Bestimmung von Kohlenhydraten

Transkript

1 Bestimmung von Kohlenhydraten

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3 Ketosen Aldosen

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7 Reduzierende Zucker Reduzierende Zucker sind Zucker, die eine Aldehydgruppe haben (Aldosen) und daher als reduzierendes Agens agieren. Unter alkalischen Bedingungen verhalten sich Ketosen als schwach reduzierende Zucker, da sie zu Aldosen isomerisieren. H H C OH OH H C OH OH H C O C O C OH H C OH R R R

8 nicht reduzierend Vollacetal reduzierend Halbacetal

9 Bestimmung der Kohlenhydrate Bestimmung der Zusammensetzung von Lebensmitteln Überprüfung der Kennzeichnung (Authentizität) Kohlenhydrate sehr polare Verbindungen bis auf einige Ausnahmen (Polysaccharide) in Wasser löslich Analytik daher im wässerigen Medium

10 Methoden Phenol-Schwefelsäure-Methode (Gesamtkohlenhydrat-Gehalt) Methode nach Luff-Schoorl (Gesamtgehalt an reduzierenden Zuckern) Polarimetrie (chirale Verbindungen) Enzymatische Methoden Chromatographische Verfahren

11 Probenvorbereitung/1 In vielen Lebensmitteln sind Substanzen enthalten, die bei der Bestimmung von Kohlenhydraten stören Zucker in Lösung bringen und von anderen Komponenten abtrennen abhängig vom Lebensmittel und von dem/den Kohlenhydraten Bei den meisten Lebensmitteln ist erster Schritt trocknen (Vakuumofen). Danach wird das Material gemahlen. Extraktion von Fett

12 Soxhlet-Extraktion

13 Probenvorbereitung/2 Getrocknete, fettfreie Probe wird mit heißem 80% Ethanol in Gegenwart von Calciumcarbonat extrahiert, um alle Säuren zu neutralisieren. Proteine sind in heißem 80% Ethanol unlöslich.

14 Phenol-Schwefelsäure-Methode Prinzip Kohlenhydrate werden durch starke Säuren und/oder hohe Temperaturen zerstört. Ablauf einer Reihe von komplexen Reaktionen Furanderivate Kondensation der Produkte braune und schwarze Substanzen Kondensation auch mit verschiedenen phenolischen Komponenten, wie Phenol, Resorcinol, α-naphthol, und mit verschiedenen aromatischen Aminen gefärbte Verbindungen

15 Phenol-Schwefelsäure-Methode Durchführung Klare wässerige Lösung der Kohlenhydrate wird in ein Röhrchen pipettiert. Zugabe von wässeriger Phenol-Lösung, schütteln Zugabe von heißer konz. Schwefelsäure, schütteln gelb-orange gefärbte Substanzen gebildet. Messung der Extinktion bei 490 nm. Erstellung einer Kalibrierfunktion (optimal: Gemisch von Zuckern in ähnlichem Verhältnis wie in der Probe. Falls nicht möglich: D-Glucose)

16 Vorteile der Phenol-Schwefelsäure-Methode einfach rasch niedrige Nachweisgrenze hohe Genauigkeit (± 2%). spezifisch für Kohlenhydrate Die Reagenzien sind billig, gut verfügbar und stabil. Alle Klassen von Kohlenhydraten, einschließlich Zuckerderivate und Oligo- und Polysaccharide können bestimmt werden. (Oligo- und Polysaccharide reagieren, da sie eine Hydrolyse erleiden in Gegenwart der heißen, starken Säure, es entstehen Monosaccharide).

17 Methode nach Luff-Schoorl Bestimmung des Gesamtgehalts an reduzierenden Zuckern Prinzip Reduzierende Zucker reduzieren Schwermetall (meist Kupfer) in einer Salzlösung red. Zucker 2 Cu 2+ Cu 2 O Hitze 2 Cu I - 2 CuI 2 2 CuI + I 2 I S 2 O I - + S 4 O 6 2-

18 Methode nach Luff-Schoorl Durchführung Konzentration an reduzierenden Zuckern in der Probelösung sollte < 2 mg/ml liegen. 25,0 ml in Erlenmyerkolben pipettieren Zugabe der Cu(II)Lösung im Überschuss Am Rückflusskühler auf vorgeheizter Heizplatte innerhalb von 2 min zum Sieden erhitzen, 10 min Sieden Danach sofort mit kaltem Wasser abkühlen Nach dem Erkalten Zugabe von ~ 3 g KI und 25 ml 25% H 2 SO 4 Titration mit Natriumthiosulfat-Maßlösung (Stärke als Indikator)

19 Polarimetrie/1 Verbindungen mit einem chiralen Zentrum (asymmetrischen Kohlenstoffatom) haben die Fähigkeit, die Polarisationsebene von linear polarisiertem Licht zu drehen. Den Winkel, um den das Licht gedreht wird, wenn das Licht eine Lösung der optisch aktiven Substanz passiert, nennt man den optischen Drehwinkel α. Der Drehwinkel kann positiv oder negativ sein. Der Drehwinkel α ist abhängig von der Konzentration der Lösung c (g/ml) der Art des Lösungsmittels der Länge des Lichtpfads (Schichtdicke l (dm)) der Wellenlänge des polarisierten Lichts und der Temperatur.

20 Polarimetrie/2 Der spezifische Drehwinkel [ α] 20 D einer Substanz ist eine Stoffkonstante, die für folgende konstant gehaltene Parameter gilt: λ = 589,3 nm T = 20 C l = 1 dm c = 1 g/ml angegebenes Lösungsmittel, sonst dest. Wasser [ α] 20 D = α l.c Spezifischer Drehwert: Glucose: +52,7 (Mutarotation beachten) Fructose: -92,4 Saccharose: +66,5 Invertzucker: -20,5

21 Aufbau eines Polarimeters

22 Polarisator/Analysator

23 Vor- und Nachteile der Polarimetrie Vorteile schnell einfache Apparatur zerstörungsfrei Voraussetzungen keine anderen optisch aktiven Substanzen in der Probe Messlösung darf nicht getrübt bzw. stark gefärbt sein Messlösung muss relativ konzentriert sein Temperatur muss kontrolliert werden

24 Enzymatische Methoden Enzyme Biokatalysatoren unter physiologischen Bedingungen hohe Spezifität und Reaktivität verändern nicht die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion verändern die Geschwindigkeit der Reaktion werden bei der Reaktion nicht verbraucht

25 Enzymreaktion k 1 k 2 E + S ES E + P S...Substrat E... Enzym ES...Enzym-Substrat-Komplex P...Produkt

26 Michaelis-Menten-Gleichung V = V K.[ max + M S] [ S]

27 Enzymatische Methoden Enzymatische Analyse analytische Bestimmung von Substanzen mit Hilfe von Enzymen Substratkonzentration << K M Ermittlung der Enzymaktivität Substratkonzentration ~ V max Ermittlung der Enzymaktivität um adäquate Herstellung eines Lebensmittels zu bestimmen z.b. thermische Stabilität von Enzymen verwenden, um eine Hitzebehandlung nachzuweisen.

28 Wärmebehandlung von Milch Pasteurisieren Dauererhitzen (62-65 C, min) oder Kurzzeiterhitzen (72-75 C, s) Hocherhitzen (mind. 85 C, mind. 4 s) Ultrahocherhitzen ( C, 1 s) Enzymatische Unterscheidung der Wärmebehandlung Phosphatase-Test (Unterscheidung Rohmilch thermisch behandelte Milch) Peroxidase-Test (Prüfung auf Hocherhitzung)

29 Phosphatase-Test O O P O O Phosphatase OH + + H 2 O HO O P O O Br Br OH + Cl N O - HCl HO N O Br Br Br O N OH Br Indophenol-Farbstoff (blau)

30 Peroxidase-Test Nachweis der Hocherhitzung der Milch Lactoperoxidase katalysiert den Abbau von Wasserstoffperoxid. Der dabei freigesetzte atomare Sauerstoff oxydiert eine farblose 1,4-Phenylendiamin-Lösung zu violettem Indoamin. Bei Dauererhitzen oder Kurzzeiterhitzen: Phosphatase-Nachweis negativ Peroxidase-Nachweis positiv Bei Hocherhitzen: Phosphatase-Nachweis negativ Peroxidase-Nachweis negativ

31 Einheiten der Enzymaktivität Eine Einheit (unit, U) entspricht der Enzymmenge, die die Umsetzung von einem µmol Substrat pro min unter genau festgelegten Versuchsbedingungen katalysiert. Spezifische Aktivität: meist in units pro mg Gesamtprotein Molare Aktivität: units/mol Turnover number: Aktivität pro mol aktives Zentrum

32 Einflussgrößen auf die Enzymaktivität ph-wert und Puffersystem Temperatur Auswahl des Substrats Substratspezifität unterschiedlich stark ausgeprägt

33 Aufbau eines Testsystems Direkte Messung: Wenn die Umsetzung des Substrats oder eines an der Enzymreaktion beteiligten Coenzyme selbst zur Veränderung eines leicht messbaren Parameters führt Gekoppeltes Testsystem: Verwendung eines zweiten Enzyms (eventuell auch mehrere) Messreaktion E 1 S 1 P 1 Indikatorreaktion E 2 P 1 P 2

34 Enzymatische Bestimmung der Glucose/1 H 2 O 2 + o-dianisidin Peroxidase H 2 O + oxidierter Farbstoff (gelb)

35 Enzymatische Bestimmung der Glucose/2

36 Co-Enzym System NAD + /NADH

37 Enzymatische Bestimmung der Glucose/2

38 Bestimmung von Glucose, Fructose und Mannose HK...Hexokinase G6P-DH...Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase PGI...Phosphoglucose-Isomerase PMI...Phosphomannose-Isomerase

39 Vorteile von enzymatischen Methoden Hohe Spezifität (durch Wahl eines Enzyms oder durch Kombination mehrerer Enzyme) Nachweisgrenzen sind generell niedrig schnell und ohne großen Aufwand durchführbar Eine Reihe von Enzymkits kommerziell erhältlich

40 Chromatographische Verfahren Grundprinzip mobile Phase, m v stationäre Phase, s A

41 Chromatographischer Prozess Als Maß für die Verteilung einer Substanzen zwischen zwei Phasen dienen der Verteilungskoeffizient K i : K = i c c stat mob c stat c mob Konzentration der Substanz i in der stationären Phase Konzentration der Substanz i in der mobilen Phase und der Kapazitätsfaktor k i: k = i Q Q stat mob Q stat C mob Menge der Substanz i in der stationären Phase Menge der Substanz i in der mobilen Phase k i = qk i q Phasenverhältnis q = V V s m V s V m Volumen der stationären Phase Volumen der mobilen Phase

42 Signal Substanz 1 Substanz 2 Zeit Probenaufgabe (Mischung aus 2 Substanzen)

43 Ursachen der Peakverbreiterung

44 Einteilung chromatographischer Verfahren

45 Aufbau einer HPLC-Apparatur

46 Injektionsventil

47 Normalphasenchromatographie stationäre Phase: polar mobile Phase: unpolar Oberfläche des Kieselgels

48 Eluotrope Reihe

49 Umkehrphasenchromatographie (Reversed phase chromatography) stationäre Phase: unpolar mobile Phase: polar chemisch modifizierte stationäre Phasen

50 Chemisch modfizierte Kieselgele

51 Elution Signal Isokratische Elution Zeit Signal Gradientenelution Zeit

52 Elutionsmethoden

53 Chromatogramm Qualitative Informationsparameter: Retentionszeit t R, Kapazitätsfaktor k k t t Ri Ro = t Ro Totzeit t Ro Quantitative Informationsparameter: Peakhöhe, Peakfläche

54 HPLC zur Trennung von Kohlenhydraten gängigste stationäre Phasen: Aminophasen (χ-aminopropylgruppen kovalent an Oberfläche des Kieselgels gebunden) mobile Phase: ACN-Wasser-Mischungen (50-85% ACN) Aminofunktion liegt in protonierter Form vor: wirkt auch als schwach basischer Ionenaustauscher Problem: Säulen nur begrenzte Lebenszeit

55 Brechungsindexdetektor

56 Vor- und Nachteile des Brechungsindexdetektors Vorteile: universell Selektivität kann durch die Wahl der mobilen Phase verändert werden. über großen Konzentrationsbereich linear Nachteile: hohe Nachweisgrenzen Der Brechungsindex ist sehr empfindlich gegenüber Fluss-, Druck und Temperaturschwankungen. Größte Einschränkung: keine Gradientenelution möglich

57 Bestimmung von Stärke Nachweis mit Iod Stärke bildet mit Iod charakteristisch gefärbte Einschlussverbindungen. Mit Amylose blaue, mit Amylopektin rote Färbung Nachweisgrenze: 0,002 mg Stärke pro ml Lösung

58 Polarimetrische Bestimmung der Stärke Stärke weist eine außerordentlich hohe spezifische Drehung auf (je nach Art der Behandlung und Lösungsmittelzusammensetzung etwa +190 ). Prinzip der Methode: Die Stärke der Probe wird in heißer verdünnter Salzsäure gelöst. Strikte Einhaltung der vorgegebenen Parameter notwendig!

59 Enzymatische Bestimmung der Stärke Prinzip Umwandlung der gesamten Stärke in Glucose durch für Stärke spezifische Enzyme und Bestimmung der freigesetzten Glucose. Enzyme (Amylasen) müssen gereinigt werden, um andere enzymatische Aktivitäten zu entfernen, die auch Glucose freisetzen würden (Cellulase, Invertase oder Saccharase) und Katalase, die H 2 O 2 zerstören würde, auf dem die Glucosebestimmung ja basiert. Probleme bei Stärke mit hohem Amylosegehalt, modifizierter Stärke