Diagnostik der angeborenen Hämoglobinopathien
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- Ida Holtzer
- vor 8 Jahren
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1 Diagnostik der angeborenen Hämoglobinopathien mit Massenspektrometrie Mag. Ostermann Katharina Medical University of Vienna Department of Pediatrics and Adolescent Medicine Research Core Unit Pediatric Biochemistry and Analytics Währinger Gürtel Vienna, Vienna, Austria.
2 Hämoglobinopathien Erkrankungen die durch Störung des Hämoglobins (roter Blutfarbstoff in den roten Blutkörperchen) verursacht werden. Je nach Gendefekt können sie unterschiedlich schwere Krankheitsbilder verursachen. Weltweit werden jährlich ca Kinder mit einer schweren angeborenen Form der Hämoglobinopathie geboren. Entstehung durch Mutationen, die die Aminosäuresequenz der α- und β- Globinketten des Hämoglobins (Hb) verändern. Kommt es durch die Mutation zu struktureller Veränderung des Hämoglobinmoleküls entsteht ein anormales Hb.
3 Screening der Hämoglobinopathien Elektrophorese Identifizierung wichtiger Hb Varianten: Hb S, C, D-Punjab, E, O-Arab, Lepore High-performance liquid chromatography (HPLC) Automatisierte Analyse mit geringen Mengen an Blut DNA-Analysen Zweifelsfreie Identifizierung; hohe Kosten! Massenspektrometrie Enzymatisch verdaute Globinketten (Trypsin)
4 Massenspektrometrie (MS) MS Grundlagen MS in der Hb-Diagnostik In der MS muss ionisiert werden nur geladene Teilchen werden detektiert. Die Ionen in der Gasphase werden nach ihrem Masse- zu Ladungs- Verhältnis (m/z) aufgetrennt. Zur Bestimmung des Molekulargewichts um Aminosäuremodifikationen zu erkennen. Die meisten Hb-Varianten resultieren aus einer einzigen Aminosäure Substitution (z.b. Sichelzellenanämie). Vorteil: Aminosäuresequenzen genetischer Mutationen für die spezifischen Varianten sind bereits charakterisiert. Therapien sind effektiver wenn sie speziell auf die Proteinexpression eines Patienten abgestimmt sind.
5 Tandem Massenspektrometrie (MS/MS) Revolutionierung des Newborn Screenings viel mehr Krankheiten konnten erfasst werden. Ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Biomarker Detektion von Aminoacidopathien, Organoacidopathien, Fettsäureoxidationsstörungen, Harnstoffzyklusdefekte, Peptidion wird selektiert gefolgt von einem Fragmentierungsprozess in einer Koallisionszelle und schließlich die Analyse der entstandenen Fragmentionen.
6 MS für die Hb-Diagnostik ESI- Elektrospray Ionisation MALDI- Matrix-Assisted Laser Desorbtion Ionisation Sanfte Ionisierungsmethoden wenige Fragmentionen! MALDI-Orbitrap
7 Matrix-Assisted Laser Desorbtion/Ionisation
8 Beispiele für MALDI-Matrizen
9 Vorteile MALDI Einfache Probenvorbereitung für Routineanalyse von Proteinen und Peptiden. Schnelle Durchführung. Einfache Spektren (fast ausschließlich einfach geladene Ionen). Hohe Sensitivität. Weniger Rauschen durch Kontaminationen.
10 Ionen Detektor: Orbitrap
11 Orbitrap-Prinzip: Fourier-Transformation MS Ionen werden in die Orbitrap injiziert und elektrostatisch gefangen (trapped), während sie um die Zentralelektrode kreisen (Kreisbahnen=Orbits) und axiale Oszillationen ausführen. Die oszillierenden Ionen induzieren Ströme (image currents) in den 2 äußeren Teilen der Orbitrap die mit einem Differenzverstärker (differential amplifier) detektiert werden. Schwingungen werden über Fourier Transformation von der Zeit in die Frequenzdomäne konvertiert (FT- MS). Jede Frequenz kann einer spezifischen m/z-rate zugeordnet werden und schließlich erhält man ein Spektrum.
12 Ionen Trajektorien in der Orbitrap
13 L-Acetylcarnitine (m/z ) AS_Carnitine_MIX_G3 #1-21 RT: AV: 21 NL: 1.06E6 T: FTMS + p MALDI Full ms [ ] m/z
14 3 informative Peptide für Hb-Varianten Target peptide ion Wild-type T Hämoglobin S Glu Val Target fragment ion (MS/MS) WT-T1 AA-Sequenz 1 Valine 2 Histidine Hämoglobin C Glu Lys 3 Leucine Wild-type T Hämoglobin D Punjab Hämoglobin O Arab Wild-type T Hämoglobin E Threonine 5 Proline 6 Glutamic Acid 7 Glutamic Acid 8 Lysine Rapid and specific detection of clinically significant haemoglobinopathies using electrospray mass spectrometry mass spectrometry Yvonne A. Daniel 1 et al.
15 Target peptide ion; Matrix: Super-DHB Hb_1_B4 #2-11 RT: AV: 10 NL: 2.23E5 T: FTMS + p MALDI Full ms [ ] WT-T1 Target peptide ion Target fragment ion Wild-type T Hämoglobin S Hämoglobin C Wild-type T Hämoglobin D Punjab Hämoglobin O Arab Wild-type T Hämoglobin E WT-T WT-T m/z
16 Target fragment ion (MS/MS): Precursor mass 952 Target peptin ion Wild-type T Hämoglobin S Target fragment ion y4
17 Identifizierung eines Patienten mit Hämoglobin C Hb001_1_LE35_ _B6 #1-10 RT: AV: 10 NL: 5.14E3 T: FTMS + p MALDI Full ms [ ] Wild-type T Hämoglobin C Target peptide ion m/z
18 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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