Auswertung von Custom Agilent ChIP on Chip Microarrays mittels MS-Excel für genomweite Methylierungsanalysen

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1 Auswertung von Custom Agilent ChIP on Chip Microarrays mittels MS-Excel für genomweite Methylierungsanalysen Für die Datenanalyse wird MS-Excel ab Version 2010 benötigt. Ältere Versionen können wegen der Beschränkung der Zeilenanzahl nicht verwendet werden. 1. Bearbeitung der Rohdaten - FE-File (Feature Extraction Rohdaten txt-file) in Excel öffnen und die ersten Zeilen mit den Array-Attributes vor den Daten entfernen. - Alle Kontrollen (ControlType = 1 oder -1) und "richtige" Probes (ControlType = 0) in getrennte Tabellenblätter kopieren. (Alle Probes ohne Kontrollen sind genau die Probes, die auch in der Array-spezifischen Gene-List von Agilent aufgeführt sind). - Speichern zur Sicherung dieses Arbeitsschrittes unter 1_Auswertung_RohData_ArrayX.xlsx. - Alle Probes ohne Control und Custom Probes in neue Excel Arbeitsmappe kopieren und speichern als 2_Auswertung_MWReplikate_ArrayX.xlsx. 2. Bildung des Mittelwertes der Replikate - In Tabelle 2_Auswertung_MWReplikate_ArrayX.xlsx die Spalten mit Werten die nicht benötigt werden bis auf ProbeName, SystematicName LogRatio, g und rprocessedsignal entfernen. - neue Spalte nach Spalte LogRatio einfügen und darin den Logarithmus zur Basis 2 mit der Formel =log(10^x;2) aus der ursprünglichen Spalte LogRatio berechnen. (Grund: In den Arraydaten wird der Logarithmus zur Basis 10 angegeben, den n-fachen Methylierungsunterschied beschreibt aber der Logarithmus zur Basis 2) - Spalte Log2Ratio kopieren und als Werte wieder einfügen, sodass eine später versehentliche Neuberechnung ausgeschlossen wird.

2 - Mittelwerte der Replikate für log2ratio, g und rprocessedsignal für jeden ProbeName mittels Pivot Tabelle in neuem Tabellenblatt ermitteln. (Für die ProcessedSignals ist eigentlich das geometrische Mittel mathematisch richtig!) - Berechnete Pivot Tabelle kopieren und als Werte in neues Arbeitsblatt einfügen. - SystematicName durch Abgleich der ProbeNames in der Pivot-Tabelle durch vorheriges entfernen der Duplikate aus Tabellenblatt "Probes" wieder einfügen. (Proben jeweils nach ProbeName sortieren, und passend einfügen. Den Schritt Duplikate entfernen nicht speichern, alternativ in gesonderter Tabelle durchführen.) - nach ProbeName sortieren und speichern. 3. Berechnung der laufenden CpG-Insel Nummer zur Zuordnung der Sonden zur jeweiligen CpG-Insel - Tabellenblatt aus Schritt 2 unter 3_Auswertung_BerechnungLfdCpGIsland_ArrayX.xlsx speichern. - Die zur jeweiligen Design ID des Arrays gehörende Gene-List (und evtl. Sequence-List) der Tabelle zufügen. (Proben jeweils nach ProbeName sortiert, und passend einfügen) Die Listen sind unter zu finden. (Login / Passwort für die in dieser Arbeit verwendeten Array ist zu erfragen bei Universitätsfrauenklinik Jena, Funktionsbereich Gynäkologische) Molekularbiologie) - nach SystematicName sortieren und eventuelle "unmapped" Probes (Spalte SystematicName = unmapped oder ProbeID / ProbeName) entfernen. - "SystematicName" in eine neue Spalte kopieren und trennen nach "Chromosom", "Start" und "Stop" (Befehl "Text in Spalten"). - Nach genomischer Position sortieren (Chromosom und Start). "LfdPos" (laufende genomische Positionsnummer) in neuer Spalte A vergeben.

3 - CpG-Island, CytoBand und Tm Informationen aus Agilent DNA-Workbench Software Report in Tabelle einfügen. (txt-file aus ProbeNames erstellen und mit CpG-Info txt-file aus DNA Workbench Export über Microsoft Access Abfrage verknüpfen; Proben jeweils nach ProbeName sortieren, und passend in Excel Tabelle einfügen) - Tabelle nach LfdPos sortieren und speichern. - Folgende Spalten / Daten müssten nun verfügbar sein: LfdPos, ProbeName, CytoBand, SystematicName, Chr, Start, Stop, TargetID, Accession, GeneName, GeneSymbol, Description, CpGInfo, MWLog2Ratio, MWgProcessedSignal, MWrProcessedSignal, Tm - Nach der Spalte CpGInfo eine neue Spalte einfügen (LfdCpGIsland). - Tabelle nach Spalte CpGInfo sortieren, und leere Zellen in Spalte CpGInfo mit zufälligen Zahlen auffüllen (leere Zellen mit 1 bis X "Datenreihe auffüllen"). Dieser Schritt ist für das berechnen mit Formeln der LfdCpGIsland nötig. - Tabelle nach LfdPos sortieren. - Nach Zeile 1 (Überschrift) eine neue Zeile einfügen, Start und Stop - Wert in dieser Zeile mit 1 und LfdCpGIsland Wert mit 0 beschriften. Dieser Schritt ist für das berechnen mit Formeln der LfdCpGIsland nötig. - LfdCpGIsland Nummer berechnen =WENN((ODER(M3=M2;Abs(F3- G2)<300));N2;N2+1) (Spalten siehe nächst Abbildung) - Spalte LfdCpGIsland kopieren und als Werte (Inhalte Einfügen --> Werte) wieder einfügen. - Zeile 2 und zufällige Zahlen in Spalte "CpGInfo" wieder entfernen. - Speichern (3_Auswertung_BerechnungLfdCpGIsland_ArrayX.xlsx)

4 4.1 Berechnung der Mittelwerte über eine CpG-Insel (optional) - Mittelwerte der Log2Ratio, g und rprocessedsignal, sowie Minimum für Start und Maximum für Stop für jede CpG-Insel (LfdCpGIsland) mittels Pivot Tabelle berechnen. (Für die ProcessedSignals ist eigentlich das geometrische Mittel aus den Rohdaten ohne vorherige Mittelwertbildung der Replikate mathematisch richtig) - Pivot Tabelle kopieren als Werte in neues Tabellenblatt einfügen. - Spalte Chr, GeneSymbol und CpGInfo durch Abgleich mit LfdCpGIsland bei vorherigen entfernen der Duplikate aus Tabellenblatt "Berechnung LfdCpGIsland" wieder einfügen (Proben jeweils nach LfdCpGIsland sortieren, und passend einfügen. Den Schritt Duplikate entfernen nicht speichern, alternativ in gesonderter Tabelle durchführen.) - Speichern unter MW_CpGIslands_ArrayX - Tabellenblatt Berechnung LfdCpGIsland kopieren und in eine neue Excel Arbeitsmappe einfügen, unter 4_Auswertung_Berechnung3erMittelwerte_ArrayX.xlxs speichern. 4.2 Berechnung der 3er Mittelwerte (Mittelwerte 3 aufeinander folgender Sonden innerhalb einer CpG-Insel) - Datei 3_Auswertung_BerechnungLfdCpGIsland_ArrayX.xlsx neu speichern unter 4_Auswertung_Berechnung3erMittelwerte_ArrayX.xlsx - Automatische Berechnung in Excel abschalten! - Für 3erMWLog2Ratio, 3erMWg- und 3erMWrProcessedSignal neue Spalten für Berechnungen einfügen (jeweils 1 Probe, 2 Proben, 3 Proben, Summe: siehe Grafik): - Folgende Formeln für die Berechnung verwenden (gezeigt am Beispiel Log2Ratio, für ProcessedSignal Spalte O mit T2 bzw. Y austauschen.

5 1Probe: =WENN(ZÄHLENWENN(($N:$N);$N3)=1;O3;0) 2Proben: =WENN((UND(((ZÄHLENWENN(($N:$N);$N3)=2));$N3=$N2));MITTELWERT(O2:O3);0) >=3Proben: =WENN((UND(((ZÄHLENWENN(($N:$N);$N3)>2));$N3=$N1));MITTELWERT(O1:O3);0) Summe: =SUMME(P3:R3) N: Spalte LfdCpGIsland O: Spalte MWLog2Ratio (Für die ProcessedSignals ist eigentlich das geometrische Mittel aus den Rohdaten ohne vorherige Mittelwertbildung der Replikate mathematisch richtig) - Tabellenblatt berechnen (F9) (dauert mehrere Stunden, alternativ über Nacht) - Berechnete Tabelle kopieren und als Werte in eine neue Excel Arbeitsmappe einfügen. - Speichern unter 5_Auswertung_3erMittelwerte_Werte_ArrayX.xlsx. 5. Bearbeitung Auswertung der 3er Mittelwerte - Datei 5_Auswertung_3erMittelwerte_Werte_ArrayX.xlsx: - Spalten der Log2Ratio der Einzelsonden, Spalte 1 Probe, 2 Proben und 3 Proben entfernen (rot markiert in Grafik unten), übrig bleibt jeweils die Spalte Summe. - Summen-Spalten neu beschriften (3erMWLog2Ratio, -r/g ProcessedSignal) - Zeilen mit dem Wert 0 für 3erMWLog2Ratio und 3erMWgProcessedSignal und 3erMWrProcessedSignal entfernen (siehe nächste Grafik). (Sortieren nach (Summe) 3erMWLog2Ratio, danach nach (Summe) 3er MWgProcessedSignal) Grund: Diese Zeilen entstehen bei der Berechnung der 3er Mittelwerte für die ersten zwei Probes einer CpG-Insel. Der erste Mittelwert steht jedoch in der Zeile von Sonde 3, welcher bei Berechnung den Mittelwert von Sonde 1 bis 3 darstellt.

6 - Nach LfdPos sortieren und speichern. 6. Auswahl der Kandidatengene - 3er Mittelwerte aus Punkt 5 aufsteigend bzw. absteigend sortieren und die Proben über bzw. unter einem definierten Wert für differentiell methylierte Regionen auswählen.