Direct Measurement of Distances and Angles in Biomolecules by NMR in a Dilute Liquid Crystalline Medium [1]

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1 Direct Measurement of Distances and Angles in Biomolecules by NMR in a Dilute Liquid Crystalline Medium [1] Nico Tjandra, Ad Bax [1] Science 1997 (278), National Institutes of Health (NIH) Bethesda, Maryland, USA Dinh Du Tran Moderne Anwendungen der Magnetischen Resonanz Dozenten: B. Corzilius, B. Fürtig, C. Glaubitz, T. Prisner, H. Schwalbe

2 Inhalt Vorstellung des Papers Bisherige Problematik und ihre Lösungsansätze Vorstellung eines neuen Ansatzes mathematisch-theoretischer Hintergrund Vergleich des experimentellen Befunds mit Kristallstrukturdaten Diskussion und Fazit Nachfolgende Anwendungen / Outlook Vorstellung einiger Veröffentlichungen, die das Originalpaper zitieren 1

3 Die Ausgangssituation I Internukleare dipolare Kopplungen enthalten eine Vielzahl an Informationen NMR-Aufnahmen in gewöhnlichen (isotropen) Flüssigkeiten verhindern die Bestimmung (internuklearer) dipolarer Kopplungen Räumliche Orientierung der Moleküle unterliegt statistischer Gleichgewichtseinstellung Dipolare Kopplungen mitteln sich zu 0 Abstandsmessungen bisher über Kern-Overhauser-Effekt (NOE) abschätzbar Genauigkeit ist beschränkt Zeitauflösung der Konformation von Molekülen ist schwierig Bestimmung der relativen Position struktureller Elemente erschwert Löungsansatz: Moleküle mit einer Magnetischen Anisotropie 0 können sich in einem starken Magnetfeld ausrichten [2] 2

4 Die Ausgangssituation II Moleküle mit einer Magnetischen Anisotropie 0 können sich in einem starken Magnetfeld ausrichten [2] + Abstände sind fixiert Messbare dipolare Kopplungen für 15 N- 1 H und 13 C- 1 H Orientierung der Bindungsvektoren bestimmbar Messung eines kleinen Protein, komplexiert mit 16-bp DNA führt zur zweifachen Verringerung von ϕ-ψ-paaren im Ramachandran-Plot Magnetische Interaktionen in meisten Molekülen zu schwach Bestimmung der dipolaren Kopplung nur in geeigneten Systemen und mit viel Aufwand möglich 3

5 Der Lösungsansatz Induzierung der Ausrichtung der Biomoleküle im Magnetfeld: Flüssigkristalle (LC) Bisher (1997) bereits für Orientierungsmessungen von Flüssigkeiten genutzt NMR-Spektrum von Molekülen mit einer Protonenanzahl im zweistelligem Bereich sind jedoch zu schwer auszuwerten Konzentration zu hoch? Einsatz von Komponenten, die LC-Felder erzeugen: Autoren setzten eine (1:2,9)-Mischung aus 1,2-Dihexanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC) ein, die in wässriger Lösung ( 3-% w/v) bei 298 K zur LC-Phase wechselt (bicelle) DHPC DMPC Abb. 1: Lewisstrichformel der LC-Komponenten 4

6 Folie-Overheadprojektor - Bicellen Quelle: M. Levitt Spin Dynamics 2nd Ed. John Wiley & Sons

7 Theoretischer Hintergrund I Vorteile der verdünnten LC-Phase ( 3-% w/v) Abstand zwischen LC-Molekülen ist deutlich größer als die zu untersuchenden Makromoleküle durch NMR Moleküle können in wässriger Lösungs frei diffundieren 15 N-T 2 -Rate bei der Untersuchung von Ubiquitin (76 AS/8,6 kda) ändert sich kaum Rotations-Diffusion geschieht mit selber Rate D PQ φ, θ = S µ 0 4π γ Pγ Q h A a 3 cos 2 θ A r sin 2 θ cos 2φ /4π 2 3 r PQ A: Ausrichtungstensor, zerlegbar in A a : axial symmetrische Komponente A r : rhomboedrische Komponente S : allg. Ordnungsparameter für interne Bewegung von PQ [4] µ : magnetische Permeabilität des Vakuums γ gyromagnetisches Verhältnis φ, θ: zylindrische Koordinaten, die die Orientierung von PQ zu A beschreiben r PQ : Abstand zwischen PQ 6

8 Theoretischer Hintergrund II D PQ φ, θ = S µ 0 4π γ Pγ Q h A a 3 cos 2 θ A r sin 2 θ cos 2φ /4π 2 3 r PQ Ausrichtungstensor A aus gemessenen dipolaren Kopplungen bestimmbar Hängt von Bicellen-Konzentration ab Bei unbekannter Struktur wird A a aus dem Bereich gemessener Kopplungen abgeschätzt, A r lässt sich schrittweise iterativ bestimmen S bestimmbar aus Relaxations-Experimenten Bei geringen Werten für A (~10-3 ) werden nur Aufspaltungen dipolarer Kopplungen im Spektrum sichtbar Bei Vorhandensein skalarer Kopplung setzt sich die beobachtete Aufspaltung aus der Summe J PQ + D PQ zusammen 7

9 Überprüfung der Ergebnisse I Vergleich dipolarer Kopplungen von Ubiquitin zwischen Messungen in LC und Kristallstruktur Gleicher Ordnungsparameter S Berechneter Ausrichtungsparameter A a ist im Einklang mit dem Rotations-Diffusions- Tensor Ausrichtung des Proteins nach Lösungsmittel Hinzufügen von Protonen an Kristallstruktur durch ein Programm führt zur Abweichung! Abweichungen liegen im Rahmen der Messunsicherheit (~0,5-1 Hz) Abb. 2: gemessene und aus Kristallstruktur entnommene dipolare Kopplungen 8

10 Überprüfung der Ergebnisse II Dipolare Kopplungen sind über mehrere Bindungen messbar (E51 Y59) Bei schwacher, skalarer Kopplung ist nur die Größe von D PQ bestimmbar, das Vorzeichen muss anders ermittelt werden [5] Intensität des Signals ist proportional zur Interaktion Skalare und dipolare Kopplung können sich aufheben (L50H N H α ) (roter Kreis) Abb. 3: Ausschnitte aus dem NMR-Spektrum von Ubiquitin D: Kreuzsignal von H N mit anderen Protonen 9

11 Überprüfung der Ergebnisse II Abb. 3: Ausschnitte aus dem NMR-Spektrum von Ubiquitin D: Kreuzsignal von H N mit anderen Protonen Abb. 4: Ausschnitt der Kristallstruktur von Ubiquitin dunkelblau: Rückgrat-Amidprotonen Magenta: Protonen von weiter entfernten AS, die mit dem Rückgrat wechselwirken 10

12 Fazit Ausrichtung des Proteins hängt von Form des LC-Mediums ab Abweichung von isotroper Rotations-Diffusion ist gering Messung dipolarer Kopplungen erfordert weniger Probe als Detektion schwacher NOEs Strukturrechnungen aus erhaltenen NMR-Daten führen zu besserem Ergebnis, da einzigartige long-range Informationen vorhanden Nach Zugabe der LC-erzeugenden Lipide nur minimale Veränderung der chemischen Verschiebung Keine stabilen, direkten Wechselwirkungen zwischen Lipid und Makromolekül Anwendbar auf alle Makromoleküle, ohne Einschränkung auf Masse 11

13 Outlook Paper wurde seit Veröffentlichungsdatum (1997 ) > 1100 mal zitiert Modeling helical proteins using residual dipolar couplings ( ) Eggimann et al., Theor. Chem. Acc (132), 1388 Three-Dimensional Structure and Interaction Studies of Hepatitis C Virus p7 ( ) Cook et al., Biochemistry 2013 (52), 5295 The present and future of solution NMR in investigating the structure and dynamics of channels and transporters Oxenoid et al., Curr Opin Struct Biol 2013 (23), 347 Mapping protein-protein interactions in solution by NMR Spectroscopy E. Zuiderweg, Biochemistry 2002 (41), 1 12

14 Literatur [1] N. Tjandra, A. Bax, Science 1997 (278), [2] J. R. Tolman, J. M. Flanagan, M. A. Kennedy, J. H. Prestegard, PNAS 1995 (92), [3] Bildquelle: Avanti Polar Lipids, Inc. ( &Itemid=197); letzter Zugriff: :03 [4] N. Tjandra, J. G. Omichinski, A. M. Gronenborn, G. M. Clore, A. Bax, Nature Struct. Biol (4), 732 [5] C. Griesinger, O. W. Sorensen, R. R. Ernst, J. Chem. Phys (85), 6837 [6] M. Levitt: Spin Dynamics 2nd Ed., John Wiley & Sons Ltd