

5 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Biologische Arbeitsstoffe werden entsprechend dem von ihnen ausgehenden Infektionsrisiko in vier Risikogruppen eingeteilt: Risikogruppe 1: Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen. Bacillus subtilis, Clostridium pasteurianum, Escherichia coli K12, Micrococcus luteus, Mycobacterium phlei Risikogruppe 2: Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für Beschäftigte darstellen können; eine Verbreitung des Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich; eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise möglich. Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa

6 Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Biologische Arbeitsstoffe werden entsprechend dem von ihnen ausgehenden Infektionsrisiko in vier Risikogruppen eingeteilt: Risikogruppe 3: Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen können; die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung kann bestehen, doch ist normalerweise eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung möglich. Bacillus anthracis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Shigella dysenteria Risikogruppe 4: Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen; die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung ist unter Umständen groß; normalerweise ist eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung nicht möglich. Pockenvirus, Ebola-Virus

7 Möglichkeiten der Quantifizierung I Bestimmung der Zellmasse Direkte Methode: Bestimmung der Trockenmasse, Frischmasse Bestimmung des Gesamtstickstoffgehaltes (nach Kjeldahl) Bestimmung des Proteingehaltes Bestimmung eines anderen typischen essentiellen Zellbestandteils (DNA, Bacterienchlorophyll, Phospholipide) Indirekte Methode: Ermittlung der Trübung einer Zellsuspension (Extinktionsmessung=Turbidimetrie; Streulichtmessung=Nephelometrie) Ermittlung von mit dem Wachstum korrelierten Stoffwechselgrößen (O 2 -Aufnahme, CO 2 -Freisetzung, ATP-Gehalt, typische Stoffwechselprodukte)

8 Möglichkeiten der Quantifizierung II Bestimmung der Zellzahl Gesamtzellzahl: Mikroskopische Auszählung in Zählkammer (z.b. Thoma-Kammer) Relativzählung (nach Zugabe einer Referenzsuspension von Partikeln mit bekannter Konzentration) Elektronische Zählgeräte (z.b. Durchflusscytometrie) Membranfiltrationsmethode (mit nachfolgender Anfärbung und mikroskop. Auszählung) Lebendzellzahl: Ausplattieren auf Nähragar Kochsches Plattengussverfahren Membranfiltration (mit nachfolgender Inkubation der Filter auf Nährkartonscheiben oder Agarnährböden)

9 Quelle: Bern and Goldberg BMC Evolutionary Biology :34

10 Identifizierung von Bakterien Medizin: Identifizierung von Krankheitserregern optimale Therapie Lebensmittelanalytik: Identifizierung von Lebensmittelverderbern / Krankheitserregern Wasseranalytik: Nachweis fäkaler Verunreinigung von Trink- und Badewasser

11 Identifizierung von Bakterien Welche Merkmale können genutzt werden? 1. Kulturtypische: z.b. Form und Farbe der Kolonien 2. Morphologische: z.b. Zellformen, Beweglichkeit 3. Physiologische: z.b. Vorzugstemperatur, Verhalten gegenüber O 2 4. Biochemische: Nährstoffansprüche, Stoffwechselleistungen 5. Serologische Indentifizierung von Serotypen 6. Genetische z.b. PCR, Sequenzanalyse, Hybridisierung von DNA/RNA spezifischen Sonden 7. Neue/Alternative (Intact Cell) MALDI-TOF MS

12 MALDI-TOF MS Quelle: Burak und Gehrt 2010

13 MALDI-TOF MS

14 Kulturtypische Merkmale Form, Farbe, Geruch, Konsistenz, Koloniegröße auffallend sind Pigmentierungen (z.b Pseudomonas aeruginosa) teilweise typische Kolonieformen (z.b. Gattung Bacillus) schwärmendes Wachstum auf der Agarplatte (z. B. Proteus vulgaris) schleimiges Aussehen der Kolonien (z.b. Gattung Klebsiella) Zellfäden von Bacillus Fluoreszierende Klebsiella pneumoniae cereus subsp. Pseudomonaden auf Blutagar mycoides bei Beleuchtung mit Licht der Wellenlänge 366 nm

15 Kulturtypische Merkmale, Forts. 1. Farbe: insbesondere auf den Luftplatten treten häufig pigmentierte Kolonien auf Die Farbstoffe (gelb bis rot) sind Karotinoide (z.b. Astaxanthin), die v.a. eine Schutzfunktion gegenüber sichtbarem und UV-Licht haben 2. Geruch: z.b. nach Erde (Streptomyceten) oder nach Milchsäure (Lactobacillus) 3. Form (Umriss) 4. Profil (Erhebung über dem Nährboden) aus Schröder: Mikrobiologisches Praktikum

16 Morphologische Merkmale Gram-Färbung Hans Christian Joachim Gram dänischer Bakteriologe (* 13. September 1853 in Kopenhagen, 15. November 1938) C. Gram: Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnittund Trockenpräparaten. In: Fortschritte der Medicin. Vol. 2, 1884, S

17 Morphologische Merkmale Gram-Färbung, Forts. gram-positive Bakterien: bis zu 25 Mureinschichten dunkelvioletter Kristallviolett-Iod-Komplex wird bei Alkoholbehandlung nur langsam abgegeben Bakterien bleiben violett gram-negative Bakterien: Peptidoglykan 1-2 schichtig Farbkomplex kann schnell wieder ausgewaschen werden nach Gegenfärbung mit Safranin (Fuchsin) sind Bakterien rosa rot gefärbt verwandte Bakterien zeigen i.d.r gleiche Gramfärbung Differenzierung und Diagnostik Grameigenschaft korreliert mit anderen physiologischen und chemischen Eigenschaften der Zellen: z.b. Empfindlichkeit gegen best. Enzyme, Antibiotika, Veränderungen gegenüber osmotischer Verhältnisse sowie gegenüber sauren und basischen Farbstoffen

18 Morphologische Merkmale Zellform, Grameigenschaft, Beweglichkeit

19 Physiologische Merkmale Temperatur

20 Physiologische Merkmale Salztoleranz

21 Physiologische Merkmale Verhalten gegenüber Sauerstoff Obligat aerobe Bakterien Mikroaerophile Bakterien O 2 ist essentiell für das Wachstum Pseudomonaden, Mycobakterien Wachstum nur bei reduziertem O 2 Partialdruck Campylobacter Obligat anaerobe Bakterien Fakultativ anaerobe Bakterien O 2 ist toxisch, Wachstum nur in O 2 -freiem Milieu Clostridien, Bacteroides, Peptokokken Wachstum sowohl in Gegenwart von O 2 als auch im O 2 - freien Milieu Enterobacteriaceae, Streptokokken, Staphylokokken

22 Biochemische Merkmale Oxidase Test Nachweis der Cytochrom-c Oxidoreduktase Katalase Test Lactoseverwertung Oxidative/Fermentative Glucoseverwertung IMVoC (Bunte Reihe) Urease Pigmente.

23 Biochemische Identifizierung Nähragar (Fleischagar) Einsatz: Universalnährboden zur Züchtung weniger anspruchsvoller Mikroorganismen. Zusammensetzung: Hefeextrakt 3 g/l NaCl 5 g/l Agar-Agar 10 g/l Pepton aus Fleisch, Casein 14 g/l Micrococcus luteus Wirkungsweise : entfällt Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus

24 Biochemische Identifizierung Endoagar Einsatz: Selektivnährboden zum Nachweis von Escherichia coli und (fäkalen) coliformen Bakterien in Wasser, Milch, Milchprodukten und anderen Lebensmitteln nach Endo (1904); Nachweis der Laktoseverwertung Zusammensetzung: Pepton aus Fleisch, peptisch 10 g/l Lactose 10 g/l K 2 HPO 4 2,5 g/l Na 2 SO 3, wasserfrei 3,3 g/l Fuchsin (Pararosanilin) 0,4 g/l Agar 15 g/l

25 Biochemische Identifizierung Endoagar (Forts.) Wirkungsweise: Bei der Nährbodenbereitung wird Fuchsin durch Sulfit zur farblosen fuchsinschwefligen Säure reduziert. Natriumsulfit und fuchsinschwefel. Säure unterdrücken das Wachstum der meisten grampositiven Bakterien, nicht jedoch der Enterobacteriaceae. E. coli und coliforme Bakterien bilden bei der Verwertung von Lactose neben Säure und Gas intermediär Acetaldehyd. Dieser reagiert mit Sulfit zu einer Additionsverbindung und setzt dabei aus der fuchsinschwefligen Säure den roten Farbstoff Fuchsin frei.

26 Biochemische Identifizierung Endoagar (Forts.) Rote Kolonien: Lactose + Bakterien E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter Farblose (schwach rosa) Kolonien: Lactose Bakterien Salmonella, Shigella, Proteus E. coli Proteus vulgaris Klebsiella oxytoca

27 Biochemische Identifizierung Leifson-Agar Nachweis von: Salmonellen Shigellen Inhaltsstoffe: Pepton Fleischextrakt Lactose Natriumthiosulfat Ammoniumeisen(III)-citrat Natriumcitrat Natriumdesoxycholat Neutralrot

28 Biochemische Identifizierung Leifson-Agar (Forts.) Wirkungsweise: hohe Konzentrationen an Desoxycholat und Citrat hemmen grampositive Bakterien und hemmen Coliforme Salmonellen wachsen ungehindert; einige Shigellen werden etwas gehemmt. Lactoseabbau Säuerung Farbumschlag des Indikators Neutralrot nach rot (Salmonellen und Shigellen sind Lactose negativ!). Reduktion von Thiosulfat zu Sulfid wird als schwarzes Eisensulfid nachgewiesen.

29 Biochemische Identifizierung Cetrimid-Agar Einsatz: Nachweis von Pseudomonas aeruginosa Zusammensetzung: Pepton aus Gelatine Magnesiumchlorid Kaliumsulfat N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid(Cetrimid) Agar-Agar Wirkungsweise : Cetrimid dient der weitgehenden Hemmung der Begleitflora. Kolonien von Pseudomonas aeruginosa bilden einen blau-grünen Farbstoff (Pyocyanin) und fluoreszieren im UV-Licht.

30 Biochemische Identifizierung Mossel-Cereus Agar Einsatz: Zum Nachweis und zur Isolierung von Bacillus cereus Zusammensetzung: Pepton aus Casein 10g/L Fleischextrakt 1g/L D (-) Mannit 10g/L NaCl 10g/L Phenolrot 0,025g/L Eigelb-Polymyxin Supplement Wirkungsweise (Nachweis B. cereus): B. cereus ist Mannit negativ Mannitgehalt des Nährbodens ermöglicht die Abtrennung der Mannitpositiven Begleitflora; Phenolrotindikator Farbumschlag nach gelb B. cereus toleriert Polymyxin, welches die Begleitflora hemmt B. cereus bildet das Enzym Lecithinase: die unlöslichen Abbauprodukte des Eigelb-Lecithins häufen sich um die Kolonien als weißes Präzipitat an.

31 Biochemische Identifizierung Mossel-Cereus Agar (Forts.) B. cereus: Mannit-negativ Lecithinase-Bildung Ausfällungsprodukte um Impfstrich B. subtilis: Mannit-Umsetzung ph sinkt, Indikator Phenolrot schlägt nach gelb um Lecithinase-negativ

32 Biochemische Identifizierung Blutagar Einsatz: Institut für Mikrobiologie Professur für Mikrobielle Diversität Isolierung und Züchtung anspruchsvoller, vor allem pathogener Mikroorganismen und zur Erfassung der Hämolyseform. Zusammensetzung: Nährsubstrat (Herzextrakt und Pepton) 20 g/l Natriumchlorid 5 g/l Agar 15 g/l Zusatz von frisch gewonnenem, defibriniertem Schafblut ca ml α- Hämolyse: -Umwandlung von Hämoglobin in Methämoglobin bei intakt gebliebener Erythrozytenmembran; - Ausbildung grüner Höfe um die Kolonien (Vergrünung); - häufig bei oralen Streptokokken, Enterococcus faecium β- Hämolyse: -Auflösung der Erythrozyten durch verschiedene Hämolysine (extrazelluläre Enzyme, z.b. Phospholipasen), -Abbau des Hämoglobins; klare Höfe um die Kolonien; -Eiter bildende hämolytische Streptokokken, Staphylococcus aureus

33 Biochemische Identifizierung Blutagar Institut für Mikrobiologie Professur für Mikrobielle Diversität

34 Biochemische Identifizierung Blutagar Institut für Mikrobiologie Professur für Mikrobielle Diversität

35 Biochemische Identifizierung Baird-Parker Agar: zum Nachweis von Staphylokokken Inhaltsstoffe: Fleischextrakt Pepton aus Casein Hefeextrakt Natriumpyruvat Glycin Lithiumchlorid; Zusätzlich: Eigelb-Tellurit-Emulsion Staphylococcus aureus Wirkungsweise: Lithiumchlorid und Tellurit Hemmung der Begleitflora Pyruvat und Glycin auf Staphylokokken selektiv wachstumsfördernd durch Lipolyse und Proteolyse erzeugte charakteristische Hof- und Ringbildungen Schwarzbildung infolge Reduktion des Tellurits zu Tellur.

36 Biochemische Identifizierung TTC-Azid Agar Einsatz: Nachweis von Enterokokken Zusammensetzung: Pepton aus Casein 15,0 g Sojabouillon 5,0 g Hefeextrakt 5,0 g Glukose 2,0 g K 2 HPO 4 4,0 g Na-Azid 0,4 g TTC Wirkungsweise : Na-Azid hemmt das Wachstum GRAM-negativer Keime. Enterokokken sind unempfindlich gegenüber Na-Azid. Enterokokken reduzieren TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid) zu rotem Formazan rote Kolonien

37 Biochemische Identifizierung Aesculin-Galle Agar Einsatz: Nachweis von Enterokokken Zusammensetzung: Fleischextrakt 3,0 g Pepton aus Fleisch 5,0 g Ochsengalle 40 g Äsculin 1,0 g Eisen-(III)-citrat 0,5 g Wirkungsweise : Die von Enterokokken tolerierten Gallensalze hemmen die Begleitflora. Enterokokken hydrolisieren das Glucosid Äsculin in Glukose und Äsculetin. Äsculetin bildet mit Fe-(III)-Ionen einen olivgrünen bis schwarzen Komplex.

38 Biochemische Identifizierung Zwei-Zucker Medium nach Kligler Nachweis von: Laktase (laktosespaltendes Enzym) Gärung in Form von CO 2 -Bildung, H 2 S-Bildung Zusammensetzung: 1 % Laktose (Substrat) 0,1 % Glukose (Substrat) Phenolrot (Indikator) Natriumthiosulfat (Substrat) Eisenammoniumcitrat (Reagenz)

39 Biochemische Identifizierung Zwei-Zucker Medium nach Kligler (Forts.) Reaktionen: Durch den Glukoseabbau entsteht Säure und Phenolrot wird beim ph < 7 gelb. Nach Oxidation der Schrägfläche durch den Luftsauerstoff wird der Agar im oberen Bereich realkalisiert (ph steigt über 7) und die Schrägfläche wird rot, Wird auch Laktose gespalten (Säurebildung!), dann bleibt der gesamte Agar durch den Säureüberschuss gelb. Geschieht dies ohne Verwendung von Sauerstoff (Gärung), so bildet sich CO 2, was als kleine bis große Luftblasen und Risse im Agar sichtbar wird. Reduktion des Thiosulfat zu Schwefelwasserstoff Das gebildete H 2 S reagiert mit dem Eisenammoniumcitrat zu Eisensulfid, was als schwarzer Niederschlag ausfällt.

40 Biochemische Identifizierung Harnstoffverwertung Urease Test: Um Harnstoff als N-Quelle nutzen zu können, müssen die Bakterien über das Enzym Urease verfügen, welches Harnstoff hydrolytisch in Ammoniak und Kohlendioxid spaltet. Die Freisetzung von Ammoniak führt zur Alkalisierung des Mediums (Harnstoff-Agar nach Christensen, enthält neben Harnstoff auch Pepton, Glucose sowie Phenolrot), wodurch es zum Farbumschlag des Indikators Phenolrot von gelb nach rot kommt. Bei Proteus vulgaris ist die Urease konstitutiv vorhanden, bei vielen Bakterien wird ihre Bildung durch Ammonium- Ionen reprimiert, einigen wie z.b. E. coli fehlt dieses Enzym. H 2 N-CO-NH 2 + H 2 O 2 NH 3 + CO 2

41 Biochemische Identifizierung SIM-Agar Schwefelwasserstoff/Indolbildung/Mobility Zusammensetzung: Tryptophan (Substrat) Pepton (Cystein-Quelle) Fleischextrakt Dextrose (Substrat) Ammoniumeisen (III)-citrat Natriumthiosulfat Reaktionen: Die Beweglichkeit wird durch eine Trübung des Agars nachgewiesen. Verursacht wird diese Trübung durch die eingewanderten Bakterien. Tryptophan wird enzymatisch zu Indol abgebaut, das mit dem Kovacs-Reagenz nachweisbar ist, es wird jedoch erst nach der Inkubation manuell hinzugegeben. Sulfidbildung durch Schwärzung (FeS) im Bereich des Impfkanals

42 Biochemische Identifizierung Indolproduktion dient zur Charakterisierung von Enterobakterien Nachweis des Enzyms Tryptophanase, welches AS Tryptophan in Indol, Pyruvat und Ammoniak spaltet Tryptophanase positiv: E. coli, Proteus vulgaris Tryptophanase negativ: Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes

43 Biochemische Identifizierung Simmons-Citratagar Citratverwertung ist gut geeignet zur Unterscheidung von Enterobakterien Citrat kann als C-Quelle verwendet werden, wenn Enzym Citratlyase vorhanden ist Die mit der Citratverwertung einhergehende Alkalisierung wird durch Umschlag des Indikators Bromthymolblau von grün nach blau angezeigt

44 Biochemische Identifizierung OF-Test Institut für Mikrobiologie Professur für Mikrobielle Diversität Nachweis: Oxidative-Fermentative Verwertung von Kohlehydraten: Zusammensetzung: Pepton Hefeextrakt KH 2 PO 4 Bromthymolblau Zucker (Glucose, Lactose, Maltose,...) Farbe: klar grün (blaugrün) Wirkungsweise: Zuckerabbau führt zur Ansäuerung Farbumschlag des Indikators nach gelb an der Oberfläche des offenen Röhrchens oxidativ im gesamten (im Paraffin verschlossenen) R. fermentativ Blaufärbung: Farbumschlag infolge Alkalisierung (Verwertung v. Pepton)

45 Biochemische Merkmale VOGES-PROSKAUER-Reaktion und Methylrot-Test: Gemischte Säuregärung Butandiolgärung z.b. Citrobacter, Escherichia, Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia z.b. Enterobacter, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens

46 Biochemische Merkmale VOGES-PROSKAUER-Reaktion: VP positiv

47 Biochemische Merkmale Methylrot-Probe: Indikator Methylrot wird zur bebrüteten Bouillon gegeben. Bei ph-werten < 4,4 erfolgt Farbumschlag nach rot. Methylrot positiv In diesem Fall wurde aus der Glucose viel Säure gebildet. sind Bakterien gewachsen, die Pyruvat zu neutralen Produkten umwandeln --> negativ

48 Biochemische Merkmale Katalase Test: während der aeroben Atmung wird auch H 2 O 2 gebildet; teilweise auch das extrem toxische Superoxid Die meisten aeroben und fakulativ anaeroben Bakterien haben das Enzym Katalase, welches imstande ist, für die Zellen das giftige H 2 O 2 zu spalten (2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 ). Strikt anaerobe Keime synthet. keine Katalase, Peroxidase oder Superoxid-Dismutase --> Sauerstoff wirkt toxisch Für die Bestimmung von Bakterienkulturen wird der Katalase-Test mit 3%iger H 2 O 2 durchgeführt.

49 Biochemische Merkmale Oxidase Test: Cytochromoxidase spielt wichtige Rolle im Elektronentransport der Atmungskette, z.b. bei den Gattungen Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium (u.v.a.) Cytochrom-Oxidase katalysiert die Oxidation eines reduzierten Cytochroms durch molekularen Sauerstoff Es wird nicht von der Familie der Enterobacteriaceae gebildet Nachweis: Bei Anwesenheit von Cytochromoxidase wird das Reagenz Indolphenolblau oxidiert. Innerhalb von 30 sec. tritt eine intensive Blauviolettfärbung auf. Achtung mit Zahnstocher abnehmen, nicht mit Impföse

50 Gram-Färbung + Gram-positiv Gram-negativ O/F-Test Stäbchen obligat aerob anaerob Bacillus u.a. Staphylococcus Mossel-Cereus- Agar, Sporenfärbung Clostridium Identifizierung siehe Tab. 4, auch API 50 CHB Standardisierte Tests: Kokken Katalase-Test + Micrococcus Enterobacteriaceae Blut-Agar, Baird-Parker- Agar Plasmakoagulase API Staph Streptococcus Enterococcus Fermentative Keine fermentative Glucoseverwertung Glucoseverwertung Oxidase-Test + + Aeromonas Plesiomonas Vibrio Azid-TTC-, Äsculin-Galleund Blut-Agar Escherichia Salmonella Klebsiella Proteus u.a. Nonfermenter Pseudomonas u. verwandte Taxa Alcaligenes Flavobacterium Pseudomonas (Xanthomonas) maltophila Ps. (Chryseomonas) luteola Acinetobacter ENDO-Agar, MacConkey-Agar, BPLS- Agar, Leifson-A., Cetrimid-Agar u.a. API 20 Strep API 20-E API 20-NE

51 Biochemische Merkmale API-Testsystem 20 kleine Probengefäße mit unterschiedlichen Testsubstanzen Inokulation der Probengefäße mit Suspension der Reinkultur Ermittelung einer Kennzahl nach Inkubation (meist durch Farbveränderung) API 20 E; API 20 NE; API Staph; API Strep API 20 E mit postiven Testergebnissen (obere Reihe) und negativen Testergebnissen (untere Reihe); Quelle: Biomerieux

52 Coliforme Keime und E. coli Familie der Enterobacteriaceae GRAM- Stäbchen Peritrich begeißelt Nicht Sporen bildend Cytochrom-c Oxidase negativ Vergären Laktose unter Gasbildung Vertreter: Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter E.coli = Fäkalkeim Kommt in hohen Konzentrationen in Warmblüter Fäkalien vor Vermehren sich nicht in der Umwelt Präsentationsname XYZ Folie 52 von XYZ

53 Rechtliche Grundlagen Badegewässerrichtlinie Novellierte EU Richtlinie seit 2006, seit 2008 Umsetzung auf Länderebene regelt mikrobiologische Anforderungen an Badegewässer Präsentationsname XYZ Folie 53 von XYZ

54 Mikrobiologische Anforderungen an Badegewässer Parameter Enterokokken (KbE / 100 ml) E. coli (KbE / 100 ml) Enterokokken (KbE / 100 ml) E. coli (KbE / 100 ml) Ausgezeichnete Qualität Gute Qualität Ausreichende Qualität 200 (*) 400(*) 330 (**) 500 (*) 1000 (*) 900 (**) 100 (*) 200(*) 185 (**) 250 (*) 500 (*) 500 (**) Binnengewässer Küstengewässer * Auf Grundlage der 95% Perzentile ** Auf Grundlage der 90% Perzentile Präsentationsname XYZ Folie 54 von XYZ

55 Nachweis Coliforme Keime und E. coli Colilert -18/QuantiTray Prinzip: Defined Substrate Technology ONGP Gelbfärbung durch Coliforme (β-galactosidase) MUG Fluoreszenz durch E. coli (β-glucuronidase) Verfahren: 100 ml Probe + Colilert -18-Medium in QuantiTray 24 h Inkubation bei 35 C Auszählen gelber / fluoreszierender Felder Auswertung mittels MPN-Tabellen bzw. Software Präsentationsname XYZ Folie 55 von XYZ

56 Reagenz zur Probe hinzufügen Tray verschweißen und inkubieren Probenreagenz zum Tray geben Positive Probenvertiefungen zählen und MPN anhand der Tabelle/Calculator ermitteln Präsentationsname XYZ Folie 56 von XYZ

57 oder MPN-Tabelle Präsentationsname XYZ Folie 57 von XYZ

58 Serologische Merkmale Antiköper-Antigen Reaktion Antigen, engl. Antibody generating der Bakterien: = Bezeichnung für jede Substanz mit chemisch charakterisierten Gruppierungen, die vom Organismus als fremd erkannt wird und die Befähigung besitzt, eine Immunantwort auszulösen Lokalisation der Antigene: O-Antigen (= somatisches Antigen), lokalisiert in der äußeren Membran, Lipopolysaccharide, auch sog. Oberflächen-Antigene H-Antigen (= Geißelantigen), Serovare besitzen i.d.r zwei Arten (Phasen); Einzelzelle monophasisch Antikörper (Immunglobuline) = Glykoproteine im Serum und Körperflüssigkeiten der Säugetiere. Bildung erfolgt spezifisch nach Kontakt mit Antigen (Impfung) Agglutination Antikörper bilden Komplexe mit Antigenen (Verklumpung)

59 Serologische Merkmale Serologische Klassifizierung der Gattung Salmonella Grundlage Kauffmann White Schema (enthält ca.2500 verschiedene Serovare), entwickelt 1926 von Philip. B. White, ausgebaut und erweitert von Fritz Kauffmann (bis 1978), regelmäßige Aktualisierungen durch M. Popoff (jährlich neue Serotypen beschrieben), erlaubt die Einordnung von Varietäten und Serotypen, steht nicht im Einklang mit der klassischen Nomenklatur, ist jedoch noch weit verbreitet und angewandt.

60 Molekularbiologische Identifizierung PCR/RT-PCR/real-time PCR(qPCR) Polymerase Chain Reaction -Enzymatische (Polymerase) Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen -Thermal Cycling: alternierendes Aufheizen / Abkühlung auf definierte Temperaturen -Hitzestabile DNA Polymerase synthetisiert enzymatisch neuen DNA Strang aus DNA- Bausteinen, den Nukleotiden, mittels einzelsträngiger template-dna und DNA- Oligonukleotiden, sog. Primern

61 Molekularbiologische Identifizierung PCR/RT-PCR/real-time PCR(qPCR) Enzymatische Doppelsträngige Einzelsträngige Primer Verlängerung binden (ss) (ds) DNA des DNA- Stranges C 72 C 95 C

62 Molekularbiologische Identifizierung PCR/RT-PCR/real-time PCR(qPCR) usw , Kopien nach 30 Zyklen 2 n Kopien nach n Zyklen

63 Molekularbiologische Identifizierung Elektrophorese / Visualisierung

64 Molekularbiologische Identifizierung Elektrophorese / Visualisierung (Forts.)

65 Institut für Mikrobiologie Professur für Angewandte Mikrobiologie Molekularbiologische Identifizierung PCR-Nachweis Sulfat-reduzierender Bakterien Sulfatreduzierende Bakterien sind obligat anaerobe, chemo-organotrophe Bakterien, die Sulfat als terminalen Elektronen-akzeptor nutzen (dissimilatorsiche Sulfatreduktion). Phylogenetisch lassen sich 4 Gruppen unterscheiden: Gram-negative, mesophile (δ-proteobakterien): Desulfobacter, Desulfovibrio Gram-positive Endosporenbildner: Desulfotomaculum, Desulfosporosinus Thermophile Bakterien: Thermodesulfobacterium Termophile Archaea: Archaeoglobus

66 Konzeption des Praktikums Aufgabe A Aufgabe B Aufgabe S Aufgabe L Aufgabe PCR Aufgabe H Zwei unbekannte Keime auf einer Agarplatte Zwei unbekannte Keime in einer Bouillon Ein unbekannter Keim auf Schrägagar Eigene Isolate aus der Luft Nachweis von Sulfatreduzierern / Isolaten mittels PCR Identifizierung von Bakterien mittels CARD-FISH Zielstellung des Praktikums: 1) Isolierung von Bakterien aus Umweltproben 2) Quantifizierung von Mikroorganismen 3) Identifizierung von eigenen Isolaten und vorgegebenen Keimen

67 Studentenvorträge / Testat / Protokolle Studentenvorträge: Jeder Student soll eines ihrer Isolate in einem Kurzvortrag vorstellen. Eine Liste mit den entsprechenden Vortragsthemen wird im Kurs ausgelegt. Die Vorträge am letzten Kurstag gehalten. Die Vortragsdauer beträgt Minuten (auf Zeiteinhaltung achten!) Zusätzlich zum Vortrag sind Handouts für die Kommilitonen zu erstellen, die in übersichtlicher und knapper Form den Inhalt des Vortrages enthalten. Testat: Am letzten Kurstag wird ein schriftlicher Test durchgeführt. Protokolle: 14 Tage nach Kursende ist von jedem Kursteilnehmer ein Protokoll abzugeben.

68 Heutiges Programm 1. Kurstag Aufgabe A: Gramtest (Färbung und Schnelltest) Überimpfen auf verschiedenen Selektivnährmedien je nach Ergebnis der Morphologie und Grameigenschaften Aufgabe B: Aufgabe S: Aufgabe L: Aufgabe PCR: Quantitative Analyse: - mit PBS Verdünnungsreihe herstellen bis von den Verdünnungsstufen 10-4 bis 10-6 je 0,1 ml auf NA ausspateln Qualitative Analyse: Ausstrich der unverdünnten Bouillon auf die angegebenen Selektivnährböden Gramtest (Färbung und Schnelltest) Überimpfen auf verschiedenen Selektivnährmedien - von jeder Gruppe/Student wird je ein Standort bearbeitet - Erfassen der gewachsenen Bakterienkolonien - jede Gruppe/Student soll ca. 5 verschiedene (Bakterien-)Kolonien charakterisieren und differenzieren; Abimpfen auf NA; Bebrütung bei Wachstumstemperatur (zur Charakterisierung siehe Grundkursunterlagen) Nukleinsäureextraktion (DNA) aus Sedimentproben

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