Stand der molekularen Resistenzbestimmung - sind die Methoden schon routinetauglich?

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1 Stand der molekularen Resistenzbestimmung - sind die Methoden schon routinetauglich? Peter Heisig Pharmazeutische Biologie und Mikrobiologie Universität Hamburg PH2008, UniHH 1

2 Vor- und Nachteile genetischer Resistenzbestimmung schneller Befund kombinierte Mechanismen erfassbar epidemiologisch verwertbare Aussage eventuell parallele Speciesidentifizierung unabhängig von der Kultivierbarkeit eines Erregers einsetzbar Nachweis neuartiger Mechanismen nicht gesichert Korrelation Phäno- Genotyp nicht vorhersagbar geringe Datenbasis Höhere Kosten PH2008, UniHH 2

3 Einsatzmöglichkeiten für molekulargenetische Methoden zur Resistenzbestimmung Bei langsam wachsenden oder nicht kultivierbaren Erregern M. tuberculosis Bei variabel exprimiertem Resistenzphänotyp meca, blaz, vana Bei lebensbedrohlichen Infektionen Sepsis Bei molekularepidemiologischen Fragestellungen ESBL-Subtyp PH2008, UniHH 3

4 Was muss detektiert werden? Veränderung in vorhandener genetischer Information DNA: Punktmutation, Deletion, Rekombination, Insertion RNA: Veränderte Quantität Aufnahme neuer genetischer Information DNA: Plasmid, Genfragment, Rekombination, Insertion Induktionsphänomene ohne genetische Veränderung RNA: Veränderte Quantität PH2008, UniHH 4

5 Welche genetischen Veränderungen sind mit welcher Technik nachweisbar? Genetisches Ereignis Nachweismethode (Beispiele) Neue DNA - PCR mit spezifischen Primern RT-PCR (Taqman, Light-Cycler) Denaturierende HPLC-Detektion Massenspektrometrie Punktmutationen in residenter DNA Sequenzhomologie - Gewinnung von spez. Template DNA wenige Hotspots - SNP-Nachweistechniken, Pyrosequencing breite Distribution - Multiplex-PCR, Array-Techniken DNA-Sequenzierung erhöhte Expression - mrna-quantifizierungstechniken Array-Techniken PH2008, UniHH 5

6 Umfrage zur Nutzung von molekularen Methoden zur Resistenzbestimmung in der Klinik PH2008, UniHH 6

7 Auswertung der Fragebögen insgesamt Fragebögen versandt an Leiter von 36 Medizinisch-Mikrobiologischen Institutionen an Universitätsklinika davon ausgefüllte Bögen zurückgeschickt binnen 3 Wochen 12 Fragebögen (33%) (Berlin, Bochum, Düsseldorf, Frankfurt, Hamburg, Hannover, Kiel, Lübeck, Mainz, Regensburg, Rostock, Tübingen) Herzlichen Dank für die Teilnahme! davon wenden molekulare Methoden an: 10 nicht an: 2 PH2008, UniHH 7

8 Gründe gegen die Anwendung molekularer Methoden zu hoher Aufwand an Kosten Personal Organisation Korrelation: Gennachweis und Expression? geringe Aussagekraft verglichen mit Antibiogramm PH2008, UniHH 8

9 Wünsche der Nicht-Anwender für die Zukunft multiresistente Erreger Mykobakterien PH2008, UniHH 9

10 Gründe für die Anwendung molekularer Methoden 1. Schnelligkeit Nachweis aus Originalmaterial 2. Sensitivität klare Ja/Nein Antwort anstelle von MHK-Grenzwerten 3. Bestätigungstest Absicherung unklarer konventioneller Befunde (scv, BORSA) 4. Mehrfachaussage Gleichzeitige Erregeridentifizierung Epidemiologische Daten 5. Hygienische Isolation bei VRE, MRSA Konsequenzen PH2008, UniHH 10

11 Was wird nachgewiesen? Erreger Resistenz Gen Methode (n) S. aureus β-lactam meca PCR (Kultur)** 8 PCR (direkt)* 1 orfx PCR (direkt)* 1 blaz PCR (Kultur) 1 Macrolid erma,b,c PCR (Kultur) 1 Enterococcus Glycopeptid vana,b,c PCR (Kultur)* 4 A.baumannii β-lactam bla-oxa 23,24,58 PCR (Kultur) 1 Enterob. β-lactam bla-tem, -SHV PCR (Kultur)* 3 bla-ctx-m cluster PCR (Kultur)* 3 ampc PCR (Kultur) 1 bla-kpc PCR (Kultur) 1 Chinolon qnra,b,s PCR (Kultur) 1 qepa, aac6 -Ib-cr PCR (Kultur) 1 M.tuberculosis Rifampicin rpob PCR (Kultur)* 3 * Routineanwendung PH2008, UniHH 11

12 Welche Methoden werden eingesetzt und in welchem Umfang? PCR konventionell oder quantitative real-time (Light Cycler ) für meca, blaz, orfx, vana,b,c, erma,b,c, bla OXA,bla TEM, bla SHV,bla CTX-M,bla KPC, qnra,b,s, qepa, aac6 -Ib-cr, rpob meca: inhouse 8, kommerziell 1 (HAIN) rpob: inhouse 1, kommerziell 2 (HAIN) DNA-Sequenzanalyse für bla-esbl, bla AMPC meca-nachweis: von 10 bis zu 600/Monat vana,b,c-nachweis: ca. 5/Monat bla-esbl-sequenzierung: von 1 bis zu 20/Monat PH2008, UniHH 12

13 Wie hoch ist der Aufwand? Aufwand für PCR: Geräte: Thermocycler / RT-PCR (Light-Cycler ), Zentrifuge, Gelelektrophorese-Apparatur, Videodokumentation Räume: Zeit: Personal: mindestens 1 bis zu 4 Räume (z.t. Leasing) zwischen 2 und 6 hrs. (meca, orfx) 0,1 bis 1 Stelle (Biologe) bzw. Abteilung PH2008, UniHH 13

14 Welche Konsequenzen hat der genetische Nachweis für die Therapie meca, orfx negativ: Aufheben der Isolation blaz, meca negativ: Penicillin-Therapie möglich meca positiv: Therapie generell, Hygiene bla-esbl positiv: Therapie generell rpob positiv: Therapie generell PH2008, UniHH 14

15 Wünsche der Anwender für die Zukunft ESBL 7 MBL 3 H. pylori (diverse Res.mech.) 2 Carbapenemasen 2 VISA 1 bla- AMPC 1 M. tubeculosis (diverse Res.mech.) 1 PH2008, UniHH 15

16 Zusammenfassung Molekulargenetische Methoden zur Resistenzbestimmung werden bereits routinemäßig eingesetzt. Gut etabliert sind Nachweise von MRSA (meca, orfx, nuc) sowie von VRE (vana,b, C) und rif R M. tuberculosis (rpob) Verwendung finden überwiegend inhouse-methoden. Vorteile sind Schnelligkeit und Spezifität. (direkte Konsequenzen für Therapie und Hygiene) Zukünftige Anwendungsbereiche sind Nachweise von Punktmutationen (ESBL-Typ, Targetmutationen) Kombinationen von Resistenzen H. pyl., M. tb. PH2008, UniHH 16

17 Offene Fragestellungen Vergleichbarkeit der inhouse-methoden? Kosten? Referenzstämme, Kontrollen? PH2008, UniHH 17

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