Arbeitsgruppe Kuhse - Projekte. Arbeitsgruppe Kuhse - Projekt I. Molekulare Grundlagen zellulärer Differenzierung. Zusammenfassung

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1 Arbeitsgruppe Kuhse - Projekt I Arbeitsgruppe Kuhse - Projekte Projekt I: Molekulare Grundlagen zellulärer Differenzierung Projekt II: Transgene Tiermodelle synaptischer Rezeptorverankerung Projekt III: Strukturbestimmung der Glycin- und Glutamat-Bindungsstellen des exzitatorischen, membranständigen NMDA-Rezeptors Arbeitsgruppe Kuhse - Projekt I Molekulare Grundlagen zellulärer Differenzierung Zusammenfassung Spezifische Differenzierungsschritte neuronaler Zellen sind von der Aktivierung des exzitatorischen NMDA-Rezeptor abhängig. Die wichtige Funktion des NMDA-Rezeptors bei einzelnen neuronalen Differenzierungsprozessen beruht auf funktionellen Eigenschaften, die diesen Rezeptor von anderen Subtypen der Glutamatrezeptor-Familie unterscheiden. Die Aktivierung dieses ligandengesteuerten Ionenkanals durch das Binden von Glutamat führt zu einer Depolarisierung der postsynaptischen Membran, darüberhinaus ist der Rezeptor mit Proteinen der postsynaptischen Dichte assoziiert und steuert u.a. durch Regulation von Ca2+-Strömen unterschiedliche zelluläre Signalkaskaden. In dem vorgesehenen Projekt soll untersucht werden, welche Bedeutung die Wechselwirkungen des Rezeptors mit Proteinen der postsynaptischen Dichte (u.a. Tubulin, PSD-95) für die Funktion von signalvermittelnden Proteinen wie nnos und SynGAP und damit für die Regulation zellulärer Signalwege hat. PSD-95 und Proteine des Zytoskeletts sind sowohl mit dem NMDA-Rezeptor als auch mit Signaltransduktionsmolekülen wie nnos oder SynGAP assoziiert, so daß die räumliche Kompartimentierung und möglicherweise auch die Proteinwechselwirkungen in diesem Komplex eine Bedeutung für die Kontrolle der zellulären Signaltransduktion haben könnten. In den geplanten Projekt soll auch die Frage untersucht werden, ob die Interaktion des NMDA-Rezeptors mit Proteinen der postsynaptischen Dichte durch proteolytische Spaltung des Carboxy-Terminus der NMDA-Rezeptoruntereinheiten reguliert werden. Die Steuerung von spezifische Signaltransduktionswege soll durch die Bestimmung von Enzymaktivitäten 1

2 Zusammenfassung (Guanylatcyclase, cgmp-spiegel), durch die Bestimmung von Caspase 3-Aktivität sowie durch Gelretardierungsexperimente mit spezifischen Promotorfragmenten (sre) untersucht werden. Darüberhinaus werden die durch den NMDA-Rezeptor regulierten zellulären Prozessen u.a. anhand der quantitativen Bestimmung des durch den NMDA-Rezeptor vermittelten Zelltods bestimmt. Diese Untersuchungen sollen vergleichend in Primärzellkulturen (u.a. Hippocampus-dopaminerge Mittelhirnneurone aus Ratte) und transient sowie stabil transfizierten HEK 293-Zellen durchgeführt werden. Die heterologe Expression wird dazu verwendet, verschiedene Mutanten der Proteine des Signaltransduktionskomplexes zu exprimieren, und die funktionellen Konsequenzen dieser Mutationen für die Signaltransduktion zu untersuchen. Stand der Forschung Die Ausdifferenzierung von dendritischen Dornensynapsen als postsynaptische Kontaktstellen für die Mehrheit von exzitatorischen Synapsen des zentralen Nervensystems stellt einen wichtigen Schritt für die zelluläre Differenzierung von Neuronen da. Die Ausstattung der postsynaptischen Membran mit einer Vielzahl von spezifischen Neurotransmitter-Rezeptoren stellt dabei einen komplexen Differenzierungsschritt dar, dessen Regulation und molekulare Grundlagen noch weitgehend unbekannt sind. Mit der Ausdifferenzierung dieser Kontaktstellen ist darüberhinaus keine statische Differenzierungsstufe erreicht, sondern die synaptischen Kontaktstellen unterliegen einer aktivitätsabhängigen, strukturellen und funktionellen Veränderung. Dieses als synaptische Plastizität bekannte Phänomen wird heute als ein wichtige funktionelle Grundlage von Lernvorgängen und Gedächtnisbildung angesehen. Ein Schlüsselprotein, das die aktivitätsabhänge Modifizierung synaptischer Kontaktstellen vermittelt, ist der exzitatorische N-Methyl-D-Aspartat- (NMDA)-Rezeptor, ein Subtyp der Glutamat-Rezeptor-Familie. Der NMDA-Rezeptor spielt außer bei der schnellen exzitatorischen Signalübertragung und der Entwicklung des Nervensystems auch bei Erkrankungen des ZNS eine besondere Rolle. Bei Überaktivierung des NMDA-Rezeptors kommt es zum nekrotischen und/oder apoptotischen Absterben von Neuronen. Deshalb ist die Fehlsteuerung des NMDA-Rezeptors ursächlich an der ZNS-Schädigung beim Schlaganfall aber auch bei weiteren Erkrankungen des ZNS beteiligt (Choi, 1988). Die Bedeutung des NMDA-Rezeptors beruht auf einer Anzahl von charakteristischen Eigenschaften, wie die spannungsabhängige Regulation durch Mg2+-Ionen und die Aktivierung des Rezeptors durch den Agonisten Glutamat und den Koagonisten Glycin. Von besonderer Bedeutung ist weiterhin die hohe Ca2+-Permeabilität des Rezeptors, da die durch den NMDA-Rezeptorkanal in die Zelle einströmenden Ca2+-Ionen zelluläre Prozesse regulieren und bei Überaktivierung des Rezeptors neuronalen Zelltod auslösen können (Choi, 1988). Der Ca2+-Strom stellt dabei ein primäres zelluläres Signal da. Durch das Binden von Ca2+ an Calmodulin erfolgt sekundär die Aktivierung von Calmodulin-regulierten Proteinen wie die neuronale Form der 2

3 Stand der Forschung NO-Synthase (nnos) oder die CaMKII, durch die weitere zelluläre Prozesse gesteuert werden. Der NMDA-Rezeptor ist ein hetero-oligomeres Membranprotein aus NR1- und NR2-Untereinheiten, die durch ihre Anordnung einen zentralen Kationen-selektiven Ionenkanal in der post-synaptischen Membran ausbilden. Der N-Terminus der Rezeptoruntereinheiten ist extrazellulär angeordnet und ist an der Ligandenbindung beteiligt (Hirai et al., 1996), während ein ähnlich großer Teil der Polypeptidkette am Carboxy-Terminus intrazellulär lokalisiert ist und für die synaptische Verankerung des Rezeptors und für zelluläre Signaltransduktionsprozesse von besonderer Bedeutung ist. Das Protein ist durch vier hydrophobe Segmente (M1-M4) in der Membran verankert, wobei die Regionen M1, M3 und M4 Transmembranregionen ausbilden und das Segment M2 eine kanalbildende "Loop"-Struktur formt (Hollmann et al., 1994). Die besondere Bedeutung der Carboxy-terminalen Region der NR2-Untereinheiten für die Funktion des NMDA-Rezeptors wurde durch die Analyse von Mäusen deutlich, die durch Geninsertion ("kock-in") veränderte NMDA-Rezeptoruntereinheiten exprimierten (Sprengel et al., 1998). Hier konnte gezeigt werden, daß NMDA-Rezeptoren mit verkürzter C-terminaler Domäne zwar funktionelle, synaptisch lokalisierte Ionenkanäle bilden, die Mutation dennoch letal für die Mäuse ist. Dies macht deutlich, daß Funktionen, die über die Rolle von Glutamatrezeptoren als Ionenkanäle hinausgehen, an diese Domänen gekoppelt sind. In den letzten Jahren sind u.a. PSD-95 (SAP 90) und weitere mit den zytoplasmatischen Domänen des NMDA-Rezeptors assoziierte Proteine identifiziert worden (Kornau et al. 1995, Kistner et al., 1993). PSD-95 gehört dabei zu einer Proteinfamilie, die durch eine Protein-Protein-Interaktionsregion, der sogenannten PDZ-Domäne gekennzeichnet ist. PSD-95 bindet spezifisch an eine Carboxy-terminale T/SXV-Sequenz der NR2-Untereinheiten, einem Sequenzmotiv, das auch in den Carboxy-Termini von Untereinheiten des "Shaker"-Kalium-Kanals und anderen membranständigen Rezeptoren identifiziert wurde. Interessanterweise bindet PSD-95 spezifisch die neuronale Form der NO-Synthase (nnos), so daß dieses Enzym über PSD-95 an einem synaptischen NMDA-Rezeptorkomplex gebunden sein könnte. NO ist ein entscheidenes Signalmolekül für die synaptische Kommunikation durch die Aktivierung von Guanylatcyclase was zur Aktivierung einer cgmp abhängigen Kinase (Kinase G) führt. Die Synthese von NO durch die Aktivierung der nnos ist spezifisch durch den Ca2+ Einstrom des NMDA-Rezeptors reguliert, nicht jedoch durch den Ca2+ Einstrom anderer Ca2+-Kanäle (Kiedrowski et al., 1992). Es muß daher eine funktionelle Kopplung des NMDA-Rezeptors mit nnos geben. Ein mögliches Modell wäre die nahe räumliche Verbindung des NMDA-Rezeptors mit nnos durch die Bindung beider Proteine durch das "Adapter"-Molekül PSD-95. Die Produktion von NO spielt außer als retrogrades Signalmolekül eine wichtige Rolle bei der durch den Rezeptor vermittelten Form des neuronalen Zelltods, wo es möglicherweise an der Aktivierung zellulärer Proteinasen wie Calpain und Caspase 3 beteiligt ist (Du et al., 1997). Da für AMPA-Rezeptoren eine aktivitätsabhängige proteolytische Abspaltung der Carboxy-terminalen Domäne durch Calpain berichtet wurde (Bi et al., 1996), ist die Regulation dieser Protease möglicherweise von genereller Bedeutung für die Glutamatrezeptor-abhängigen zellulären Regulationsprozesse. 3

4 Stand der Forschung Als weitere durch PSD-95 mit dem NMDA-Rezeptor-assoziierte Proteine wurden u.a. SynGAP und Citron identifiziert (Chen et al., 1998; Kim et al., 1998; Furuyashiki et al., 1999). SynGAP scheint phosphorylierungsabhängig kleine GTP-bindende Proteine wie z.b. Ras zu regulieren und somit eine Integration von Signaltransduktionsmechanismen ligandengesteuerter Ionenkanäle und von Wachstumsfaktoren regulierten Rezeptoren zu bewerkstelligen (Abbildung 1), während Citron eine Wechselwirkung mit der Rho Signalkaskade eingehen soll (Zhang, W. et al., 1999). Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß diese Ergebnisse auf die Existenz eines oligomeren Proteinkomplexes hinweisen, der für die Vermittlung und/oder Integration unterschiedlicher Signale bei der Differenzierung und Funktion neuronaler Zellen eine besondere Bedeutung zu haben scheint. Neben der Assoziation mit Proteinen, die direkt an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind, ist der NMDA-Rezeptor mit Proteinen des Zytoskeletts verbunden. Hier wurde zunächst?-actinin 2 als NR1-assoziiertes Protein identifiziert und gefunden, daß?-actinin 2 mit Calmodulin um die Bindungsstelle am Carboxy-Terminus der NR1-Untereinheit kompetiert (Wyszynski et al., 1997). Da die Calmodulinbindung selbst vom aktivitätsabhängigen Ca2+-Einstrom durch den Ionenkanal des NMDA-Rezeptors bestimmt wird, ist anzunehmen, daß der aktivierte Rezeptor eine verminderte Bindung an?-actinin 2 und das Actinzytoskelett aufweist. Neben der Bindung an?-actinin 2 ist in jüngster Zeit die Bindung von Spectrin an NMDA-Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen worden (Wechsler und Teichberg, 1998), die sich durch Ca2+ und Fyn-abhängige Phosphorylierung des Rezeptors vermindert. Fig. 1. Modell eines NMDA-Rezeptor assoziierten Signaltransduktionskomplexes. Erläuterungen siehe Text. In diesem Modell sind die zwei wichtigen Signaltransduktionsmoleküle nnos und syngap hervorgehoben. 4

5 Literatur Diese sollen durch das Adapter-Protein PSD-95 mit dem NMDA-Rezeptor verbunden sein, und dadurch einer Regulation durch das nach NMDA-Rezeptoraktivierung einströmende Ca2+ unterliegen. Durch Interaktion des NMDA-Rezeptors mit Tubulin und anderen Elementen des Zytoskeletts erfolgt möglicherweise eine zusätzlichen Regulation dieses Komplexes. In unserer Arbeit haben wir darüber hinaus die Interaktion des NMDA-Rezeptors mit einem Schlüsselelement des Zytoskeletts, dem Tubulin nachgewiesen. Dabei konnten wir zeigen, daß der NMDA- Rezeptor nicht mit Mikrotubuli, sondern selektiv mit depolymerisiertem Tubulin interagiert (van Rossum et al., 1999). Dieses Ergebnis ist konsistent mit dem Befund, daß die post-synaptische Dichte große Mengen an Tubulin enthält, elektronenmikoskopisch jedoch keine Mikrotubuli in Dornenfortsätzen der Dendriten nachgewiesen werden konnten, und läßt vermuten, daß die Wechselwirkung mit Tubulin eine wichtige Rolle für die Regulation synaptischer Plastizität spielen könnte. Interessanterweise wurde in verschiedenen Arbeiten der letzten Jahre für einzelne Glutamatrezeptortypen gezeigt, daß sie aktivitätsabhängig einer strukturellen Veränderung unterliegen können. Diese Rezeptormodifizierung erfolgt durch spezifische proteolytische Spaltung des Carboxy-Terminus, so daß ein membrangebundener Ionenkanal resultiert, der nicht mehr mit dem cytoplasmatischen Signaltransduktionskomplex assoziiert ist (Bi et al., 1997). Da in den letzten Jahren die proteolytische Spaltung hydrophiler Rezeptoranteile als regulativer Mechanismus für eine Vielzahl von membranständigen Rezeptoren erkannt worden ist, stellt dieses Wirkprinzip auch ein attraktives Modell für die Regulation der Interaktion des NMDA-Rezeptors mit Proteinen der postsynaptischen Dichte da. Literatur 1. Armstrong, N., Sun, Y., Chen, G.Q. und Gouaux, E. (1998) Structure of a glutamate-receptor ligand-binding core in complex with kainate. Nature 395, Bi, X., Chang, V., Molnar, E., McIlhinney, R.A.J. und Baudry, M. (1996) The C-terminal domain of glutamate receptor subunit 1 is a target for calpain-mediated proteolysis. Neurosci. 73, Bi, X., Chen, J. und Baudry, M., (1997) Developmental changes in calpain activity, GluR1 receptors and in the effect of kainic acid treatment in rat brain. Neurosci. 81, Chen, H.-H., Rojas-Sato, M., Oguni, A., und Kennedy, M.B. (1998) A synaptic ras-gtpase activating protein (p135 SynGAP) inhibited by CaM Kinase II. Neuron 20, Choi, D.W. (1988) Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1, Du, Y., Bales, K.R., Dodel, R.C., Hamilton-Byrd, E., Horn, J.W., Czilli, DL., Simmons, L.K., Ni, B. und Paul, S.M. (1997) Activation of a caspase 3-related cysteine protease is required for glutamate-mediated apoptosis of cultured cerebellar granule neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14, Hirai, H., Kirsch, J., Laube, B., Betz, H. und Kuhse, J. (1996) The glycine binding site of the N-methyl-D- aspartate receptor subunit NR1: Identification of novel determinants of co-agonist 5

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