UV-Spektroskopie 2. Theorie

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1 UV-Spektroskopie 2 Theorie In der pharmazeutischen Analytik wird die UV/Vis-Spektroskopie verwendet, um Arzneistoffe zu identifizieren. Dabei eignet sie sich zur Reinheitsüberprüfung und quantitativen Bestimmung sowie zur Strukturaufklärung von Inhalts- und Wirkstoffen. Das Prinzip der UV/Vis-Spektroskopie beruht auf der Anregung von Elektronen von einem energetisch niedrigeren zu einem energetisch höheren Zustand. Die benötigte Energie wird dabei aus Licht der sichtbaren (Vis) oder ultravioletten (UV) Frequenz genommen. UV-Licht lässt sich primär in drei Bereiche einteilen: langwellig ( nm), mittelwellig ( nm) und kurzwellig ( nm). Im Bereich von 100 bis 200 nm findet man auch Vakuum-UV-Strahlung. Diese wird in einer Hochvakuumröhre erzeugt. UV/Vis-Strahlung ermöglicht es, Valenzelektronen aus energetisch ärmeren in energetisch reichere Zustände anzuregen. Kernnahe Elektronen können dabei nicht angeregt werden, da die Strahlung nicht stark genug ist um die gegenseitige Elektronen-Anziehung zu überwinden. Gemäß der Orbitaltheorie befinden sich Elektronen stets auf einem bestimmten energetischen Niveau - sogenannten Molekülorbitalen. Diese Orbitale sind gequantelt, was bedeutet, dass es keinen stetigen energetischen Übergang gibt, sondern diskrete Energiewerte, die die Differenzen zweier (oder mehrerer) Zustände darstellen. Nur wenn diese Energiedifferenz durch zugeführte Energie auf einmal überwunden werden kann, vollzieht sich der Übergang eines Elektrons auf ein höheres Niveau. Die UV/Vis-Strahlung regt hierbei π- und n-elektronen an, sodass σ σ*, π π*, n σ* und n π* Übergänge ermöglicht werden, allerdings kann man n σ* nur selten beobachten (s. Abb. T1). σ- und π- Orbitale sind bindende Orbitale, n-orbitale nichtbindende Orbitale sowie σ*- und π*-orbitale antibindende Orbitale (s. Abb. T2). Nichtbindende Orbitale stehen energetisch höher als bindende und antibindende wiederum höher als nichtbindende. Der Elektronenübergang vollzieht sich immer vom höchsten besetzten Molekülorbital (highest occupied molecular orbital: HOMO) zum niedrigsten unbesetzten Molekülorbital (lowest unoccupied molecular orbital: LUMO) (s.abb. T3). Dieser Übergang weist im Molekülorbitalschema die niedrigste Differenz auf. Abbildung T1: Übersicht möglicher Anregungen durch UV/Vis-Strahlung. Oben ist logarithmisch die Wellenlänge des Lichts aufgetragen.

2 Abbildung T2: Orbitaldarstellung von Ethen. Zu erkennen sind die σ-bindungen zwischen den Kohlenstoffatomen selbst und ihnen mit den Wasserstoffatomen. Die zweite Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen ist eine π-bindung,, die aus zwei sich überlappenden sp 2 -Orbitalen besteht. Abbildung T3: Bindende (links) und antibindende (rechts) π-bindung. Beim bindenden Molekülorbital liegen sich Orbitale mit gleichem Vorzeichen (positiv gemäß Konvention schraffiert), beim antibindenden mit ungleichem Vorzeichen jeweils gegenüber. Wenn ein Teil eines Moleküls UV/Vis-Strahlung absorbiert, so spricht man von einem Chromophor. Ein Chromophor besteht aus mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen (vgl. Buta-1,3-dien) oder einem Heteroatom mit freien Elektronenpaaren (z.b. Stickstoff oder Schwefel), die mit einem mesomeren System in Wechselwirkung treten können. Aromaten und annellierte Aromaten sind also sehr gute Chromophore. Hierbei gilt: Je größer das mesomere System, desto höher die Wellenlänge des Absorptionsmaximums. Dies beruht darauf, dass bei einem ausgeprägteren π-elektronensystem die Differenz zwischen HOMO und LUMO kleiner und somit weniger Energie (= größere Wellenlänge) zur Anregung benötigt wird. Bei bunten Flüssigkeiten liegt so oftmals ein großes mesomeres System vor, dessen Absorption im sichtbaren Bereich ( nm) liegt. Man beobachtet dann n die Komplementärfarbe des absorbierten Lichts, eine gelb-orange erscheinende Lösung (z.b. Azobenzol) absorbiert blaues Licht ( nm). Neben Chromophoren gibt es auch auxochrome Gruppen.. Dies sind funktionelle Gruppen, die selbst nicht absorbieren, aber mit dem Chromophor durch mesomere Effekte (z.b. -NO 2, -SO 2 R) in Wechselwirkung treten, was sich auf die Wellenlänge der Absorption auswirkt. Wird die Absorptionswellenlänge durch Ausweitung des mesomeren Systems erhöht, spricht man von bathochromem Shift,, bei Verringerung durch Dämmung des mesomeren Systems (z.b. Protonierung, vgl. Phenolphthalein) von hypsochromem Shift. Wird die Absorption gesteigert ohne Veränderung der Wellenlänge, so handelt es sich um einen hyperchromen Shift,, während die Verringerung rung der Absorption bei gleichbleibender Wellenlänge einen hypochromen Shift darstellt. Die letzten beiden Fälle wirken sich den Extinktionskoeffizienten ε aus. Gemäß dem Lambert-Beer'schen Gesetz ist die Absorption A abhängig von und proportional zu der

3 Konzentration c der Substanz in Lösung und der Dicke d der verwendeten Küvette. Als Proportionalitätsfaktor dient der erwähnte Extinktionskoeffizient, der abhängig ist von der Temperatur, der Anregungswellenlänge und der Substanz. Die Absorption kann auch formuliert werden als negativer dekadischer Logarithmus der Transmission, welche der Quotient aus durchgelassener und ausgesandter Strahlungsintensität ist: A = -lg(t) = -lg(i/i 0 ) = ε c d, wobei A: Absorption, T: Transmission, I: Intensität durchgelassener Strahlung [W m -2 ], I 0 : Intensität ausgesandter Strahlung [W m -2 ], ε: molarer Extinktionskoeffizient [l mol -1 cm -1 ], c: Konzentration [mol l -1 ], d: Küvettendicke [cm]. Beim Anwenden des Lambert-Beer'schen Gesetzes ist es zu beachten, dass die Absorption zwischen 0.3 und 1.0 liegen muss, ansonsten können Störsignale ("Rauschen") aufgrund des asymptotischen Verlaufs der Kurve die Messung komplett verfälschen. Um den molaren Extinktionskoeffizienten zu erhalten, wird eine 1 M Lösung in einer 1 cm dicken Küvette vermessen, für den spezifischen Extinktionskoeffizienten wird in einer 1 cm dicken Küvette eine 1% (m/m) Lösung verwendet. Diese hat den Vorteil der einfachen Herstellbarkeit und Reproduzierbarkeit. Die Zustände der Elektronen lassen sich prinzipiell unterscheiden in Singulett- und Triplettzustand. Mathematisch betrachtet lässt sich der Zustand berechnen durch Multiplizität = 2n + 1, wobei n: Anzahl ungepaarter Elektronen. Dies sei kurz am Sauerstoffmolekül O 2 erläutert. Geht man vom Sauerstoffmolekül in der Lewis- Schreibweise aus, so zeichnet man eine O=O-Doppelbindung und an jedes Sauerstoffatom noch zwei freie Elektronenpaare. Sowohl die Einzel- als auch die Nettoladung beträgt 0. Ferner gibt es kein ungepaartes Elektron; es handelt sich nach = 1 um einen Singulettzustand. Trennt man nun eines der beiden bindenden Elektronenpaare, sodass ähnlich einem Radikal an dieser Stelle kein Elektronenpaar mehr vorliegt, sondern an jedem Sauerstoffatom ein einzelnes Elektron, beträgt sowohl die Einzel- als auch die Nettoladung immernoch 0. Nun aber liegen zwei ungepaarte Elektronen vor und nach = 3 handelt es sich um einen Triplettzustand. (Dies ist eine sehr starke Vereinfachung; Abb. T4 verdeutlicht diesen Sachverhalt durch das Molekülorbitalschema besser.) Die quantenmechanischen Unterschiede von Singulett- und Triplettzustand beruhren darauf, dass im Singulettzustand die Elektronenspins eines doppelt besetzten Orbitals entgegen gerichtet sind, während sie

4 beim Triplettzustand in die gleiche Richtung weisen (s. Abb T4). Das Molekül im Singulettzustand hat keinen Spinmoment und es ist diamagnetisch, während das Molekül im Triplettzustand paramagnetisch ist (vgl. Magnetismus von flüssigem Sauerstoff). Abbildung T4: Molekülorbitalschema von Sauerstoff (O 2 ). Die Elektronen im π*-niveau weisen den gleichen Spin auf. Der Grundzustand eines jeden anregbaren Elektrons wird als S 0 bezeichnet. Energetisch höhere Zustände werden ohne Spinumkehr als S 1, S 2 usw. bezeichnet, mit Spinumkehr zum Triplettzustand als T 1, T 2 usw. Da es keinen Triplett-Grundzustand gibt, existiert auch kein T 0 -Zustand. Innerhalb eines Zustandes kann man unterscheiden zwischen Schwingungsniveaus (ν = 0, 1, 2, 3...) und Rotationsniveaus (r = 0, 1, 2, 3...). Diese Unterteilung ist der Grund dafür, dass im Spektrum später und auch beispielswiese bei der IR-Spektroskopikeine einzelnen Punkte, sondern ganze Banden erzeugt werden. Zur graphischen Darstellung dient das Jablonski-Termschema (Abb. T5):

5 Abbildung T5: Jablonski-Termschema. Wird ein Elektron nun aus seinem S 0 -Zustand in einen höheren Singulettzustand angeregt und fällt wieder in den Grundzustand zurück, so kann die zuvor absorbierte Energie auf unterschiedliche Art und Weise emittiert werden. Wird die Energie komplett in Form von Strahlung freigesetzt, spricht man von Emission. Eine weitere Form der Energieabgabe ist Wärme. Wird ein Teil der aufgenommenen Energie in Form von Wärme, ein anderer in Form von Strahlung freigesetzt, so entspricht die Wellenlänge des emittierten Lichtes nicht mehr der des absorbierten, da die Energiebilanz aufgrund des Energieerhaltungssatzes 0 betragen muss. Dies ist der Fall, wenn Energie nach einer Schwingungsrelaxation emittiert wird; man spricht von Fluoreszenz. Der Name der Fluoreszenz ist auf das Mineral Flussspat zurückzuführen (CaF 2 ), dessen Zwillingskristalle unter UV-Licht fluoreszieren. Durch "Intersystem Crossing" kann es zur verbotenen Spinumkehr eines Elektrons kommen. Dieser Übergang heißt verboten, da er sich statistisch sehr viel weniger ereignet als Übergänge der Emission oder Fluoreszenz, die ohne Spinumkehr ablaufen. Die Anregung vom S 0 - in den T 1 -Zustand verläuft meist über Anregung von S 0 nach S 2, worauf eine innere Umwandlung ("strahlungslose Desaktivierung") zurück zu S 1 und letztendlich die Interkombination von S 1 nach T 1 folgt. Hierbei verändert sich das Schwingungsniveau von z.b. ν = 1 bei S 2 zu ν = 0 bei S 1 zu einer erneuten Anregung zu ν = 1 bei T 1. Hier kann nun entweder einer weiter Anregung zu T 2 oder höher durch Absorption statt finden oder eine erneute Spinumkehr zurück in den S 0 -Zustand. Dies wird als Phosphoreszenz bezeichnet. Im Gegensatz zur Fluoreszenz setzt diese erst nach mehreren Minuten ein und kann bis zu mehreren Stunden anhalten, da die Spinumkehr ja verboten ist. Dies macht man sich bei Notausgangschildern oder Kinderzimmerschmuck zu Nutzen. Der Begriff der Phosphoreszenz stammt vom weißen Phosphor, dessen Chemolumineszenz bei der Umsetzung mit Sauerstoff falsch gedeutet wurde, schließlich handelt es sich bei den physikalischen Grundlagen der

6 Phosphoreszenz nicht um eine chemische Reaktion. Die Intensität der Fluoreszenz einer Lösung zu einer gegebenen Konzentration und Wellenlänge kann mathematisch ausgedrückt werden als I(λ) = ε I 0 Q c, wobei ε: Extinktionskoeffizient der entsprechenden Wellenlänge, I 0 : Intensität des Anregungslichtes, Q: Quantenausbeute der Fluoreszenz, c: Konzentration der Lösung. Die in diesem Versuch untersuchte Substanz ist eine Fluoresceinisothiocyanatlösung (FITC). Die Anregungswellenlänge von FITC beträgt etwa 495 nm, die Emissionswellenlänge etwa 521 nm. FITC ist durch die -N=C=S-Einheit reaktiver gegenüber Aminogruppen wie z.b. terminalen Aminogruppen in Proteinen. In der Zellbiologie wird FITC verwendet, um Aminoglobuline zu markieren, um bestimmte Reaktionen nachzuvollziehen. Eine weitere zu untersuchende Substanz ist das im ersten Versuch selbst synthetisierte farbstoffgekoppelte Tetrapetidamid FITC-Trp-Met-Asp-Phe-NH 2. Durchführung Zu Beginn werden aus dem erhaltenen Fluoresceinisothiocyanat in Eppendorfgefäßen drei Lösungen hergestellt, zu je 1.8 mg Farbstoff in 1 ml Ethanol 96%. Aus diesen Farbstofflösungen werden nun die drei Stammlösungen hergestellt, die sich jeweils in ihrem ph-wert unterscheiden. Die verwendeten Reagenzien nach ihrer Art und Menge sind in Tabelle D1 wiedergegeben. Tabelle D1: Art und Menge der verwendeten Reagenzien zur Herstellung der alkalischen, neutralen und sauren Stammlösung. ph alkalisch neutral sauer Reagenzien 10 µl Fluoresceinisothiocyanat-Lösung 10 µl Natronlauge 0,1 M 980 µl Ethanol 10 µl Fluoresceinisothiocyanat-Lösung 10 µl Ammoniumacetat 0,1 M 980 µl Ethanol 10 µl Fluoresceinisothiocyanat-Lösung 10 µl Salzsäure 0,1 M 980 µl Ethanol

7 Desweiteren werden Verdünnungen der Stammlösungen hergestellt, indem z.b. 50 µl der Stammlösung mit 950 µl Ethanol vermischt werden. Aufnahme der Absorptionsspektren im Absorptions-Spektrometer Das Spektrometer, welches bereits bei dem Versuch UV/Vis I verwendet wurde, sowie der Computer und der Drucker werden eingeschaltet. Anschließend wird die Jasco "Spectra Manager" Software geöffnet und ein Doppelklick auf "Spectra Measurement" ausgeführt, wodurch das Messprogramm gestartet wird. Nun werden durch Anklicken der Messparameter die folgenden Einstellungen vorgenommen: "General" photometric mode - Abs Response- Medium Scan speed nm/min Start nm End nm Data pitch - 0,2 nm Cycle times - 1 "Control" Correction - Baseline Light source nm "Information" Sample name -... Display the [Comment] dialog before measurement "Data" Auto save Save in E:\D Send data to Spectra Analysis Um das Spektrometer zu kalibrieren, wird eine saubere Küvette (also ohne Fingerabdrücke) mit 80 µl Ethanol 96% befüllt und verschlossen, in den Strahlengang gestellt (s. Abb. D1), das Gerät verschlossen und "B" (für baseline) gedrückt. Anschließend wird die Küvette mit der alkalischen Probe befüllt und vermessen, indem "S" (für sample) gedrückt wird. Nun wird in der Auswahl "Spectra Analysis" geöffnet, "Processing", "Peak Processing", "Peak find", "Apply", und "OK" ausgewählt. Das Spektrum kann nun mit den erforderlichen Daten ausgedruckt werden. Die Referenz-Küvette wird zwischen den einzelnen Messungen genutzt, um das Gerät erneut zu kalibrieren. Sie muss nicht gespült werden. Die Proben-Küvette wird mit Ethanol ausgespült und mit Druckluft getrocknet, bevor die Messungen für die neutrale und saure Stammlösung und die Verdünnungen wiederholt werden. Es werden so lange verschiedene Verdünnungen hergestellt, bis sich die Absorption zwischen 0.1 und 1.0 befindet, da nur in diesem Bereich das Lambert- Beer'sche-Gesetz gilt. Ist die geeignete Verdünnung gefunden, wird die Absorptionswellenlänge bestimmt und als Anregungswellenlänge für das Emissionsspektrum genutzt. Die verwendeten Verdünnungen werden nicht verworfen, da sie für die Fluoreszenz-Messung erneut benötigt werden.

8 Abbildung D1: Küvette im Strahlengang des Absorptions-Spektrometers. Aufnahme der Emissionspektren im Fluoreszenz-Spektrometer Für den zweiten Teil des Versuchs werden das Fluoreszenz-Spektrometer (s. Abb. D2) und der zugehörige Computer eingeschaltet. Auch hier wird die "Spectra Manager" Software gestartet und die gleichen Parameter wie bei der vorhergehenden Messung eingestellt. Allerdings wird der Modus auf "emission" eingestellt und die Anregungswellenlänge entspricht der zuvor ermittelten maximalen Absorptionswellenlänge. Der Wellenlängenbereich beginnt bei der maximalen Absorptionswellenlänge zuzüglich 10 nm. Nun werden 80 µl der geeigneten Verdünnungen aus der ersten Messung in die Küvette eingefüllt und in den Strahlengang gestellt. Hierbei muss darauf geachtet werden, dass der Strahlengang die Küvette ungehindert passieren kann. Nachdem "Autozero" angeklickt wurde, wird die Messung gestartet. Da das Fluoreszenz Spektrometer noch empfindlicher ist als das Absorptions-Spektrometer, ist es eventuell erforderlich eine weitere Verdünnung herzustellen. Abbildung D2: Fluoreszenz-Spektrometer mit der Küvettenhalterung (mitte) und Computer. Aufnahme der Anregungsspektren im Fluoreszenz-Spektrometer Der Messmodus wird auf "excitation" eingestellt und die maximale Wellenlänge des Emissionsspektrums entspricht der Anregungswellenlänge. Der Messbereich startet bei 250 nm und endet bei der zuvor ermittelten Emissionswellenlänge abzüglich 10 nm. Es werden jeweils 80 µl der verschiedenen Verdünnungen (Wellenlänge immer neu einstellen) gemessen. Aufnahme eines Emissions- und eines Anregungsspektrums des Tetrapeptid-Amids Zuletzt wird eine alkalische Lösung des Tetrapeptid-Amids hergestellt, indem 10 µl der Amidlösung mit 10 µl Natronlauge 0,1 M und 980 µl Ethanol in einem Eppendorfgefäß gemixt werden. Von dieser Stammlösung wird erneut eine geeignete Verdünnung hergestellt und ein Emissions-, sowie ein Anregungsspektrum aufgenommen.

9 Gerätebeschreibung Absorptions-Spektrometer Zur Messung der Absorptionsspektren wird dasselbe Spektrometer wie bei Versuch UV/Vis I verwendet. Fluoreszenz-Spektrometer Das Fluoreszenz-Spektrometer (Abb. G1) besteht aus einer Lichtquelle (meistens eine Hochdruck- Gasentladungslampe), einem Anregungsmonochromator, der Proben Küvette, einem Absorptionsmonochromator, einem Absorptionsempfänger, sowie einem Eimissionsmonochromator und einem Emissionsempfänger. Durch den Anregungsmonochromator kann die Probe mit monochromatischem Licht angeregt werden. Die Detektion des Fluoreszenz Lichtes erfolgt meist im 90 -Winkel zur Durchstrahlungsrichtung der Probe, so dass das Streulicht des eingestrahlten Lichtes so wenig als möglich mitgemessen wird. Abbildung G1: Schematischer Aufbau und Strahlengang des Fluoreszenz-Spetrometers. Auswertung Zu Beginn sollen die Messergebnisse der Absorptionsspektren betrachtet werden. Die Auswertung ist in diesem Fall vereinfacht, da mittels "Peak Processing" des Jasco Spectra Managers ein Spektrum mit markierten Absorptionsmaxima und zugehörigen λ max direkt ausgedruckt werden kann, wobei die Intensität gegen die Wellenlänge aufgetragen ist. Die ermittelten λ max können tabellarisch wie folgt anschaulich dargestellt werden: Tabelle A1: Absorption von Fluorescein. ph c [mg ml -1 ] λ max [nm] sauer A X neutral B Y alkalisch C Z

10 Zur Auswertung der Messergebnisse des zweiten Versuchteils werden zunächst die auf der Diskette abgespeicherten Daten im txt-format mithilfe von Excel in einer graphischen Form ausgewertet. Dabei wird die Intensität I [abs. units] gegen die Wellenlänge λ [nm] aufgetragen. Jeweils das Excitationsspektrum und das Emissionsspektrum vom selben ph-wert werden in ein Koordinatensystem gelegt. So kann die Lage und Form der Maxima zueinander besser analysiert werden. Zur übersichtlichen Darstellung der Messergebnisse und der ermittelten λ max kann eine tabellarische Darstellung der unten gezeigten Form nützlich sein. Dabei ist hervorzuheben, dass die Anregungswellenlängen für die Emissionsspektren den λ max -Werten aus dem Absorptionsspektrum entsprechen und die Anregungswellenlängen für die Excitationsspektren wiederum mit den λ max aus den Emissionsspektren übereinstimmen. Tabelle A2: Emission des Farbstoffes. ph c [mg ml -1 ] λ Excitation [nm] λ max [nm] sauer A X D neutral B Y E alkalisch C Z F Tabelle A3: Excitation des Farbstoffes. ph c [mg ml -1 ] λ Excitation [nm] λ max [nm] sauer A D K neutral B E L alkalisch C F M

11 Einfluss des ph-wertes auf das Absorptionsspektrum Bei Betrachtung der λ max -Werte kann festgestellt werden, dass die Absorptionsmaxima mit zunehmendem ph- Wert größer wurden. Dies kann durch folgenden Sachverhalt erklärt werden: Im alkalischen Bereich liegen die Carboxyl- und die Hydroxylgruppe des Farbstoffes Fluorescein deprotoniert vor. Das aus vier Benzylringen bestehende chromophore System wird durch die zusätzlichen n-molekülorbitale erweitert. Daraus resultiert eine Annäherung zwischen dem höchstbesetzten Molekülorbital (HOMO) und dem niedrigsten nicht besetzten Molekülorbital (LUMO). Somit sinkt auch die Energie des Photons, die zur Anregung eines Elektronenübergangs nötig ist. Als Konsequenz dessen verschiebt sich die Wellenlänge in einen höheren Bereich - es kommt zu einem bathochromen Shift. In saurer Lösung wird der doppelt gebundene Sauerstoff am 3'C-Atom protoniert und es kommt zur Ausbildung eines Lactonrings im Molekül. Die n-elektronen des Heteroatoms stehen somit dem chromophoren System nicht mehr zur Verfügung. In Folge dessen vergrößert sich der Übergang zwischen HOMO und LUMO. Die aufzubringende Energie, die zur Anregung benötigt wird, nimmt zu, wobei auch die Wellenlängen in einen niedrigeren Bereich verschoben werden - es kommt zu einem hypsochromen Shift. Das Absorptionsspektrum zeigt bei ph 7 zwei verschiedene Maxima. Dies wird durch den sogenannten isosbestischen Punkt verursacht. Fluorescein ist bei einem neutralen ph an einem binären, konzentrationsabhängigen Gleichgewicht beteiligt, dessen Gleichgewichtsformen eine unterschiedliche Absorption besitzen. Man erhält daher bei unterschiedlicher Lage des Gleichgewichts auch unterschiedliche Absorptionskurven für die Gesamtabsorption des Gemisches. Diese setzen sich additiv aus den Absorptionskurven der beiden Komponenten zusammen. Besitzen die beiden Bestandteile des Gleichgewichts bei einer bestimmten Wellenlänge auf ihrem sonst unterschiedlichen UV/Vis-Spektrum den gleichen Absorptionskoeffizienten, ist die Gesamtabsorption immer gleich, unabhängig davon in welchem Verhältnis die beiden Bestandteile zueinander vorliegen. Als isosbestischen Punkt bezeichnet man folglich den Punkt, an dem sich alle Absorptionskurven einer Gleichgewichtsmischung unabhängig von der Gleichgewichtslage schneiden. Besitzen nun die Gleichgewichtspartner bei mehreren Wellenlängen den gleichen Absorptionskoeffizienten, so lassen sich im Spektrum mehrere isosbestische Punkte beobachten. Das Emissionsspektrum Anhand der Messergebnisse lässt sich feststellen, dass λ max der Emission höher ist als bei der Absorption. Dies ist durch die Übergänge der Elektronenanregung zu erklären, die mehr Energie erfordern als später bei der Fluoreszenz in Form von Strahlungsenergie freigesetzt wird. Dieser Effekt wird auch Stokes-Shift genannt. Er beschreibt die Differenz der Wellenlängen zwischen ein- und ausgehenden Photonen und damit die Differenz zwischen den Lagen der Maxima im Absorptions- und Emissionsspektrum bei gleichem Elektronenübergang. Teile der absorbierten Energie gehen aufgrund von Relaxationen vom Schwingungszustand in den angeregten

12 Grundzustand verloren (siehe Jablonski-Term-Schema). Das Excitationsspektrum Am Excitationsspektrum lässt sich erkennen, dass die Anregungswellenlängen der sauren und der neutralen Verdünnung bei höheren Wellenlängen liegen als die Absorptionswellenlängen. Dieser Effekt kann ebenfalls durch den oben erwähnten Stokes-Shift erklärt werden. Bei der alkalischen Verdünnung sind im vorliegenden Fall Anregungswellenlänge und Absorptionswellenlänge ungefähr gleich. Anhand des Fluorescein-Farbstoffes in alkalischer Lösung lässt sich an dieser Stelle das Jablonski-Termschema anschaulich erklären: In unserem Fall findet bei einer Wellenlänge von 499 nm die Anregung statt, wodurch Elektronen aus dem Grundzustand in ein höheres Energieniveau versetzt werden. Nun fallen diese entweder sofort durch strahlungslose Deaktivierung wieder in den Grundzustand zurück, oder die werden durch Schwingungsrelaxation in den angeregten Grundzustand befördert um dann unter Emission einer Fluoreszenzstrahlung in den Grundzustand S 0 zurückzufallen. Aufgrund des Stokes-Shifts wird dabei hier eine Emissionswellenlänge von 518 nm gemessen. Das Peptidspektrum Absorption Emission Excitation Nicht gemessen x nm y nm Die gemessenen λ max -Werte des Emissions- und Excitationsspektrums des Peptids stimmen mit den λ max -Werten des reinen Farbstoffes in alkalischer Verdünnung überein. Dies liegt daran, dass auch das Peptid unter alkalischen Bedingungen analysiert wurde. Bedauerlicherweise kann über die Konzentration des Peptids in der alkalischen Verdünnung keine Aussage gemacht werden, da es bereits vor dem Versuch mit einer unbekannten

13 Menge Acetonitril verdünnt worden ist. Die Spektren der Emission und Excitation wurden unter alkalischen Bedingungen aufgenommen, da der Fluorescein-Farbstoff seine Optimalabsorption bei einem ph-wert von 9.0 zeigt. Fehlerquellen Fehlerhafte Reinigung der Küvetten Fehler beim Herstellen der Verdünnungsreihe Luftblasen in der Küvette Verschmutzungen auf der Küvette Fehler bei Messung der Absorption Temperatureinflüsse Einflüsse von Fehlstrahlung Pharmazeutische Relevanz Identitäts- und Reinheitsprüfung quantitative Analyse Strukturanalyse Klinisch-chemische Analyse z.b. NADH-Verfahren Pharmakokinetische Untersuchungen, z.b. Wechselwirkungen von Arzneistoffen mit Proteinen, da Bindung an dieses die Lage der Absoprtionsmaxima und die Größe des Absorptionskoeffizienten ändern kann Stabilitätsuntersuchung Verlauf von Reaktionsabläufen im Falle einer Änderung des chromophoren Systems